Instituto Politécnico Nacional

Escuela Nacional de Ciencias Biológicas

LABORATORIO DE MÉTODOS DE ANÁLISIS

“Purificación parcial de lisozima de clara de huevo”

ALUMNO: Juárez Castillón Luis Enrique

GRUPO: 4IV1

SECCCIÓN: 3
Objetivos
El alumno:
a) Realizará una purificación parcial de la lisozima de la clara de huevo por
cromatografía de intercambio iónico.
b) Cuantificará la actividad de la lisozima en las cuatro fracciones que se
obtienen durante el proceso de purificación.
c) Determinará la actividad específica de las cuatro fracciones que se obtienen
en el proceso de purificación.
d) Calculará algunos de los parámetros involucrados en la cromatografía por
intercambio iónico.

Cromatografía por intercambio iónico

Separa moléculas basadas en las cargas totales que presentan a un pH
determinado.

Resultados
Tabla 1. Actividad de la lisozima en las fracciones obtenidas.
Fracción A450 A450
tiempo cero después de 2 min ∆A450/min ∆A450/min/ml

F1 0.74 0.62 0.06 2

F2 0.74 0.726 0.007 0.233333333
F3 0.738 0.718 0.01 0.333333333
F4 0.74 0.668 0.036 1.2

Tabla 2. Curva de calibración de albúmina por el método de Bradford.

A595
Tubo No. Cantidad de proteína (µg)
Serie A Serie B
1, 1' 2 0.147 0.156
2, 2' 4 0.278 0.288
3, 3' 6 0.354 0.378
4, 4' 8 0.478 0.472
5, 5' 10 0.558 0.546
 0.6
y = 0.0511x + 0.0564
0.5 R² = 0.9927

Absorbancia (595nm)
0.4

0.3
Serie A
0.2 Serie B

0.1

0
0 2 4 6 8 10 12
Concentración de proteína (µg)

Tabla 3. Determinación del grado de purificación de la Lisozima.

Fracción Actividad Concentración de Actividad específica(actividad Purificación de
enzimática proteínas (mg/mL) enzimática/ mg de proteína) lisozima (veces)
∆A450/min/ml
F1 2 4.125244618 0.484819734 1
F2 0.233333333 3.009784736 0.077524924 0.159904638
F3 0.333333333 1.85518591 0.179676512 0.370604782
F4 1.2 0.423679061 2.832332564 5.842032333

Cálculos
A595 Cantidad de proteína por Dilución
interpolación en curva
tipo(µg/mL)
0.478 8.250489237 500
0.364 6.019569472 500
0.246 3.71037182 500
0.143 1.694716243 250
  Porcentaje de retención del intercambiador

 Porcentaje de recuperación de la actividad de la lisozima

Discusión

Como sabemos, el desarrollo de esta práctica se hizo con la técnica de

cromatografía por intercambio iónico. Recordando que su fundamento se basa en
la separación de moléculas por las cargas totales de estas mismas.
Sin embargo, nuestra proteína a la cual se le hizo el proceso de purificación
parcial fue la lisozima, por lo que gracias a su pH se vió favorable la técnica de
cromatografía por intercambio iónico.

Por otro lado, para la purificación de esta proteína se obtuvieron cuatro fracciones.
Una vez obtenidas estas fracciones, se utilizó la suspensión de las células de
Micrococcus lysodeikticus (a 450nm y tiempo 0).
Posteriormente a la solución se le agregó 30 μL de la fracción correspondiente,
después del tiempo establecido (dos minutos) se anotó la absorbancia dada.
Analizando, se observa que la actividad enzimática es proporcional a la
disminución de la absorbancia a 450nm.

Finalmente se elaboró una curva de calibración empleando el método de Bradford,

esto con la finalidad de determinar la cantidad de proteína. Observamos también
que la cantidad de proteína va disminuyendo parcialmente durante cada fracción ,
siendo la fracción 1 la que contiene mayor cantidad de proteína, debido a que esta
fracción contiene clara de huevo diluida, mientras que la fracción 4 contiene menor
cantidad de proteína indicando que sólo tenemos la lisozima.

Conclusiones
• Se comprobó que la cromatografía por intercambio iónico es la más
apropiada para la purificación de la lisozima.
• Se cuantificó y determinó la actividad específica de las cuatro fracciones.
 • Se calculó algunos parámetros como porcentaje de retención del
intercambiador y porcentaje de recuperación de la actividad de la lisozima.

