UNIVERSIDAD DE LAS FUERZAS ARMADAS - ESPE

CARRERA DE INGENIERÍA EN BIOTECNOLOGÍA

MICROBIOLOGÍA APLICADA

Integrantes:

Gavilánez Sebastián, Guillén Vanessa, Solís Nathalia, Tonato Jessica, Torres Diana

NRC: 9307

Fecha de entrega: 22/12/2022

Nombre del Docente: Andrés Izquierdo, Ph.D.

INFORME Nº 03

1. TÍTULO

Streptococcus: Aislamiento e Identificación.

2. RESUMEN

La causa más común de los dolores de garganta son los virus. Sin embargo, las
infecciones de garganta por estreptococos son infecciones tanto de la garganta
como de las amígdalas, causadas por unas bacterias llamadas Streptococcus del
grupo A (estreptococos del grupo A). Se aisló e identificó especies de
Streptococcus en diferentes muestras mediante la siembra en distintos medios
de cultivo, además se efectúo la prueba de hidrólisis de hipurato de sodio en la
que se determinó la capacidad que tienen los estreptococos del grupo B, de
hidrolizar enzimáticamente el hipurato sódico. La práctica constó de tres periodos
en las que se comenzó tomando la muestra con la cabeza del individuo inclinada
hacia atrás y la lengua presionada con el bajalenguas; frote la parte posterior de
la faringe hacia arriba y hacia abajo con el hisopo estéril. Usaron reactivos como
Agar sangre, tubos de TSB (uno para cada tipo de colonia), microscopio de
disección, kit de tinción gram, caldo de hipurato de sodio, disco diferencial de
bacitracina, disco de sensibilidad SXT, cultivo de S. aureus en caldo,
dispensador o fórceps para transferir discos, placas de agar sangre (hasta 4
incógnitos), 6,5% de caldo de cloruro sódico, TSB, BE (bilis esculina) en tubos
inclinados, disco optoquina (taxo P). En los resultados, el medio de cultivo, TSB,
permitió reconocer la presencia de neumococos ya que estos son solubles en la
bilis. El resultado fue positivo para la muestra de Sebas ya que se observó que
existió turbidez en el medio a comparación con las otras dos muestras que no
presentan turbidez en el medio. Así mismo, NaCl permitió diferenciar
 enterococos de estreptococos y en la prueba de hidrólisis de hipurato de sodio
debió crecer estreptococos beta-hemolíticos, sin embargo, en este ensayo no
existió dicho crecimiento por lo tanto no existió el cambio de color.

3. INTRODUCCIÓN

3.1. ANTECEDENTES

Streptococcus pyogenes (estreptococo del grupo A) es uno de los patógenos

bacterianos más importantes en humanos. Este organismo ubicuo es la causa
bacteriana más común de faringitis aguda y también causa una variedad de
infecciones cutáneas y sistémicas. Ocupa un lugar único en la microbiología médica
porque la infección puede dar lugar a dos secuelas no supurativas, la fiebre
reumática aguda y la glomerulonefritis postestreptocócica aguda. La primera
enfermedad es una causa clásica de sufrimiento, invalidez y mortalidad en todas
partes del mundo. Históricamente, su descubrimiento se remonta a 1874 cuando
Billroth lo describió en erisipelas e infecciones de heridas (Neeman, 2017).

En 1879 Pasteur lo aisló de la sangre de un paciente con sepsis puerperal. La

primera vez que se menciona S. pyogenes fue en 1884 (Rosenbach) y hasta 1903
(Schötmüller) no hubo clasificaciones de estreptococos basadas en la producción de
hemólisis. Finalmente, en 1933, Lancefield los agrupa en la categoría A de su
clasificación (Rice, 2006).

Figura 1. Theodor Billroth (1829-1894). Tomado de https://dicciomed.usal.es

3.2. JUSTIFICACIÓN

El estreptococo es un tipo de bacteria. Hay muchos tipos. Dos de estos causan la

mayoría de las infecciones por estreptococos en humanos: el grupo A y el grupo B.

Los estreptococos del grupo A (GAS, por sus siglas en inglés) son bacterias que a
menudo se encuentran en la garganta y la piel. La mayoría de las infecciones por
GAS causan una enfermedad relativamente leve, como faringitis estreptocócica e
impétigo. Sin embargo, estas bacterias también pueden causar enfermedades más
graves y potencialmente mortales, como la fascitis necrosante (a menudo llamada
"bacteria carnívora") y el síndrome de shock tóxico estreptocócico (STSS). Además,
las personas pueden portar estreptococos del grupo A en la garganta y la piel sin
mostrar ningún síntoma de la enfermedad (Health, 2018).

