UNIVERSIDAD DE LAS FUERZAS ARMADAS –ESPE

DEPARTAMENTO DE CIENCIAS DE LA VIDA Y LA AGRICULTURA

INGENIERÍA EN BIOTECNOLOGÍA
NOMBRES: Pavel Enríquez, Ronny Góngora, Stefany Olmedo
NRC: 3545
ASIGNATURA: Microbiología II
FECHA: 05 de diciembre de 2019
NOMBRE DOCENTE: Andrés Izquierdo, PhD.
LABORATORIO N° 3
1. TÍTULO: Aislamiento e identificación de Streptococcus.
2. RESUMEN:
El aislamiento e identificación de estreptococos radica en su importancia clínica debida a
su patogenicidad, pues causan múltiples infecciones cotidianas y de impacto médico. Para
este laboratorio se tomó muestras de la faringe y se sembró en agar sangre preparado
previamente, se identificó el tipo de hemólisis alfa y beta, se aisló en medio TSB, se observó
estreptococos mediante tinción Gram y luego se realizó un antibiograma usando el antibiótico
optoquina en bacterias estreptocócicas que generaron hemólisis del tipo alfa y se aplicó
CAMP Test para aquellas que generaron hemólisis beta.
Por otra parte también se realizó pruebas bioquímicas utilizando hipurato de sodio,
prueba de hidrólisis del agar bilis esculina que resultó positivo y prueba de tolerancia a sal
usando un medio con NaCl al 6.5% que también resultó positivo. Como resultado del proceso
de aislamiento de bacterias presentes en la faringe humana se identificó principalmente
estreptococos del grupo B, D y viridanos.
Palabras clave: hemólisis, faringe, antibiograma, tinción Gram, agar sangre.
3. INTRODUCCIÓN:

Antecedentes. –

Las enfermedades estreptocócicas se conocen desde hace muchos siglos, aunque su

estudio inició en el siglo XVIII específicamente, en 1874 el cirujano austríaco Theodor
Billroth realizó la descripción de la primera infección causada por estreptococos, sin embargo
este conocimiento se complementó en 1879 cuando Louis Pasteur aisló el microorganismo de
úteros y sangre de mujeres con fiebre puerperal para demostrar que el estreptococo, era el
agente etiológico responsable de dicha enfermedad, misma que causaba las tasas de
mortalidad más elevadas de mujeres y recién nacidos en aquella época [ CITATION Jos16 \l
12298 ].

El uso del medio de cultivo agar sangre para el estudio de estreptococos fue propuesto por
Hugo Schottmuller en 1903, lo que se convirtió en un importante aporte para la microbiología
y básicamente para los métodos de diferenciación de este microorganismo, debido a que en
este medio se produce dos tipos de hemólisis. Años más tarde en 1919 Brown expuso tres
clases de patrones hemolíticos que rodean una colonia en una placa de agar sangre, estas
fueron "Alfa", "Beta" y "Gamma" [ CITATION Jvo15 \l 12298 ].

Justificación. –

Muchas bacterias estreptocócicas son responsables de enfermedades cotidianas que

afectan a la población humana y animal, sin embargo también forman parte de su microbiota
normal [CITATION Mar061 \l 12298 ]. Estreptococos del grupo A pueden ocasionar
enfermedades que generan altos índices de mortalidad, es el caso de Streptococcus pyogenes
que provoca la fiebre reumática, mastitis, endocarditis, otitis, glomerulonefritis, septicemia,
entre otras [ CITATION MDT19 \l 12298 ].

