LABORATORIO DE CIENCIAS DE LA VIDA PERIODO 61

INFORME DE LABORATORIO DE INMUNOLOGÍA

PRÁCTICA N° 1

TEMA DE LA PRÁCTICA DE LABORATORIO: DETERMINACIÓN DE

CITOQUINAS MEDIANTE RT-QPCR

APELLIDOS Y NOMBRES: LADY MENDOZA, STEFANIE CISNEROS

DOCENTE: VIVIANA CHILUISA

GRUPO DE LABORATORIO: 5

PARALELO: 1

NIVEL: 7MO

FECHA DE REALIZACIÓN DE LA PRÁCTICA: 28/10/2022

FECHA DE ENTREGA DEL INFORME: 3/11/2022

1. OBJETIVOS
a) OBJETIVO GENERAL :
● Determinar la concentración de citocinas en muestras problema
mediante RT - qPCR.
b) OBJETIVOS ESPECÍFICOS
● Utilizar la metodología y el procedimiento de la técnica RT- qPCR.
● Evaluar cómo se expresan las citocinas a nivel genetico en muestras problema.

2. MARCO TEÓRICO

La respuesta inmune del organismo, el sistema de defensa que evita en gran medida que
siempre estemos enfermos, se puede dividir en dos tipos de respuesta. Primero
encontramos la respuesta inmune innata, que es la que tenemos desde nuestro nacimiento,
y después tenemos la respuesta inmune adaptativa, la cual vamos adquiriendo a lo largo de
nuestra vida en nuestros enfrentamientos a distintos patógenos (Rodriguez, 2017)

Inmunidad mediada por células

A la hora de hablar de la respuesta inmune adaptativa, hablamos de la activación de

linfocitos T y B, que se producen a través de un contacto físico y una señal química (las
citoquinas). Esta maduración o activación va a implicar:
● Una proliferación de las células progenitoras en estadíos tempranos del desarrollo de
las mismas.
● Un reordenamiento secuencial y ordenado de los genes del receptor (receptores TCR
y BCR) para el antígeno determinado.
● Una inducción de la autotolerancia (Rodriguez,2017)

Las citocinas o citoquinas son proteínas o glicoproteínas solubles de señalización producidas

por varios tipos de células en el cuerpo, especialmente por células del sistema inmune como
los leucocitos: neutrófilos, monocitos, macrófagos y linfocitos (células B y células T). Estas
tienen como función ser mensajeros químicos entre las células, pero no como efectores
moleculares ya que son necesaria para activar o inhibir la función de efectores
específicos,además estas proteínas actúan en la defensa del cuerpo, lo que se resume
como “la regulación del sistema inmune”, y otro factor importante es que participan en el
control del desarrollo hematopoyético, en los procesos de comunicación intercelulares y en
las respuestas del organismo contra agentes infecciosos y estímulos inflamatorios
(Puig,2019).

Caracterización de las principales citocinas

● Interleucina: Es un polipéptido que actúa principalmente intracelularmente y no se

encuentra en la circulación general excepto en casos de enfermedad grave. Los
macrófagos activados son la principal fuente fisiológica de IL-1, citocina que destaca
por su capacidad proinflamatoria
● Factores de necrosis tumoral:El TNF se produce fundamentalmente por monocitos,
macrófagos y linfocitos. Ejerce un efecto antitumoral a través de un doble mecanismo
que incluye la inhibición de la angiogénesis, que produce la necrosis hemorrágica del
tumor, y el aumento de la respuesta inmunitaria antitumoral, acción en la que actúa
sinérgicamente con el IFN.
● Interferón: Los interferones son un amplio grupo de proteínas caracterizadas por tener
 una potente acción antiviral y antineoplásica, así como por su efecto regulador de las
células del sistema inmunitario.
● Quimocinas:Son un conjunto de proteínas de muy bajo peso molecular que tienen
como función principal la quimiotáctica, y son producidas por una amplia variedad de
células en respuesta a estímulos irritantes y a una serie de mediadores como la IL-1, el
TNF o el IFN (Fiella et al,2002).

RT-PCR (Reacción en cadena de la polimerasa de transcripción inversa):

Es una de las técnicas más sensibles utilizadas para la detección de ARNm. El ARN
es la plantilla adecuada para recopilar información sobre la expresión génica de un
tejido normal o la expresión génica de un tejido infectado. La plantilla para la RT-PCR
puede ser ARN total o ARN viral o bacteriano respectivamente. El ARN se transcribe
a la inversa en ADN complementario (ADNc) por la enzima, la transcriptasa inversa.
La temperatura óptima de la transcriptasa inversa es de 46 ° C. El cDNA se utiliza en
la PCR para obtener el producto (CNIB,2017).