Figura 2. Estreptococo A. Tomado de https://as.com/

El estreptococo del grupo B es una bacteria que se encuentra comúnmente en los

intestinos o en el tracto genital inferior. Las bacterias suelen ser inofensivas en
adultos sanos. Sin embargo, en los recién nacidos puede causar una enfermedad
grave conocida como enfermedad inflamatoria del grupo B. También puede causar
infecciones peligrosas en adultos con ciertas afecciones crónicas, como diabetes o
enfermedad hepática. Los adultos mayores también tienen un mayor riesgo de
enfermedad por estreptococos del grupo B (Clinic, 2017).

Algunos signos y síntomas son:

· Fiebre

· Temperatura corporal baja

· Dificultad para alimentarse

· Pereza, flacidez o tono muscular débil

· Dificultad para respirar

· Irritabilidad

· Nerviosismo
 · Convulsiones

· Erupción

· Ictericia

Figur
a 3. Estreptococo B. Tomado de https://www.isglobal.org/

4. OBJETIVOS

4.1. OBJETIVO GENERAL

Aislar e identificar especies de Streptococcus en diferentes muestras

mediante el aislamiento y siembra en distintos medios de cultivo.

4.2. OBJETIVOS ESPECÍFICOS

● Efectuar la prueba de hidrólisis de hipurato de sodio para determinar la

capacidad que tienen los estreptococos del grupo B, de hidrolizar
enzimáticamente el hipurato sódico.

● Diferenciar los estreptococos clínicamente importantes.

● Realizar todos los pasos de manera ordenada de la tinción Gram para

poder observar de manera clara en el microscopio.

5. HIPÓTESIS

Las muestras tomadas de la faringe de “Nathy” presentan estreptococos en los

distintos medios de cultivo, a diferencia de las muestras de “Jessy” y de “Sebas”
en las que no existe presencia.

6. MARCO TEÓRICO
 Los estreptococos son bacterias Gram positivas, anaerobias facultativas,
inmóviles, con forma esférica o de coco, algunas especies tienen cápsula y
son catalasa-negativa que pertenecen a la familia Streptococcaceae. Con
frecuencia se presentan en pares o cadenas, especialmente en fluidos y
mucosas de boca, nariz , vagina, también están en otras zonas del cuerpo
como colon, recto y piel y . Muchos miembros del género de los
Streptococcus son patógenos tanto para seres humanos como para animales.
Está demostrado o se sospecha que algunas especies son zoonóticas.

La identificación de los estreptococos está basada, en parte, en sus

reacciones hemolíticas en agar sangre. Existen tres tipos de hemólisis: beta,
alfa y gamma. Hemólisis alfa: es una hemólisis parcial y la zona de
crecimiento aparece rodeada de un halo de color verdoso. Hemólisis beta: en
este caso la hemólisis es total y el halo que rodea a las colonias es totalmente
transparente. Hemólisis gamma (no hemólisis): el microorganismo en cuestión
no es capaz de realizar la hemólisis y por tanto no existe halo alrededor de la
colonia.. En muchos casos, el valor de distinguir entre alfa y gamma hemólisis
es limitado; muchas especies se pueden describir sencillamente como "beta
no hemolíticas". La hemólisis no es completamente confiable para identificar
las especies.

Para la identificación de este tipo de bacterias se usa diferentes medios de

cultivos para ver su crecimiento como el tsb Tryptic Soy Broth (TSB) es un
medio nutritivo que favorece el crecimiento de una amplia variedad de
microorganismos, en especial las bacterias anaerobias facultativas y aerobias
comunes, el uso de la hidrólisis del hipurato. Demuestra la capacidad de
algunas bacterias para hidrolizar el hipurato de sodio ácido benzoico y glicina
por la acción de la enzima hipuricasa. Como indicador de la reacción se utiliza
ninhidrina. Esta prueba se utiliza en la identificación de Campylobacter jejuni,
Listeria monocytogenes, Gardnerella vaginalis y Streptococcus agalactiae

El uso del medio agar bilis esculina ( BEA) es un medio selectivo y diferencial
que se usa para aislar e identificar un gran número de miembros del género
Enterococcus y también Streptococcus del grupo D

Por último el uso del agar sal es un medio recomendado para evaluar la
tolerancia al NaCl y diferenciar Enterococcus del Grupo D de otros
Streptococcus

Para poder observar la resistencia de estas bacterias se usan antibióticos

como sulfametoxazol y bacitracina.

