Práctica: Purificación parcial de lizosima de clara de huevo

Alumno: Pérez Peñafiel Ximena

Gurpo: 5QV2 Sección: 3

Maestra: QBP: Cinthya Martínez Reyes

Tabla 1. Actividad de la lizosima en las fracciones obtenidas
A450 A450
Fracción ΔA450/min ΔA450/min/ml
Tiempo 0 Tiempo 2 min
1 0.527 0.145 0.191 0.064
2 0.671 0.658 0.007 0.002
3 1.112 1.081 0.016 0.005
4 0.602 0.408 0.097 0.032

Ejemplo. Cálculos de ΔA450/min (EJEMPLO SEGUNDA FRACCIÓN)

Datos: Desarrollo:
A450 T 0 min: 0.671
A450 T 2min: 0.658 0.671 − 0.658
= 0.007
2
Formula:
ΔA450 𝑇0 − ΔA450 T2
2 𝑚𝑖𝑛

Ejemplo. Cálculos de ΔA450/min/ml (EJEMPLO SEGUNDA FRACCIÓN)

Datos: Desarrollo:
A450/min: 0.007
0.007
= 0.002
Formula: 3
ΔA450/min
3 𝑚𝑙

Tabla 2. Curva de calibración de albúmina por el método de Bradford. Micro ensayo

Cantidad de proteína A595

Tubo No.
(μg)
Serie A Serie B
1, 1’ 2 0.133 0.151
2, 2’ 4 0.185 0.159
3, 3’ 6 0.186 0.198
4, 4’ 8 0.204 0.19
5, 5’ 10 0.3 0.31
Ejemplo. Cálculos de la cantidad de proteína (µg) (EJEMPLO TUBO 3)
Datos: Desarrollo:
Solución de proteína: 20 µg/ml
Solución de proteína tubo 3: 300 µl (20µ𝑔)(100µ𝑙)
𝐶𝑎𝑛𝑡𝑖𝑑𝑎𝑑 𝑑𝑒 𝑝𝑟𝑜𝑡𝑒í𝑛𝑎: = 3 µ𝑔
300 µ𝑙
Formula:
(Solución de proteína)(100 µl)
𝑆𝑜𝑙𝑢𝑐𝑖ó𝑛 𝑑𝑒 𝑝𝑟𝑜𝑡𝑒í𝑛𝑎 𝑒𝑛 𝑡𝑢𝑏𝑜 3

Gráfica 1. Curva de calibración de albúmina por el método de Bradford. Micro ensayo

Curva de calibación de albúmina. Método de Bradford

0.35

0.3

0.25
Absorbancia ₅₉₅

0.2

0.15
y = 0.0176x + 0.0963
0.1 R² = 0.7901

0.05

0
0 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11
Cantida de proteína (µg)

Tabla 3. Cantidad de proteína en las mezclas de reacción (serie A y serie B)

Fracción A C B C ∑ 𝐶 (𝑠𝑒𝑟𝑖𝑒 𝐴 + 𝑠𝑒𝑟𝑖𝑒 𝐵)

F1 0.677 32.994 0.701 34.358 33.676
F2 0.393 16.858 0.412 17.938 17.398
F3 0.257 9.131 0.147 2.881 6.006
F4 0.147 2.881 0.171 4.244 3.563
Ejemplo. Cálculos de la concentración (µg) de las fracciones (EJEMPLO F2 SERIE A)
Datos: Desarrollo:
A450= 0.393
0.393 − 0.0963
𝑥= = 16.858 µ𝑔/𝑚𝑙
Formula: (Ecuación de la recta) 0.0176

y = 0.0176x + 0.0963

Tabla 4. Determinación del grado de purificación de la lizosima

Fracción Purificación de
A/min/ml C (mg/ml) Actividad específica Lisozima (veces)
F1 0.064 0.034 1.900 1.000
F2 0.002 0.017 0.115 0.060
F3 0.005 0.006 0.833 0.438
F4 0.032 0.004 8.981 4.726

Ejemplo. Cálculos de la actividad específica (FRACCIÓN 4)