Por otra parte el problema de resistencia antibiótica ha dado alta relevancia al estudio
microbiológico, bacteriológico y epidemiológico de estreptococos [ CITATION Gra19 \l 12298 ] ,
pues constituye una amenaza a la salud pública; es de gran importancia el aislamiento e
identificación mediante la aplicación de técnicas microbiológicas que permitan el desarrollo
clínico para combatir bacterias patógenas pertenecientes al grupo de estreptococos.
4. OBJETIVOS
OBJETIVO GENERAL: Aislar e identificar Streptococcus a partir de muestras, de faringe,
en medios selectivos y diferenciales
OBJETIVOS ESPECÍFICOS:
 Recolectar y sembrar en TSB y Agar Sangre a partir de una muestra de faringe para
determinar el tipo de hemolisis.
 Identificar la sensibilidad a optoquina en alfa hemolisis y a bacitracina en beta
hemolisis.
 Comprobar la presencia de Streptococcus mediante una tinción Gram.
 Diferenciar especies de Streptococcus mediante distintas pruebas bioquímicas.
5. HIPÓTESIS
En la faringe se pueden encontrar estreptococos beta y alfa hemolíticos.
6. MARCO TEÓRICO
Los estreptococos son bacterias Gram positivas, en algunos casos anaerobios facultativos
y en otros anaerobios estrictos, carecen de movimiento, tienen forma de cocos cuyo diámetro
oscila entre 0.5 y 1 µm, estos se encuentran agrupados en cadenas o en pares, son tolerantes a
los ácidos y presentan una reacción catalasa negativa [ CITATION Kai19 \l 12298 ]. Se
encuentran en diversas fuentes naturales incluyendo el ser humano y animales,
principalmente en superficies mucosas de la boca, tracto intestinal, fosas nasales y faringe
[ CITATION Jvo15 \l 12298 ].
El medio enriquecido agar sangre es adecuado para el crecimiento de estreptococos
además de que permite clasificarlos tomando en cuenta el tipo de hemólisis, es decir de
acuerdo a la lisis de los glóbulos rojos en el agar que rodea a las colonias bacterianas
[ CITATION Kai19 \l 12298 ]. También se los puede agrupar según la morfología de la colonia,
las reacciones bioquímicas y mediante pruebas serológicas. Según el tipo de hemólisis se
clasifican en tres grupos que son: alfa, beta y gamma [ CITATION MDT19 \l 12298 ], aunque
Kaiser (2019) propone otro grupo que corresponde a la hemólisis de doble zona, la cual se
refiere a la presencia de hemólisis alfa y beta alrededor de la colonia.
 La hemolisis beta se manifiesta como una zona libre de glóbulos rojos alrededor de la
colonia bacteriana, resultado de la lisis producida por enzimas hemolisinas de la bacteria, las
cuales tienden a ser inactivadas por el oxígeno por lo que al sembrar estreptococos en agar
sangre se debe perforar el agar; la hemólisis alfa se observa como una zona de hemólisis
parcial y verdosa que rodea la colonia bacteriana, en este caso también se usa el perforado de
agar y finalmente la hemólisis gamma que se refiere a la ausencia de hemólisis o también
decoloración del agar [ CITATION Kai19 \l 12298 ].
Los estreptococos componen parte de la microbiota normal de animales y humanos, sin
embargo puede ser patógena dependiendo de algunos factores de virulencia como: la proteína
M y ácido lipoteicoico, cápsula de ácido hialurónico responsable de inhibir la fagocitosis,
toxina pirogénica causante de escarlatina y finalmente estreptoquinasa [CITATION Mar061 \l
12298 ]. Los estreptococos se pueden clasificar de acuerdo a los 19 grupos serológicos de
Lancefield, que se fundamenta en los antígenos de carbohidratos presentes en la pared celular
de la bacteria; los grupos se identifican con letras desde A hasta H, desde K hasta M y desde
O hasta V, aquellos que atacan al ser humano causando infecciones son los grupos A, B, C,
D, F y G [ CITATION Kai19 \l 12298 ].
 Estreptococos del Grupo A o GAS : este tipo de bacteria produce infecciones
autoinmunes, fiebre reumática y glomerulonefritis aguda, un ejemplo es S. pyogenes
que presenta hemólisis beta y causa faringitis.
 Estreptococos del Grupo B o GBS: también conocidos como S. agalactiae, son cocos
de 0.6 a 1.2 µm agrupados en cadenas cortas, se encuentran en el tracto
gastrointestinal y genitourinario de mujeres sanas. Algunas infecciones producidas
por este grupo son: osteomielitis, endocarditis, infecciones urinarias y dérmicas.
 Estreptococos del Grupo C: contiene a S. zooepidemicus, S. equi y S. equimidis,
producen beta hemólisis, causan infecciones principalmente en animales, como
faringitis, endocarditis, meningitis, neumonía y celulitis.
 Estreptococos del Grupo F: contiene a S. anginosus responsable de causar
endocarditis, abscesos en el cerebro, boca y mandíbula.
 Estreptococos del Grupo G: se caracterizan por producir hemólisis beta y ser
causantes de faringitis, endocarditis, bacteriemia y peritonitis.
Para identificar los grupos de estreptococos se aplican test específicos basados en
antibiogramas y reacciones bioquímicas. Los estreptococos del grupo A de Lancefield
presentan sensibilidad a la bacitracina por lo que se usa este antibiótico para su identificación
[ CITATION Gra19 \l 12298 ] ; el CAMP Test es otra prueba que permite identificar
estreptococos del grupo B de Lancefield principalmennte S. agalactiae, este tipo de bacterias
producen una proteína hemolítica extracelular denominada CAMP que se difunde con y que
actúa en sinergia con la beta-lisina de Staphylococcus aureus para causar una mayor lisis de
los glóbulos rojos. Los estreptococos del grupo B están sembrados perpendicularmente a una
línea de S. aureus en agar sangre, por lo que una reacción positiva se observa como una zona
de punta de flecha de hemólisis en el cerca del lugar en donde las dos líneas se aproximan
[ CITATION Sag19 \l 12298 ].
 Figura 1. Interpretación de resultados de CAMP Test
Fuente: [ CITATION Sag19 \l 12298 ]