3. RECURSOS UTILIZADOS
Todos los materiales antes de usarlos deben estar correctamente desinfectados.
1. MATERIALES:
● Vaso de precipitación 250M
● Caja de capilares de 20 ul
● Micropipetas (0,5-10; 10-100;100-1000)
● Carrusel para micropipetas
● Caja de puntas con filtro estéril para micropipetas de 10 µL, 100 µL, 1000 µL.
● Tubos eppendorf de 1,5 mL (estériles)
● Tubos eppendorf de 200 µL (estériles)
● Guantes de nitrilo

REACTIVOS:

● Buffer RT-PCR 12.5 ul

● Enzima 2ul
● PF 1.25 ul
● PR 1.25 ul
● RNA 2 ul
● H2O pura 6 ul

EQUIPOS:

● Termociclador Pro Flex Thermoscientific

● Incubadora
● PCR en Tiempo Real
● Cámara de Flujo

2. PROCEDIMIENTO:
3. RESULTADOS

Mediante la técnica RT-qPCR de tiempo real resultó útil para poder determinar la
manifestación de citocinas en las muestras de tejidos de Ratón, debido a que es una
técnica rápida y confiable.
En la práctica no alcanzamos a evaluar cómo se estaban expresando las citocinas en
las muestras problemas de tejido del ratón. En otro estudios se obtuvo resultados
favorables que luego secuenciaron ,presentando afinidad con las secuencias de
ARNm que codifican citoquinas en ovino
publicadas en las bases de datos, del 99%,y en la evaluación la técnica permitió
evaluar la expresión de ARNm de las citoquinas en estudio
(Matamoros&Camacho,2009).
 4. CUESTIONARIO

1.-¿Identifique qué variación de PCR se utiliza para detectar SARS-CoV-2 y por qué?

La PCR que se usa para detectar el Coronavirus es la RT-PCR( transcripción inversa), se

utiliza esta técnica debido a que el SARS-CoV-2 es un virus que contiene únicamente ARN
como material genético, y lo que se logra con esta técnica es transcribir el ARN del virus en
ADN, y una vez que se obtiene este ADN transcrito se puede amplificar y copiarse, para así
confirmar la presencia del virus SARS-CoV-2.

2.-- Qué tipo de citocinas se producen en una fase aguda de infección, explique cómo
funcionan?

Durante esta fase se da activación en cascada de citoquinas; actúan una gran variedad de
citocinas como : IL-1 beta, IL-6 y TNF alfa son responsables de regular las respuestas
tempranas y amplifican las reacciones inflamatorias, la activación de las células T o la lisis
de las células inmunitarias resulta en la liberación de IFN-gamma o TNF-alfa lo cual provoca
la activación de macrófagos, células dendríticas y células endoteliales luego estas células
liberan continuamente citocinas pro inflamatoria,los macrófagos y las células endoteliales
producen altas cantidades de interleucina 6 (IL-6), lo que activa las células T y otras células
inmunitarias y crea un circuito de retroalimentación positiva que conduce a una tormenta de
citocinas que desencadena la liberación de múltiples citocinas y también induce la regulación
de proteínas durante la fase aguda(Gómez,2021).

3.- Explique qué pasaría si se tiene una cantidad deficiente de citocinas en el organismo.

La presencia de citocinas en el cuerpo se dan como parte de la respuesta inmune

inflamatoria, ayudando a combatir virus como el SARS-CoV-2, cuando existe presencia
elevada de citocinas puede provocar daños graves en pacientes como por ejemplo daño
pulmonar, lo que indicaría que hay un descontrol, entonces el organismo necesita una
cantidad apropiada de citocinas para que el sistema inmune trabaje correctamente y no se
produzcan extensos daños(Pedroso,2021)

4.-- ¿Qué significa tormenta de citocinas?

La Tormenta de citocinas se la puede definir como un fenómeno de alta producción

inmediata de citocinas que van a atacar o afectar en gran magnitud al sistema inmune
causando un estado de hiperinflamación (Pedroso,2021).
5. BIBLIOGRAFÍA
○ Rodriguez.2017. La respuesta inmune adaptativa.Infobiologia. Recuperado

de: https://www.infobiologia.net/2017/11/respuesta-inmune-adaptativa.html

○ Parada Puig. (2019). Citocinas: características, tipos, funciones, ejemplos.

Lifeder. Recuperado de https://www.lifeder.com/citocinas/.

○ Fiella et al.2002.Estructura y función de las citocinas.Recuperado de

:https://www.elsevier.es/es-revista-medicina-integral-63-articulo-estructura-fun

cion-citocinas-13026682

○ CNIB.2017.reacción en cadena de la polimerasa (PCR).Recuperado de:

https://es.sawakinome.com/articles/science/difference-between-pcr-and-rt-pcr.

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○ Miranda-Pedroso R. Tormenta de citoquinas en la infección por SARS-CoV-2

(COVID-19). Revista Cubana de Medicina Intensiva y Emergencias [revista

en Internet]. 2021 [citado 3 Nov 2022]; 20 (3) Disponible en:

http://www.revmie.sld.cu/index.php/mie/article/view/830

○ Sanz JM, Gómez Lahoz AM, Martín RO. Papel del sistema inmune en la

infección por el SARS-CoV-2: inmunopatología de la COVID-19 [Role of the

immune system in SARS-CoV-2 infection: immunopathology of COVID-19].

Medicine (Madr). 2021 May;13(33):1917-1931. Spanish. doi:

10.1016/j.med.2021.05.005. Epub 2021 May 27. PMID: 34075268; PMCID:

PMC8158328.

○ Sánchez Matamoros A. Sánchez-vizcaíno Rodríguez J. M. . y Pérez de Diego

Camacho A. C. . (2009). Detecciónes de la expresión de citoquinas mediante

RT-PCR en tiempo real en ganado ovino . Revista Complutense de Ciencias

Veterinarias, 3(2), 129-138.

https://revistas.ucm.es/index.php/RCCV/article/view/RCCV0909220129A