INSTITUTO POLITÉCNICO NACIONAL

ESCUELA NACIONAL DE CIENCIAS

BIOLÓGICAS

LABORATORIO DE MÉTODOS DE ANÁLISIS

PRÁCTICA:
“DETERMINACIÓN DE PROTEÍNAS POR EL MÉTODO DE
ÁCIDO BICINCONÍNICO (BCA) Y BRADFORD”

ALUMNO:
JIMÉNEZ REYES YONATAN

DOCENTE:
HERNÁNDEZ LÓPEZ FRANCISCO CARMELO

GRUPO: 4IM2 SECCIÓN: 2

FECHA DE ENTREGA: 04/03/2020

 DETERMINACIÓN DE PROTEÍNAS POR EL MÉTODO DE ÁCIDO
BICINCONÍNICO (BCA) Y BRADFORD

OBJETIVOS

Objetivo general

-Determinar la concentración de proteínas empleando un método

espectrofotométrico.

Objetivos específicos

-Determinar la concentración de proteínas con base en una curva tipo empleando

como solución estándar de albúmina sérica bovina (BSA) o hemoglobina bovina.

-Comprender la importancia de un método espectrofotométrico en la cuantificación

de proteínas.

-Analizar el efecto de sustancias no proteínicas en el método de ácido

bicinconínico (BCA) y Bradford.

-Determinar si existe diferencias estadísticamente significativas entre el método de

BCA (método estándar) y Bradford (método a prueba) en cuanto a precisión y
exactitud.

-Analizar las ventajas y desventajas entre el método del BCA y Bradford.

FUNDAMENTO

Determinación de proteínas por el método del ácido bicinconínico BCA

Este método se basa en la reducción del ion cúprico (Cu 2+) a ion cuproso (Cu1+) en
medio alcalino en donde el número de enlaces peptídicos y la presencia de ciertos
aminoácidos tales como, cisteína, cistina, triptófano y tirosina, son los
responsables de dar inicio a la reacción. Posteriormente dos moléculas de BCA
(reactivo cromogénico) reaccionan con una de ion Cu 1+ para formar un complejo
colorido purpura. La cantidad de ion Cu 2+ reducido es función de la concentración
de proteínas y puede ser determinada espectrofotométricamente por un cambio en
el color de la solución a purpura, cuya absorbancia puede leerse a 562 nm. La
concentración de proteínas se determina a partir de una curva de calibración
construida con una proteína de referencia de concentración conocida. A partir de
esta curva se determina la concentración de la muestra de proteína incógnita.

Figura 1. Reducción del ion cúprico a cuproso por

acción de las proteínas y posterior acomplejamiento
del ion cuproso con dos moléculas de BCA.

Determinación de proteínas por el método de Bradford

Se basa en la unión no covalente, en condiciones ácidas, del colorante azul

brillante de Coomassie G-250 y las proteínas en solución. Este compuesto
presenta diferentes espectros de absorción según el estado de protonación en el
que se encuentra: la forma catiónica es de color rojo amarronado (máximo de
absorción a 470 nm), la neutra es verde (máximo a 650 nm) y la aniónica es azul
(máximo de absorción a 595 nm). La presencia de proteínas favorece el
desplazamiento del equilibrio hacia la forma aniónica debido a la interacción de los
grupos sulfónicos del colorante azul brillante de Coomassie G-250 con los grupos
catiónicos de las cadenas laterales de algunos residuos de aminoácidos tales
como arginina, triptófano, tirosina, histidina y fenilalanina. El complejo colorido
formado puede leerse a 595 nm y la estabilidad de este es de 1 hora.
Figura 2. Estructura molecular Figura 3. Espectro de absorción del
del colorante azul brillante de complejo proteína- azul de Coomassie
Coomassie G-250. G-250. A: azul de Coomassie; B:
complejo proteína-colorante.

RESULTADOS Y CÁLCULOS

Tabla 1. Curva tipo de hemoglobina en el método del BCA.