7. MATERIALES Y MÉTODOS
La práctica contó con cuatro fases. En la primera, se recolectó muestra frotando un hisopo
estéril en la superficie posterior de la faringe; se repitió el mismo proceso con otro sujeto de
prueba. Las muestras obtenidas se inocularon en medio agar sangre realizando un estriado y
las placas se incubaron a 37 °C. En la segunda fase, se determinó el tipo de hemólisis y las
colonias aisladas fueron subcultivadas en medio TBS e incubadas.
Para la tercera fase, se usaron las muestras inoculadas en TSB para realizar una tinción
gram. Luego, con las muestras de hemólisis tipo Beta y un cultivo de S. aureus se inoculó una
placa de agar sangre con un disco de bacitricina y otro de SXT; también en un tubo de
hipurato de sodio con el cual se realizó una prueba de precipitación usando el cultivo en
hipurato de sodio con cloruro férrico. Con las muestras de hemólisis tipo alfa se inoculó una
placa de agar sangre con un disco de optocina, y además en tubos con medio TSB, bilis
esculina y con NaCl al 6.5% y se incubó cada uno.

8. RESULTADOS
A. Tabulación de aislados de la faringe
Tabla 1: Resultados de estreptococos aislados de la faringe

Grupo Hemólisis Tamaño de colonias Nombre del

(mm) microorganismo
1 Alfa 1 Streptococcus Grupo D

1 Beta 2 Streptococcus Grupo D

2 Alfa 1 Streptococcus Grupo D

2 Beta 1,5 Streptococcus Grupo B

3 Alfa 1 Streptococcus Grupo D

3 Beta 1,5 Streptococcus Grupo D

4 Alfa 1 Streptococcus Grupo D

 4 Beta 1,5 Streptococcus Grupo D

5 Alfa 1,5 Streptococcus Grupo D

5 Beta 1 Streptococcus Grupo B

6 Alfa 1 Viridans

6 Beta 1,5 Streptococcus Grupo C

B. Microscopia
Tabla 2: Observación de estreptococos en el microscopio (100X)

Streptococcus Grupo D

Streptococcus Grupo B
Figura 2. Tinción Gram Hemólisis Alfa 100x Figura 3. Tinción Gram Hemólisis Beta
con aceite de inmersión. Foto por Ronny 100x con aceite de inmersión. Foto por
Góngora Ronny Góngora

