DETERMINACIN DE BIOMASA

I.

INTRODUCCIN
La determinacin de la biomasa es una de las variables ms importantes en
un bioproceso, ya que su determinacin nos lleva a la comprensin de la
eficiencia del mismo. Se trata de una variable clara para establecer las tazas
de produccin, de consumo de nutrientes y el clculo de los balances dems
de
cualquier
proceso
biolgico.
Los mtodos clsicos de determinacin de biomasa son mtodos directos que
se basan en el nmero de clulas o en el peso celular. Los mtodos de
enumeracin celular, son mtodo de observacin, basados en propiedades
fsicas o en la actividad biolgica. Actualmente hay un gran inters en
mtodos alternativos de determinacin de la biomasa. Estos mtodos son
indirectos y estiman algn componente celular o alguna actividad metablica
especifica. No requieren el examen visual de los organismos ni su incubacin.

II.

OBJETIVOS
Objetivo General:
Determinar la concentracin de clulas por conteo en cmara Neubauer.
Expresndolas en unidades de clulas/mL.
Objetivo Especfico:
Reconocer la tcnica de contaje en Cmara Neubauer.
Comparar estadsticamente los valores de concentracin obtenidos; de
manera general y manera aleatoria, mediante los mtodos de variabilidad
y desviacin estndar.

III.

FUNDAMENTO TERICO
Biomasa es un trmino general que se refiere a los microorganismos
presentes en un sistema. A la vez tambin se puede referir como la
cantidad de clulas, de personas o masa de seres vivos. El objetivo de la
biomasa es la reproduccin de clulas.
La determinacin de biomasa es una de las variables ms importantes en
un bioproceso, ya que su determinacin nos lleva a la comprensin de la
eficiencia del mismo. Se trata de una variable clara para establecer las
tazas de produccin, de consumo de nutrientes y el clculo de los balances
dems de cualquier proceso biolgico. Una variedad de anlisis estn
disponibles para la determinacin de Biomasa de muestras biolgicas (en
nuestro caso de la levadura Saccharomyces cerevisae).
A. Mtodos directos de determinacin de biomasa: Se basan en el
nmero de clulas o en el peso celular, dentro de estos mtodos podemos
distinguir a los siguientes:
1. Mtodos gravimtricos (Peso Seco)

Jos Vctor Becerra Cotrina

Ecologa

La cantidad total de biomasa presente en una muestra puede medirse en

trminos de peso seco por unidad de volumen, ya sea como slidos en
suspensin totales (SST) o slidos en suspensin voltiles (SSV). Las
clulas se separan del lquido bien por centrifugacin bien por filtracin. Se
expresan en g.m.s/mL.

2. Mtodos espectrofotomtricos.
Se basan en la existencia de una relacin directa entre el nmero total de
microorganismos presentes en una muestra y su valor de turbidez. Tras la
determinacin de la turbidez de la suspensin celular mediante
espectrofotometra, el resultado se expresa en unidades de absorbancia.
3. Mtodos microscpicos de recuento celular en cmaras
El recuento de microorganismos se realiza en la cuadrcula central de la
cmara y se multiplica por la profundidad, obtenindose el nmero de
microorganismos por unidad de volumen (nmero de clulas/ml,
generalmente).
a. CMARA DE NEUBAUER. Es una cmara de contaje adaptada al
microscopio de campo claro o al de contraste de fases. Se trata de un
portaobjetos con una depresin en el centro, en el fondo de la cual se ha
marcado con la ayuda de un diamante una cuadrcula como la que se ve
en la imagen. Es un cuadrado de 3 x 3 mm, con una separacin entre dos
lneas consecutivas de 0.25 mm. As pues el rea sombreada y marcada L
corresponde a 1 milmetro cuadrado. La depresin central del cubreobjetos
est hundida 0.1 mm respecto a la superficie, de forma que cuando se
cubre con un cubreobjetos ste dista de la superficie marcada 0.1
milmetro, y el volumen comprendido entre la superficie L y el cubreobjetos
es de 0.1 milmetro cbico, es decir 0.1 microlitro.
Conteo en cmara de Neubauer, Esta cmara se utiliza para conteo celular.
Limpie la cmara y la laminilla de cuarzo suavemente con alcohol.
Revise la laminilla de cuarzo que no debe estar desbordada o quebrada.
Coloque la laminilla de cuarzo sobre la cmara en forma vertical, este debe
quedar centrada.
Proceda a llenar la cmara. Este paso es
muy importante y definitivo en la
distribucin
de
las
clulas.
Es
recomendable llenarla con micropipeta
pequea o con una jeringa ya que la
cmara se llena con una gota. El llenado
debe ser continuo en un solo intento.
La cmara no puede quedar seca esto se
detecta porque en las esquinas del
recuadro de llenado se ven porciones
secas. Tampoco se debe inundar, la
apariencia en la cmara es de lquido
abundante en las terminaciones del recuadro.
Jos Vctor Becerra Cotrina
Ecologa