Concentración de proteína
Tubo A562 A562
(µg/mL)
Serie a Serie b
1 2 0.156 0.119
2 4 0.229 0.094
3 6 0.189 0.174
4 8 0.302 0.142
5 10 0.401 0.381
 Gráfica 1. Curva tipo de hemoglobina. Método del BCA.
0.45

0.4

0.35

0.3
Absorbancia

0.25

0.2

0.15

0.1

0.05

0
1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11

Concentración de proteína (µg/mL)

Gráfica 2. Curva tipo de hemoglobina modificada.

0.45

0.4

0.35

0.3
Absorbancia

0.25

0.2

0.15

0.1

0.05

0
1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11

Concentración de proteína (µg/mL)

Se obtiene la ecuación de la recta de la curva tipo por regresión lineal:

A = 0.0302C + 0.0627

r = 0.9156

Ejemplo de cálculo:

Con base en la ecuación de la recta obtenida de la curva tipo de hemoglobina, se

procede a calcular la concentración de proteína para las 10 réplicas.

Para el tubo 1:
A−0.0627
C=
0.0302

0.190−0.0627
C=
0.0302

C=4.22 µg/mL

Tabla 2. Réplicas para el análisis estadístico. Método de BCA.

Concentración de proteína
Tubo A562
(µg/mL)
1 0.190 4.22
2 0.237 5.77
3 0.118 1.83
4 0.045 0.59
5 0.231 5.57
6 0.286 7.39
7 0.229 5.51
8 0.352 9.58
9 0.196 4.41
10 0.181 3.92

Tabla 3. Resultados del análisis estadístico para el método de BCA.

 X́ s s2 %CV IC de μ
4.88 2.57 6.60 52.66 4.88 ± 1.84

A continuación, se muestra el cálculo de %CV e intervalo de confianza de la media

poblacional:

s
%CV = ∗100
x́

2.57
%CV = ∗100
4.88

%CV =52.66 %

ts
IC de µ=x́ ±
√n

(2.26)(2.57)
IC de µ=4.88 ±
√ 10

IC de µ=4.88 ± 1.84 (3.04-6.72)

Tabla 4. Efecto de sustancias no proteínicas en el método del BCA.

Concentració
Tipo de interferencia
Tubo Sustancia A562 n de proteína
generada
(µg/mL)
1 Fenol al 1% 1.508 47.86 +
2 Detergente comercial 0.289 7.49 +
3 SDS al 1% 0.403 11.27 +
4 Mercaptoetanol al 1% 1.735 55.37 +
5 EDTA 30 mM 0.051 0.39 -

(+) Interferencia positiva

(-) Interferencia negativa

N.I. No hay interferencia con el método

 Tabla 5. Curva tipo de hemoglobina por el método de Bradford.

Concentración de proteína
Tubo A595 A595
(µg/mL)
Serie a Serie b
1 2 0.121 0.101
2 4 0.204 0.174
3 6 0.287 0.264
4 8 0.342 0.350
5 10 0.402 0.407

Se obtiene la ecuación de la recta de la curva tipo (gráfica 3) por regresión lineal:

A = 0.0372C + 0.042

r = 0.9933

Gráfica 3. Curva tipo de hemoglobina. Método de Bradford.

0.45

0.4

0.35

0.3
Absorbancia

0.25

0.2

0.15

0.1

0.05

0
1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11

Concentración de proteína (µg/mL)

Ejemplo de cálculo:
Con base en la ecuación de la recta obtenida de la curva tipo de hemoglobina, se
procede a calcular la concentración de proteína para las 10 réplicas.

Para el tubo 1:

A−0.042
C=
0.0372

0.328−0.042
C=
0.0372

C=7.69 µg /mL

Tabla 6. Réplicas para el análisis estadístico. Método de Bradford.

Concentración
Tubo A595 de proteína
(µg/mL)
1 0.328 7.69
2 0.297 6.85
3 0.280 6.40
4 0.340 8.01
5 0.340 8.01
6 0.343 8.09
7 0.334 7.85
8 0.274 6.24
9 0.349 8.25
10 0.349 8.25

Tabla 7. Resultados del análisis estadístico para el método de Bradford.