C. Porcentajes
Tabla 3: Porcentaje de estreptococos aislados de la faringe

S. pyogenes: 0% Grupo C estreptococos: 8.33%

S. agalactiae: 16.67% Grupo D enterococos: 66.67%
S. pneumoniae: 0% Grupo D no-enterococos: 0%
 Viridians estreptococos: 8,33%

D. Resultado de Pruebas

Tabla 4: Resultados de pruebas de identificación de estreptococos aislados de la faringe.

NaCl
Muestr Hipurat Optoquin Posible
Hemólisis Bacitracina CAMP SXT BE 6,5%
a o a microorganismo
Streptococcus
Grupo 1 α N N N N ++ ++ R Grupo D
(enterococci)
Streptococcus
Grupo 1 β - - - R N N N Grupo D
(enterococci)
Streptococcus
Grupo 2 α N N N N + ++ R Grupo D
(enterococci)
Grupo 2 β - + - S N N N S. agalactiae
Streptococcus
Grupo D
Grupo 3 α N N N N +++ ++ R
(enterococci)

Streptococcus
Grupo 3 β - - - R N N N Grupo D
(enterococci)
Streptococcus
Grupo 4 α N N N R ++ ++ R Grupo D
(enterococci)
Streptococcus
Grupo 4 β - - - R N N N Grupo D
(enterococci)
Streptococcus
Grupo 5 α N N N N + + R Grupo D
(enterococci)
Grupo 5 β - - + R N N N S. agalactiae

Grupo 6 α N N N N - - - Viridans
Streptococcus
Grupo 6 β - - - S N N N
Grupo C
α: hemólisis alfa, β: hemólisis beta
N: no significativo, R: resistente, S: sensible
+: reacción mínima, ++: reacción parcial,+++: reacción absoluta
Inoculación tipo beta hemolítico.
Tabla 5: Resultados de pruebas realizadas en inoculación beta hemolítica.

Figura 4. Inoculado para las pruebas CAMP,

bacitracina y SXT

Figura 5. Inoculado del aislado en hipurato de

sodio.

Figura 6. No se produce reacción de hidrólisis,

ausencia de precipitado.
Inoculación tipo alfa hemolítico.
Tabla 6: Resultados de pruebas realizadas en inoculación alfa hemolítica.

Figura 7. Inoculado del aislado en agar

sangre con un disco de Optochin.

Figura 8. Hidrolisis del agar bilis esculina,

prueba positiva.

