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Laboratorio de Microbiología
BIOL150
Guía N°2:
Morfología bacteriana: observación macroscópica y
microscópica
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Objetivos:
MARCO TEÓRICO
MORFOLOGÍA MICROSCÓPICA
Alcohol
1. Tinción de Gram:
La técnica de mayor importancia en el área de la microbiología, es la tinción de Gram,
pues divide a las bacterias en dos grandes grupos: Gram positivas y Gram negativas.
Además, permite diferenciar forma (cocos, bacilos) y la agrupación bacteriana (pares, cadenas,
racimos).
La tinción de Gram consiste en teñir un frotis de bacterias con cristal violeta y luego
tratarlas con una solución mordiente (fijadora) de Iodo y Ioduro, denominada Lugol. Todas las
bacterias se tiñen en estas condiciones. Sin embargo, sólo algunas son capaces de retener el
colorante al tratarlas con un agente decolorante como etanol o una solución decolorante de
etanol-acetona. Las bacterias que retienen el colorante son Gram positivas; las que se
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decoloran son las Gram negativas y para observarlas deberán teñirse con un colorante de
contraste (safranina). Por lo tanto, las bacterias Gram positivas se verán de color azul o
violeta y las bacterias Gram negativas de color rojo o rosado.
La diferencia en la reacción frente a la tinción de Gram se debe a que la composición
química de las estructuras externas de las bacterias es distinta. Las bacterias Gram positivas
tienen una capa gruesa de peptidoglicán o mureína, mientras que las Gram negativas
tienen menor cantidad de peptidoglicán y tienen una membrana externa (además de la
membrana citoplasmática). La explicación más aceptada es que, luego de la acción de la
solución decolorante, las bacterias Gram positivas son capaces de retener el colorante
gracias al peptidoglicán. En cambio, las Gram negativas, pierden parte de los lípidos de
su membrana externa por acción del decolorante (un solvente orgánico, como por ejemplo,
alcohol), lo que sumado a la menor cantidad de peptidoglicán, hace que se decoloren. Es
importante destacar que la etapa crítica en la tinción es la decoloración, por lo que se debe
tener especial cuidado en realizarla en forma adecuada.
La tinción de Gram:
1.- Revela la afinidad tintorial de las bacterias: - Gram positivas - Gram negativas
2.- Permite conocer la forma bacteriana: - Cocáceas – Bacilos - Cocobacilos – Vibrios -
Espirilos – Espiroquetas
3.- Permite conocer la disposición o agrupación bacteriana:
(pares)
(cuatro células)
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Gram negativas
Gram positivas
Fig 2. División de las células que origina distintas agrupaciones bacterianas a) División
en un plano, b) División en dos planos, c) División en 3 planos y d) División al azar.
2. Tinción de Cápsula:
Utiliza tinta china para evidenciar la presencia de la cápsula microbiana, pues tiñe de
color negro todo el frotis, salvo la cápsula (queda un espacio blanco, sin teñir). El resto del
microorganismo se tiñe de color rojo con el colorante de contraste (safranina). Se observa con
objetivo de inmersión (100x).
Ej. Tinción de cápsula (Enterobacter sp. y Streptococcus pneumoniae).
3. Tinción de esporas:
Utiliza el colorante verde de malaquita que tiñe esta forma de resistencia de algunas
bacterias. El resto de la bacteria se tiñe de color rojo con el colorante de contraste (safranina).
Se observa con objetivo de inmersión (100x).
Las esporas pueden ser terminales o subterminales o pueden encontrarse libres de la
célula bacteriana. Ej.Clostridium sp., Bacillus sp.
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Fundamento:
La fucsina, que es un colorante básico, forma un complejo con los ácidos micólicos de la
pared de las micobacterias. Este complejo es resistente a la decoloración con alcohol-ácido
(alcohol clorhídrico) permaneciendo de color fucsia las bacterias ácido alcohol resistentes
(AAR+), a diferencia de las otras bacterias (AAR-) que se decoloran. El azul de metileno se usa
como tinción de contraste.
Técnica:
1.- Se cubre el frotis con fucsina concentrada de Ziehl Neelsen.
2.- Se calienta el frotis hasta que emita vapores (2 a 3 minutos).