Figura 1. Conteo por Cmara Neubauer. Representacin de la cuadricula

10 X.

IV.

MATERIALES Y MTODOS

B. Metodologa

Con una jeringa se tomar una cantidad de la solucin previamente

preparada la cual se encuentra en un tubo de ensayo en dilucin a la 10 -1
y se dejar caer unas gotas en la cmara de Neubauer.
Se colocar la laminilla cubreobjetos sobre la portaobjetos en la zona
central, para apreciar una zona cuadriculada.
Con la ayuda de una jeringa se obtendr una pequea muestra del tubo de
ensayo, y se colocar en el borde del cubreobjetos. Se dejar que la
solucin ingrese a la cmara por capilaridad, sin que pase a los canales
laterales.
Una vez que la muestra ingrese por la cmara de Neubauer, se dejar
reposar, y posteriormente, se colocar en el microscopio.

Jos Vctor Becerra Cotrina

Ecologa

Se realizar la cuantificacin de clulas en las zonas de los cuadrados ms

pequeos de 0.05 mm. tomando precauciones para evitar contar dos
veces la misma clula u omitir alguna. Se contarn las clulas que estn
dentro de los cuadrados las que se noten bien y las clulas que estn en el
lado superior y lado izquierdo de cada cuadrado de 4 x 4.
Luego de calcular las clulas en los cuadrados intermedios, extremos y los
determinados al azar, se deber calcular el nmero de clulas/ mL (por
cuadrado), y por medio de la siguiente frmula, se determin el nmero de
clulas por mililitro.
A la vez se deber calcular la desviacin estndar de las 25 celdas. Luego
tomaremos 5 celdas al azar de la cual deberemos calcular su variabilidad
(coeficiente) y su desviacin estndar para luego hacer una comparacin.

Jos Vctor Becerra Cotrina

Ecologa

V.

RESULTADOS Y DISCUSIONES

Tabla 1. Conteo de Clulas en Cmara Neubauer

1
mL

Tabla 2. Concentracin de las clulas en las 25 celdas, Desviacin

estndar y coeficiente de Variacin 0.004

Jos Vctor Becerra Cotrina

Ecologa

Agita el cultivo, usa una pipeta cuenta

gotas para transferir 1 mL de cultivo a
una probeta de 10 mL; agrega 9 mL de
agua de la llave y vaca en un tubo de
ensayo. Este procedimiento diluye el
cultivo por un factor de 10.
1:10,0
1:100,0
1:10
Observa la muestra diluida en el 1:1,0
00
00
00
microscopio, si todava hay demasiadas
0
clulas repite el proceso de dilucin tan
frecuente como sea necesario en tanto
multipliques el factor de dilucin por 10
PROCEDIMIENTO
cada vez.

Tabla 3. Al azar 5 Clulas de las 25 celdas de la Cmara Neubauer

V.

CONCLUSIONES

VI.

Se determin la biomasa expresada en clulas/ml en una solucin de

levadura.
Se aprendi el mtodo de recuento en la cmara de Neubauer.
Las rutas metablicas entre las levaduras son idnticas, sugiriendo la
conformacin de un grupo metablico idntico.

RECOMENDACIONES
El margen de error en los clculos debe ser mnimo.

Jos Vctor Becerra Cotrina

Ecologa