Figura 9. Tolerancia a la sal. Inoculado del

aislado en caldo NaCl al 6.5%, prueba
positiva.
9. DISCUSIÓN
En su estudio, los autores Rahman, Islam, Islam, & Hossain (2015) obtuvieron que todas
las cepas con las que trabajaron, mostraron una reacción de tinción de Gram positiva, al
realizar pruebas bioquímicas todas las cepas fueron catalasas negativas. Sin embargo,
exhibieron un patrón de hemólisis diferencial en agar sangre y un patrón de reacción
distintivo para la esculina biliar, la resistencia a la bacitracina, la hidrólisis de arginina y las
pruebas de hidrólisis de esculina. Adems, aislaron e identificaron varias cepas bacterianas
orales que pertenecían a las especies Streptococcus (S. pyogenes, S. mutans, S. oralis, S.
pyogenes) y Enterococcus (E. faecalis) con diferentes patrones de resistencia a los
antibióticos.
Los autores Rader et al. (2013) describieron que las cepas de bacterias Gram-positivas,
Enterococcus faecalis y E. faecium, comunes en el intestino grueso humano y que se
encuentran esporádicamente en la boca sana, se encontraron con frecuencia en las cavidades
orales de los grupos de población analizados, y en pacientes investigados anteriormente con
trastornos del sistema masticatorio. El análisis cualitativo comparativo reveló diferencias
significativas en la prevalencia de cepas bacterianas detectadas en las cavidades orales de
grupos particulares de pacientes. Las bacterias fecales E. faecalis y E. faecium fueron las más
frecuentemente aisladas de las cavidades orales de todos los grupos de pacientes.
Los autores Ba-Saddik et al. (2014), utilizaron como sistema de estudio muestras
obtenidas de niños diagnosticados con faringoamigdalitis estreptocócica beta-hemolítico del
grupo A en 287/691 (41.5%; IC 95% 37.8-45.3) niños. Aislaron estreptococos beta-
hemolíticos del Grupo B, Grupo C y Grupo G del 4,3% de los niños. El RADT tenía una
sensibilidad de 238/258 (92.2%) y una especificidad de 404/423 (95.5%) contra el cultivo de
GAS. Una puntuación de McIsaac de ≥4 tenía una sensibilidad del 93% y una especificidad
del 82% para la infección por GAS confirmada.
En la práctica realizada se presumió la presencia de estreptococos de grupo B, D y
viridanos, respecto a los resultados, en otro estudio, se aislaron estreptococos beta
hemolíticos del 2,43% (45/1849) de niños sanos y del 8,36% (31/371) de niños sintomáticos.
Del mismo modo, la prevalencia de GAS (Group A Streptococcus) fue del 1,41% (26/1849)
entre los portadores y del 7,55% (28/371) entre los casos. En total, el 2.70% (29/1074) niños
varones y el 2.18% (25/1146) niñas tuvieron cultivos de hisopos de garganta positivos para
GAS. Se aisló un total de 76 estreptococos hemolíticos beta de la población de estudio. En el
grupo asintomático, de 45 aislamientos de estreptococos hemolíticos beta, 26 eran
estreptococos del grupo A, nueve eran del grupo C, siete eran del grupo G, dos eran del grupo
D y uno de los estreptococos del grupo F. En el grupo sintomático, entre los 31 aislados de
estreptococos hemolíticos beta, había 28 estreptococos del grupo A y 3 del grupo G (Chauhan
et al., 2016).
En una muestra del grupo 5 de laboratorio se presumió la presencia de S. agalactiae
respecto a los parámetros de la guía. En el trabajo de los autores Van Der Mee-Marquet et al.
(2008) se evaluó el transporte de Streptococcus agalactiae mediante el muestreo de cuatro
sitios del cuerpo en un grupo de 249 individuos sanos, incluidos ambos sexos y una amplia
gama de edades; Los objetivos fueron estudiar la estructura de la población de las cepas
colonizadoras mediante la tipificación de secuencias multilocus (MLST) y evaluar su
diversidad mediante serotipos, análisis de macrorestricción SmaI y detección por PCR de
marcadores genéticos de clones altamente virulentos para neonatos. Las prevalencias de
transporte fueron del 27% en mujeres y del 32% en hombres. El principal sitio positivo del
cuerpo fue el tracto genital (23% en mujeres y 21% en hombres); la piel, la garganta y los
márgenes anales también fueron positivos en 2%, 4% y 14%, respectivamente. Estas cepas
colonizadoras humanas pertenecían principalmente a los serotipos III (24%), Ia (21%), V
(18%) e Ib (17%).
En otro trabajo se reportó el potencial patogénico de un aislado de S. agalactiae aislado
humano obtenido de la orofaringe de una paciente asintomática que sufre varios episodios de
faringitis recurrente y esto se ha observado cada vez más en diferentes investigaciones (de
Aguiar et al., 2016).