X́ s s2 %CV IC de μ
7.56 0.77 0.59 10.19 7.56 ± 0.55

A continuación, se muestra el cálculo de %CV e intervalo de confianza de la media

poblacional:
 s
%CV = ∗100
x́

0.77
%CV = ∗100
7.56

%CV =10.19 %

ts
IC de µ=x́ ±
√n

(2.26)( 0.77)
IC de µ=7.56 ±
√ 10

IC de µ=7.56 ± 0.55 (7.01-8.11)

Tabla 8. Efecto de sustancias no proteínicas en el método de Bradford.

Concentración Tipo de
Tubo Sustancia A595 de proteína interferencia
(µg/mL) generada
1 Fenol al 0.2% 0.344 8.12 +
Detergente
2 0.148 2.85 -
comercial al 0.2%
3 SDS al 0.2% 0.124 2.20 -
Mercaptoetanol al
4 0.339 7.98 N.I.
0.002%
5 EDTA 30 mM 0.319 7.45 N.I.

(+) Interferencia positiva

(-) Interferencia negativa

N.I. No hay interferencia con el método

Diferencias de exactitud entre el método de BCA (considerado de referencia)

y el método de Bradford (considerado de prueba)
Prueba de t-student para datos pareados

Planteamiento de pruebas de hipótesis

Ho: x́ Bradford =x́ BCA

Ha: x́ Bradford ≠ x́ BCA

Criterios de rechazo

Rechazar Ho cuando: t cal ≥ t tablas

Cálculo de t calculada

D́=
∑ Di donde Di = Xprueba – Xreferencia
n

26.85
D́= =2.685
10

Tabla 9. Cálculo de t calculada para datos pareados.

Bradford BCA xBrad - xBCA

Réplica ( Di− D́)2
(µg/mL) (µg/mL) (Di)

1 7.69 4.22 3.47 0.6162

2 6.85 5.77 1.08 2.5760
3 6.40 1.83 4.57 3.5532
4 8.01 0.59 7.42 22.4202
5 8.01 5.57 2.44 0.0600
6 8.09 7.39 0.70 3.9402
7 7.85 5.51 2.34 0.1190
8 6.24 9.58 -3.34 36.3006
9 8.25 4.41 3.84 1.3340
10 8.25 3.92 4.33 2.7060
∑¿ 26.85 73.6254

∑ ( Di− D́)2
S D=
√ n−1
 73.6254
S D=
√ 10−1
=2.86

√n
t cal= D́
SD

√ 10
t cal=2.685 =2.968
2.86

NC = 95% n-1 = 10-1 = 9 t tablas =2.262

Como t cal >t tablas se rechaza Ho

Conclusión analítica

Existe diferencia estadísticamente significativa, en cuanto a exactitud, entre el

método de Bradford con respecto al de BCA.

Diferencias de precisión entre el método de BCA (considerado de referencia)

y el método de Bradford (considerado de prueba)

Prueba F de Fisher

Planteamiento de pruebas de hipótesis

Ho:S2Bradford =S2BCA

Ha: S2Bradford ≠ S2BCA

Criterios de rechazo

Rechazar Ho cuando: F cal ≥ F tablas

Cálculo de F calculada
 S2b
F calc= 2 Donde S2b > S2a
Sa

Con base en la tabla 3 y 7:

6.60
F calc= =11.186
0.59

grados de libertad delnumerador

NC = 95% gl=
grados de libertad del denominador

9
gl= F tablas =4.026
9

Como F cal > Ftablas se rechaza Ho

Conclusión analítica

Existe diferencia estadísticamente significativa, en cuanto a precisión, entre el

método de Bradford con respecto al de BCA.

DISCUSIÓN

Como se puede observar en la gráfica 1, el punto 8 de la serie B y el punto 4 de la

misma serie presentan mayor dispersión que los demás puntos, por lo que, se
descartan ambos datos, con el propósito de mejorar la linealidad. De todas formas,
en dicha curva de calibración se presenta un pobre cambio lineal entre
concentración y absorbancia, en particular para los intervalos de concentración de
4 a 6 µg/mL de proteína. Por tanto, la curva de calibración experimental no
presenta buena linealidad pues su coeficiente de correlación es menor a 0.98
(0.9156). La dispersión de datos que presenta se debe en gran parte al analista, el
cual se le atribuye a un error sistemático del tipo personal como es el manejo
inadecuado de la micropipeta lo que conlleva a la adición errónea de volúmenes
de solución de hemoglobina, agua destilada y reactivo de BCA. Bibliográficamente
se tiene que para el método de BCA la ley de Bouguer y Beer se cumple en un
rango de concentración de 0.5-10 µg/mL .