7. MATERIALES Y MÉTODOS
Primer periodo

En la primera fase empezamos con la toma de muestra proveniente de la garganta

de un sujeto, con ayuda de un hisopo esteril y un bajalenguas tomamos la muestra,
posteriormente inoculamos colocando con el hisopo puntos de la muestra sobre una
un cultivo petri, luego con un asa esteril realizamos una siembra por extensión e
incubamos a 37ºC 24 horas.

Segundo periodo

En esta fase lo más importante es la identificación de tipos de colonias que sienten

con hemólisis alfa y beta, a partir de estas con un asa esteril tomamos las muestras
e inoculamos medio TSB respectivamente rotulando si son colonias alpha y colonias
beta finalmente incubamos a 37ºC 24 horas.

Tercer periodo

Debido a que el medio TSB es un medio que permite la libre proliferación de

estafilococos, tenemos más biomasa para inocular más medios de cultivos. así
podemos realizar una tinción gram con sus respectivos reactivos

Para colonias tipo beta se debe inocular una placa de agar sangre y un tubo de
hipurato de potasio, en la placa de agar sangre esta debe ser inoculada con dos
muestras una muestra de s aureus y la muestra hemolítica beta la cual debe con
una estría que conecte con la muestra de s aureus luego se deben colocar discos
de sulfametoxazol y bacitracina dentro de los extremos de las estrías

Para colonias tipo alfa se debe inocular tubos con 6.5% de medio de cloruro de
sodio, TSB, BE, y en una placa de agar sangre por siembra por extensión se debe
colocar un disco de optochin todas exceptuando la placa de agar sangre se deben
incubar a 37ºC,el medio agar sangre se debe incluir bajo condiciones anaerobias

8. RESULTADOS
 Figura 4. Resultados en hipurato de sodio con muestras de la faringe de
Sebas, Jessy y Nathy.

En la prueba de hidrólisis de hipurato de sodio se determinó la capacidad que tienen

los estreptococos del grupo B, de hidrolizar enzimáticamente el hipurato sódico. En
este medio debió crecer estreptococos beta-hemolíticos, sin embargo, en este
ensayo no existió dicho crecimiento por lo tanto no existe el cambio de color, es
decir dio un resultado negativo a estreptococos beta-hemolíticos y el organismo que
debió crecer en caso de ser positivo es S. agalactiae.

Figura 5. Resultados en NaCl con muestras de la faringe de Sebas,

Jessy y Nathy.

Este medio de cultivo NaCl permitió diferenciar enterococos de estreptococos. En

caso de existir turbidez en el medio significa la presencia de microorganismos, en
este caso, no se presentó dicha característica por lo que únicamente los
enterococos crecieron en el medio de cultivo de NaCl, mientras que los
estreptococos no enterococos del grupo D no crecieron en el medio.

Figura 6. Resultados en TSB con muestras de la faringe de Sebas, Jessy

y Nathy.

Este medio de cultivo, TSB, permitió reconocer la presencia de neumococos ya que

estos son solubles en la bilis. El resultado fue positivo para la muestra de Sebas ya
que se observó que existió turbidez en el medio a comparación con las otras dos
muestras que no presentan turbidez en el medio.

Figura 7. Resultados en BE con muestras de la faringe de Sebas, Jessy

y Nathy.

Este medio de cultivo BE (bilis esculina) permitió identificar la presencia de todos los
estreptococos del grupo D. Como se observó en la muestra de Sebas existió un
resultado positivo debido a que claramente existió un cambio de color a un tono
mucho más oscuro que las demás muestras, por lo tanto, existió la presencia de
estreptococos del grupo D de manera abundante, sin embargo, en la muestra de
Jessy y Nathy también dio un resultado positivo pero el color no fue tan oscuro.

Figura 8. Resultados en agar sangre con muestras de la faringe de

Sebas, Jessy y Nathy.