10. CONCLUSIONES
Se recolectaron y sembraron muestras bacterianas provenientes de la faringe en un medio
de crecimiento rápido enriquecidos, medios selectivos y diferenciales.
Se aislaron estreptococos mediante la inoculación de colonias en cajas de Agar sangre.
Con la evaluación se las características que presentaron las colonias sembradas en estos
medios, se identificó la presencia de estreptococos debido a la presencia de alfa y beta
hemólisis en todos los grupos del laboratorio.
Con las pruebas y ensayos realizados durante todos los estadíos se presumió la presencia
de estreptococos del grupo B, D y viridanos. Respecto a la bibliografía, distintos estudios de
índole bioquímica y molecular soportan la potencial presencia de S. agalactiae, S. viridans,
Streptococcus del grupo A y Enterococcus en la faringe humana.

11. BIBLIOGRAFÍA
Aryal, S. (2019). CAMP Test- Principle, Uses, Procedure and Result Interpretation.
Microbiology Info.
Ferretti, J. (2016). History of Streptococcal Research. Streptococcus pyogenes : Basic
Biology to Clinical Manifestations .
Hill, G. (2019). Discovery raises hopes of preventing streptococci infections. University of
Dundee.
Jevitz, M. (2014). Streptococcus. Microbiología médica.
Kaiser, G. (07 de Septiembre de 2019). Lab 14: Isolation and Identification of Streptococci.
Obtenido de bio.libretexts.org:
https://bio.libretexts.org/Bookshelves/Ancillary_Materials/Laboratory_Experiments/
Microbiology_Labs/Microbiology_Labs_II/Lab_14%3A_Isolation_and_Identification
_of_Streptococci
Siegrist, J. (2015). Streptococci- Overview of Detection, Identification, Differentiation and
Cultivation Techniques. MERCK.
Trend, M. (2019). Preventing streptococci infections. Science News.

Ba-Saddik, I. A., Munibari, A. A., Alhilali, A. M., Ismail, S. M., Murshed, F. M., Coulter, J.
B. S., … Parry, C. M. (2014). Prevalence of Group A beta-haemolytic Streptococcus
isolated from children with acute pharyngotonsillitis in Aden, Yemen. Tropical
 Medicine and International Health, 19(4), 431–439. https://doi.org/10.1111/tmi.12264
Chauhan, S., Kashyap, N., Kanga, A., Thakur, K., Sood, A., & Chandel, L. (2016). Genetic
diversity among group a streptococcus isolated from throats of healthy and symptomatic
children. Journal of Tropical Pediatrics, 62(2), 152–157.
https://doi.org/10.1093/tropej/fmv092
de Aguiar, E. L., Mariano, D. C. B., Viana, M. V. C., Benevides, L. de J., de Souza Rocha,
F., de Castro Oliveira, L., … Azevedo, V. (2016). Complete genome sequence of
Streptococcus agalactiae strain GBS85147 serotype of type Ia isolated from human
oropharynx. Standards in Genomic Sciences, 11(1), 39. https://doi.org/10.1186/s40793-
016-0158-6
Rader, J., Russell, M. R., Hart, L. S., Nakazawa, M. S., Belcastro, L. T., Martinez, D., …
Maris, J. M. (2013). Dual CDK4/CDK6 Inhibition Induces Cell-Cycle Arrest and
Senescence in Neuroblastoma. Clinical Cancer Research, 19(22), 6173–6182.
https://doi.org/10.1158/1078-0432.CCR-13-1675
Rahman, M., Islam, M. N., Islam, M. N., & Hossain, M. S. (2015). Isolation and
identification of oral bacteria and characterization for bacteriocin production and
antimicrobial sensitivity. Dhaka University Journal of Pharmaceutical Sciences, 14(1),
103–109. https://doi.org/10.3329/dujps.v14i1.23742
Van Der Mee-Marquet, N., Fourny, L., Arnault, L., Domelier, A. S., Salloum, M., Lartigue,
M. F., & Quentin, R. (2008). Molecular characterization of human-colonizing Streptococcus
agalactiae strains isolated from throat, skin, anal margin, and genital body sites. Journal of
Clinical Microbiology, 46(9), 2906–2911. https://doi.org/10.1128/JCM.00421-08