Por otro lado, en la curva tipo de hemoglobina (gráfica 3) por el método de

Bradford se presenta un comportamiento lineal cuyo coeficiente de correlación es
de 0.9933 por lo que, la ley de Bouguer y Beer se cumple en un intervalo de
concentración de hemoglobina de 2 a 10 µg/mL. La literatura menciona que la ley
de Bouguer y Beer para la cuantificación de proteínas por el método de Bradford
se cumple en un rango de concentración de 1-15 µg/mL. Por consiguiente, el valor
de la pendiente de la curva de calibración es de 0.0372, mientras que la pendiente
de la curva de calibración por BCA es de 0.0302. Entonces el método de BCA
presenta mayor sensibilidad que el método de Bradford ya que la pendiente de
este último es mayor. Al comparar con la bibliografía se tiene que efectivamente,
el método de BCA (0.5 µg/mL) es más sensible que el método de Bradford (1
µg/mL).

Del análisis estadístico para el método de BCA se presenta variaciones en cuanto

a la media, desviación estándar, varianza y coeficiente de variación. Se sabe que
en este análisis la concentración de hemoglobina que se espera es de 6 µg/mL y
la media aritmética obtenida de las 10 réplicas preparadas a las mismas
condiciones es de 4.88 por lo que está por debajo de la concentración esperada.
Con base en la tabla 3, se observa un coeficiente de variación del 52.66% lo que
implica una precisión muy baja por parte del analista ya que se prefiere obtener en
un método de análisis un %CV menor al 5%. Estas desviaciones se pueden
atribuir, primeramente, al analista que trabajó con la curva de calibración pues no
presentó buena linealidad. Aunado a esto, otro analista diferente realizó el análisis
estadístico lo que representa una fuente de variación ya que el error se atribuye
tanto a la curva de calibración como al que preparó las réplicas para el análisis
estadístico. Además, tomar en cuenta los errores por manejo inapropiado de la
micropipeta ya que claramente repercutió en los parámetros estadísticos y por
ende se ve afectada la confiabilidad de los resultados. Por otro lado, el método de
Bradford también presentó ciertas variaciones en los parámetros estadísticos
(tabla 7), pero en menor medida que el método de BCA.

Con base en la prueba de t-student se tiene que existe diferencia estadísticamente

significativa, en cuanto a exactitud, entre el método de Bradford con respecto al de
BCA. Por otra parte, en la prueba F de Fisher se tiene que hay diferencia
estadísticamente significativa, en cuanto a precisión, entre el método de Bradford
con respecto al de BCA. Por tanto, significa que experimentalmente el método de
Bradford no es ni siquiera igual de exacto y preciso que el método de referencia
(BCA). Sin embargo, bibliográficamente el método de BCA como Bradford son
estadísticamente igual de exactos y precisos solo difieren en ciertas ventajas y
desventajas de cada método.
Con base en el artículo de Smith y cols., sus respectivos experimentos muestran
una comparación de la estabilidad de la preparación de soluciones de proteínas
estándar con el reactivo de Lowry y BCA. Dichos reactivos se almacenan durante
1 semana a temperatura ambiente y se efectúa el ensayo nuevamente. Los
resultados muestran que el reactivo de Lowry se degrada en un 40%, mientras
que el reactivo de BCA no muestra cambios significativos.

Figura 5. Rendimiento de reactivo de

BCA y Lowry almacenados durante 1 Figura 6. Curvas de respuesta
semana. de color generadas a diferentes
temperaturas de incubación.