Datos: Desarrollo:
A450/min/ml= 0.032
Cantidad de proteína (mg/ml)= 0.004 0.032
𝐴𝑐𝑡𝑖𝑣𝑖𝑑𝑎𝑑 𝑒𝑠𝑝𝑒𝑐í𝑓𝑖𝑐𝑎 = = 8.981
0.004
Formula:
Actividad enzimática
𝐴𝑐𝑡𝑖𝑣𝑖𝑑𝑎𝑑 𝑒𝑠𝑝𝑒𝑐í𝑓𝑖𝑐𝑎 =
mg de proteína

Ejemplo. Cálculos de la purificación de lisozima (FRACCIÓN 2)

Datos: Desarrollo:
Actividad específica F1: 1.900
Actividad específica F2: 0.115 0.115
𝑃𝑢𝑟𝑖𝑓𝑖𝑐𝑎𝑐𝑖ó𝑛 𝑑𝑒 𝑙𝑖𝑠𝑜𝑧𝑖𝑚𝑎 = = 0.060
1.900

Formula:
Actividad e. F#
𝑃𝑢𝑟𝑖𝑓𝑖𝑐𝑎𝑐𝑖ó𝑛 𝑑𝑒 𝐿𝑖𝑠𝑜𝑧𝑖𝑚𝑎 =
𝐴𝑐𝑡𝑖𝑣𝑖𝑑𝑎𝑑 𝑒. 𝐹1
Cálculos: Porcentaje de retención del intercambiador
Datos: Desarrollo:
Actividad específica F1: 1.900
Actividad específica F2: 0.115 (1.9 − 0.115)
%𝑅. 𝑑𝑒𝑙 𝑖𝑛𝑡𝑒𝑟𝑐𝑎𝑚𝑏𝑖𝑎𝑑𝑜𝑟 =
1.9 ∗ 100

%𝑅. 𝑑𝑒𝑙 𝑖𝑛𝑡𝑒𝑟𝑐𝑎𝑚𝑏𝑖𝑎𝑑𝑜𝑟 = 0.009 %

Formula:
(𝐴𝑐𝑡𝑖𝑣𝑖𝑑𝑎𝑑 𝐹1 − 𝐴𝑐𝑡𝑖𝑣𝑖𝑑𝑎𝑑 𝐹2)
% 𝑅 𝑑𝑒𝑙 𝑖𝑛𝑡𝑒𝑟𝑐𝑎𝑚𝑏𝑖𝑎𝑑𝑜𝑟 =
𝐴𝑐𝑡𝑖𝑣𝑖𝑑𝑎𝑑 1 𝑥 100

Cálculos: Porcentaje de retención del intercambiador

Datos: Desarrollo:
Actividad específica F1: 1.900
Actividad específica F4: 8.981 8.981
% 𝑅𝑒𝑐𝑢𝑝𝑒𝑟𝑎𝑐𝑖ó𝑛 = ∗ 100 = 472.68%
1.900

Formula:
Actividad F4
% 𝑟𝑒𝑐𝑢𝑝𝑒𝑟𝑎𝑐𝑖ó𝑛 𝑑𝑒 𝑙𝑎 𝑙𝑖𝑠𝑜𝑧𝑖𝑚𝑎 = ∗ 100
𝐴𝑐𝑡𝑖𝑣𝑖𝑑𝑎𝑑 𝐹1

Preguntas extra:
1. Mencione las funciones atribuidas a la lisozima
• Bactericida
• Preservación de alimentos y fármacos
• Se usa como enzima modelo en investigaciones
• Funciones de protección al degradar microorganismos invasores
• Funciones digestivas

2. Describa el mecanismo de acción de la lisozima

• Hidroliza los enlaces glucosídicos β-1,4 que se forman entre el ácido N-
acetilmurámico y la N-acetilglucosamina presentes en la pared celular de
peptidoglucano

3. Usos de la lisozima
• En el área de investigación la lisozima funge como modelo enzimático a nivel
químico, estructural y funcional. Se utiliza para diversos estudios respecto a
la pared celular de bacterias.
4. Otros métodos de purificación de la lisozima
• Filtración
• Cromatografía por intercambio iónico
• Precipitación

5. Haga un diagrama del proceso de purificación parcial de la lisozima