3.- Se decolora escurriendo alcohol-ácido.
4.- Se tiñe con azul de metileno, el colorante de contraste,
por 30 segundos.
5.- Dejar secar y leer con objetivo de inmersión (100x).
Utilidad clínica:
Permite identificar micobacterias presentes en una muestra.
En Chile, la presencia de bacilos ácido-alcohol resistentes en muestras diferentes es
altamente sugerente de tuberculosis.
La cantidad mínima de bacilos que es capaz de detectar (sensibilidad analítica) varía
entre 5.000 a 10.000 bacilos / ml de muestra.
La tinción de Ziehl Neelsen se debe solicitar en toda muestra clínica cuando se sospecha
tuberculosis, ya que es un examen rápido, sencillo y de bajo costo que además de confirmar un
diagnóstico, permite conocer los casos infecciosos.
ACTIVIDADES
Primera sesión
2. Preparación frotis:
a. Colocar con el asa una gota de agua en el centro de la lámina (aprox. 0,5 cm de
diámetro).
b. Flamear el asa para su esterilización.
c. Enfriar el asa en un sector del agar donde no exista crecimiento bacteriano.
d. Tomar una colonia con el asa desde la placa.
e. Mezclar la muestra con la gota de agua.
f. Fijar el frotis exponiéndolo a la llama del mechero hasta que se seque, recuerde
que no debe tener la muestra sobre la llama del mechero por mucho tiempo.
3. Tinción de Gram
a. Verificar, con el dorso de la mano, que el vidrio no esté demasiado caliente.
b. Cubrir el frotis completamente con cristal violeta y dejar en reposo por 1 min.
c. Dejar escurrir el cristal violeta y agregar sobre la muestra una solución de lugol.
d. Dejar con lugol por 1 min.
e. Lavar el lugol con alcohol-acetona por 15-20 seg. (es importante no sobrepasar
este tiempo ya que la decoloración excesiva puede alterar los resultados de la
tinción). Lavar con agua dejando escurrir suavemente, hasta eliminar el exceso de
cristal violeta.
f. Cubrir con colorante de contraste, Safranina al 1%, por 1 min.
g. Lavar con agua, dejar escurrir y secar suavemente con papel absorbente.
h. Observar en el microscopio óptico con inmersión.
Utilizar el microscopio, anotar y fotografiar lo que observe.
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Segunda sesión
1. Observación macroscópica:
De las siembras realizadas en la sesión práctica anterior, realizar análisis macroscópico
de cada bacteria. Seleccione la placa en la que haya obtenido colonias aisladas. Analice
las diferencias de crecimiento observadas en medio corriente, selectivo y/o diferencial.
2. Tinción de Cápsula:
a. Limpie una lámina portaobjeto con alcohol y seque cuidadosamente con papel
absorbente.
b. En una esquina de la lámina portaobjeto coloque una gota de tinta china del tamaño
de una arveja.
c. Esterilice el asa y tome parte del cultivo de la bacteria Klebsiella spp.
d. Mezcle la tinta china con la bacteria, esterilice el asa y repita 3 o 4 veces (sólo
agregar la bacteria). La tinta china impide ver si la solución tiene o no suficiente
bacteria, por lo mismo es necesario mezclar con suficiente cultivo.
e. No ensucie su cultivo bacteriano con tinta china, asegúrese de esterilizar el asa
previamente y de enfriarla.
f. Realice un frotis extendiendo la suspensión de manera que quede una capa
delgada. Esto se realiza tomando un cubreobjeto y, esparciendo la mezcla a lo largo
del portaobjeto que contiene la mezcla tinta china-bacteria. Ver Figura.
g. Fije suavemente en el mechero.
h. Durante 2 min. cubra completamente con colorante de contraste, fucsina.
i. Lave con agua cuidando que ésta no caiga directamente sobre su muestra, seque
con papel absorbente y observe con inmersión.
3. Tinción de esporas
a. Limpie una lámina portaobjeto con alcohol y seque cuidadosamente con papel
absorbente.
b. Ponga una gota de agua del tamaño de una arveja en el portaobjetos.
c. Tome una muestra de Bacillus spp. con el asa, mezcle con la gota de agua y fije en
el mechero hasta que se seque completamente (sin hervir).
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