En la figura 6 se observan los resultados de Smith y cols., tras analizar una

preparación de solución de proteína con el reactivo de BCA después de incubar
los tubos durante varios períodos de tiempo a cada temperatura seleccionada. Es
interesante ver que la preparación de muestras con BCA es estable hasta por 21
horas lo que implica que el complejo colorido formado por la reacción es hasta en
cierto punto estable por lo que la medición de absorbancias no se verá afectado

Observar en la tabla 4 el efecto de sustancias no proteínicas en el método de

BCA. Comparando con datos bibliográficos se tiene que no hay similitud entre lo
obtenido pues hay sustancias que en realidad no interfieren o viceversa. El
método de BCA no se ve afectado por una amplia variedad de detergentes, SDS y
agentes desnaturalizantes como la urea y el cloruro de guanidinio. Sin embargo,
ciertas sustancias interfieren con el método como la presencia de azúcares
reductores, fenol, ácidos o bases fuertes y agentes reductores como el
mercaptoetanol. Además, dado que el método se basa en la reducción del ion
cúprico a cuproso, la presencia de agentes quelantes tales como EDTA,
interfirieren severamente con el método.

La tabla 8 muestra las interferencias de sustancias no proteícas en el método de

Bradford. Con base en la literatura se tiene que hay interferencia por agentes
alcalinos como es el SDS y en gran medida se ve afectado por la presencia de
detergentes. Por otra parte, la presencia de EDTA interfiere muy poco en el
método, mientras que no se ve afectado por compuestos fenólicos y agentes
reductores (mercaptoetanol).

El método de Bradford tiene muchas ventajas, entre las que se destacan son:
método sensible (1-15 µg/mL), simple, rápido, barato, compatible con sustancias
reductoras, polifenoles y menor tiempo de reacción. Sin embargo, Bradford
depende fuertemente de la composición de aminoácidos de la proteína que se
mide, además de que los detergentes interfieren con el método. El método de BCA
es más sensible que el método de Bradford (0.5-10 µg/mL), no interfieren los
detergentes ni los reactivos desnaturalizantes. Entre sus desventajas se destacan:
más caro, tener cuidado con el tiempo y temperatura de incubación, los agentes
quelantes y azúcares reductores interfieren con el método.

CONCLUSIONES

-La curva tipo de hemoglobina por el método de BCA no presenta buena

linealidad.
- El método de BCA presenta mayor sensibilidad que el método de Bradford.
-El método de Bradford presentó menos variaciones en cuanto a parámetros
estadísticos en comparación con el método de BCA.
-Con base en la prueba de t-student y F de Fisher, hay estadísticamente
diferencias en cuanto a exactitud y precisión entre el método de BCA y Bradford.
-Con base en los datos experimentales, las sustancias no proteínicas interferentes
en el método de BCA son: fenol al 1%, detergente comercial, SDS al 1%, EDTA
30mM y mercaptoetanol al 1%.
- Con base en los datos experimentales, las sustancias no proteínicas
interferentes en el método de Bradford son: fenol al 0.2%, detergente comercial al
0.2% y SDS al 0.2%.
-Los analistas presentan errores sistemáticos del tipo personal.
-La espectrofotometría es útil para la cuantificación de proteínas.
-El método de Bradford es más barato, rápido y sencillo que el método de BCA.

REFERENCIAS

-Posada M. 2015. Análisis bioquímico. Primera edición. Ediciones Paraninfo.

España. pp 71-73.

-P.K.Smith, R.I.Krohn, G.T.Hermanson y cols. 1985. Measurement of protein using

Bicinchoninic Acid. Academic Press. pp 79-84.

-S.J.Compton, C.G.Jones. 1985. Mechanism of Dye Response and Interference in

the Bradford Protein Assay. Academic Press. pp 371-374.

-Kit para cuantificar proteínas totales, qPROTEIN (BCA). Obtenido en:

http://www.pb-l.com.ar/wp-content/uploads/2016/07/RA03-qPROTEIN.pdf

-Fernández E., Galván A. (n.d.). Métodos para la cuantificación de proteínas.

Departamento de Bioquímica y Biología Molecular. Campus universitario de
Rabanales.

-Johnson M. 2012. Cuantificación de proteínas. Consultada el 2 de marzo del 2020

en:
http://www.labome.es/method/Protein-Quantitation.html