Preguntas Extra
1. Además de Micrococcus lysodeikticus, menciona 3 microorganismos con lo que
se pueda medir la actividad enzimática de la lisozima.
• Sarcina lute
• Bacillus subtilis
• Bacillus megaterium
2. ¿Qué reacción cataliza la lisozima?
Cataliza la hidrólisis de enlaces glicosídicos β (1-4) entre el ácido N-
acetilmurámico (NAM) y N-acetilglucosamina (NAG) del peptidoglicano de la pared
celular de las bacterias.
3. ¿Qué carga superficial presenta la CM-celulosa activada?
Positiva, ya que las cargas positivas están alrededor de las cargas negativas de la
CM-celulosa y así las partículas positivas de la lisozima se adhieran.
4. ¿Qué carga tiene la lisozima al pH del regulador A, es mayor a su punto
isoeléctrico?
El pI de la lisozima es de 10.7, el regulador A esta a pH de 10, por lo tanto es
menor a su pI y la molécula estará protonada.
5. Explique qué característica de la lisozima es la base para esta purificación, es
decir para separarla de otras proteínas en la mezcla.
La lisozima tiene un punto isoeléctrico de 10.7, dos unidades de pH superior al
resto de las proteínas que están presentes en la clara del huevo. Gracias a esto se
puede separar la lisozima del resto de las proteínas por medio de cromatografía
por intercambio iónico.
6. ¿Porque eluye la lisozima con el regulador B?, ¿Cuál es el ion clave?
La lisozima quedo adherida a la CM-celulosa, para que la lisozima eluya, se debe
de cambiar el pH o añadir sales que compitan por la muestra.
Como sabemos el regulador B es glicina/NaOH 0.1M, pH 10, conteniendo 0.6 M
de NaCl; este contiene NaCl que es una sal, por lo tanto, compite con la lisozima,
permitiendo que esta eluya.
7. ¿Para qué sirven los lavados con regulador A?
Para activar la CM-celulosa y eliminar proteínas que no son la lisozima.
8. Al final para lograr la elución de la lisozima, ¿utilizamos cambio de pH o adición
de sales?
Adición de sales, agregamos regulador B que contiene NaCl.
9. ¿Cuál fue el propósito de la purificación si la Fracción 1 (F1-antes de la
purificación) presenta mayor actividad enzimática que la Fracción 4 (F4-después
de la purificación)? ¿Qué moléculas se eliminaron?
La clara de huevo contiene, además de lisozima otras enzimas que pueden ayudar
a proteger de microrganismos.
Se eliminaron proteínas como la ovoalbúmina que contiene la clara del huevo y
otras enzimas.
10. ¿Si se hubiera medido la cantidad de proteínas en la fracción que se desechó,
sería: mayor o menor que en la Fracción 3?, ¿mayor o menor que en la Fracción
4?
Menor a la fracción 4 y mayor a la fracción 3.
11. ¿Qué pasaría con la actividad enzimática si las fracciones obtenidas no se
mantuvieran en hielo?
Las enzimas tienen una temperatura óptima.
Esto quiere decir que, al aumentar la temperatura, la actividad enzimática
(velocidad de reacción) aumenta, pero llega un punto donde si se sigue
aumentando la temperatura la actividad enzimática disminuye.
Se mantiene en hielo para que la enzima no comience a desnaturalizarse.
12. Con sus palabras defina a que se refieren el porcentaje de retención del
intercambiador y el porcentaje de recuperación de la actividad de la lisozima.
El porcentaje de retención del intercambiador, nos indica la interacción se los
iones con la carga de la fase estacionaria.
El porcentaje de recuperación de la actividad de la lisozima, nos indica cuanta
lisozima se logró purificar.
13. Mencione 3 ejemplos de uso en la industria de: Cosméticos
• Es utilizada en la industria para diferentes fines por su demostrada actividad
antibacteriana frente a bacterias Gram-positivas y su actividad antiviral.
Muchas modificaciones de la proteína permiten ampliar su espectro
antibacteriano logrando así afectar a bacterias Gram-negativas.
• Funciona como conservante en algunos productos.
• Se usa en cremas hidratantes como antibacteriano.
Referencias
 Carrillo, W. (2013). Lisozima: Actividad antibacteriana y alergenicidad.
Recuperado el: 25/06/2020, de: Instituto de Investigación en Ciencias de la
Alimentación (CIAL-CSIC-UAM) Madrid- España. Sitio web:
http://www.revistasan.org.ar/pdf_files/trabajos/vol_14/num_4/RSAN_14_4_3
14.pdf
 Berg J., Tymoczko J., Stryer L., “Bioquímica”. 6ª edición. Ed. Reverté
(2008), pp. 69.70.