Este medio de cultivo Agar sangre permite determinar el tipo de bacterias

hemolíticas presentes en las muestras de faringe y en una mezcla desconocida. Con
la técnica de puntada se aisló colonias de Streptococcus de cada una de las
muestras, el cual después de incubar se puede notar mayor presencia de colonias
en la muestra de “Sebas”, seguida la de “Jessy” y por último la muestra de “Nathy”.
 Figura 9. Resultados de microscopia con tinción Gram a 100x en TSB de
muestras de la faringe de Sebas, Jessy y Nathy.

Por medio de microscopia óptica en un lente objetivo de 100x de la muestra con

tinción Gram del medio TSB – medio líquido se logró identificar en la mayoría de
muestras la presencia de estreptococos con una ovalada y algunas de ellas están
agrupadas formando una cadena de dos o de más. Sin embargo, la mayor presencia
de estas bacterias predomina en la muestra de “Sebas”, sobre todo una
predominancia de cadenas más largas.
 Figura 10. Resultados de microscopia con tinción Gram a 100x en agar
sangre de muestras de la faringe de Sebas, Jessy y Nathy.

Por medio de microscopía óptica en un lente objetivo de 100x de la muestra con

tinción Gram del medio Agar sangre – medio sólido se logró observar bacterias
Gram positivas, en forma de cocos, bacilos y una predominancia de forma de
estreptococos de cadena dos o de más. También algunas colonias de estas
bacterias en la muestra de “Sebas”, al igual que en las anteriores, eta muestra
contiene una mayor cantidad de bacterias en comparación con las otras dos
muestras.
 Figura 11. Resultados de agar sangre de muestras de la faringe de
Sebas, Jessy y Nathy.

Este medio de cultivo selectivo Agar sangre se hizo una selección de colonias
determinadas y bien aisladas para hacer subcultivos, para la prueba de sensibilidad
SXT resultó positivo únicamente para la muestra correspondiente a “Sebas”.
Mientras que para la prueba de susceptibilidad a la optoquina resultó negativa para
todas las muestras. Por último la reacción de CAMP resultó negativa únicamente
para la muestra de “Sebas”, ya que en las demás muestras no se mostró dicha
reacción.
 Figura 12. Resultados de agar Estreptococos de muestras de la faringe
de Sebas, Jessy y Nathy.

Este medio Agar Streptococcus permitió identificar a los organismos como

pertenecientes al Grupo D no enterococos, por lo tanto, se trata de la especie S.
bovises, caracterizado por ser no hemolíticas o alfa-hemolíticas y tener cadenas
cortas. Con respecto a las pruebas se espera que la prueba de esculina biliar sea
positiva y la prueba de caldo de sal sea negativa.

9. DISCUSIÓN

Dentro de los resultados obtenidos se evidencio que todas las bacterias

tenían una hemólisis alfa además la hipótesis de que la muestra de naty
pudiese tener más bacterias que las otras dos muestras debido a que no tenia
ningun infección bacteriana si no que su malestar provenía de su previo
contagio de covid, pero igualmente tiene una cantidad considerable de
bacterias que pueden ser patógenas atacando a sus vías respiratorias
momentáneamente más débiles. Respecto a la muestra de sebas se conoce
que es fumador, por tanto se podría plantear una nueva hipótesis donde el es
quien tiene mayor cantidad de bacterias debido a su constante irritación a las
vías respiratorias producto del tabaco.
10. CONCLUSIONES

La identificación de los Streptococcus por métodos convencionales es difícil. Las

cepas clínicas, en muchos casos, no se identifican por especie sino que se hace por
su determinación antigénica mediante la clasificación serológica de Lancefield o por
su capacidad hemolítica o capacidad de formar halos de lisis en los medios de
cultivo de agar sangre.

En este experimento se aislaron diferentes muestras faríngeas identificando

estreptococos del Grupo D (no enterococos) para las tres personas. Estos
resultados se obtuvo mediante pruebas de hemólisis, susceptibilidad a la
bacitracina, reacción CAMP, hidrólisis hipurato, sensibilidad SXT, hidrólisis de
esculina biliar, tolerancia a 6.5% NaCl, susceptibilidad a la optoquina y solubilidad
biliar mismas que permiten la identificación del microorganismo desconocido.

Uno de los principales patógenos que causan infecciones respiratorias e invasivas

es el Streptococcus pneumoniae, por lo que es importante identificar rápidamente
este microorganismo y determinar la susceptibilidad a los antibióticos
frecuentemente utilizados, para la realización de terapias adecuadas.

11. BIBLIOGRAFÍA

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