Prácticas de Enzimología

PRACTICA 2

EVALUACION DE TABLAS DE PURIFICACION DE ENZIMAS

Objetivos:
- Evaluar la eficiencia de los métodos de purificación de enzimas
- Capacitarse en el análisis de tablas de purificación de enzimas

Procedimiento Durante la Purificación de Enzimas

Debido a que la purificación de una enzima (proteína) implica la eliminación selectiva de
otras proteínas, es necesario determinar la cantidad de actividad enzimática con respecto a la
cantidad de proteína presente. Usualmente, se emplea una medida de la actividad enzimática
por miligramo de proteína para indicar el grado de pureza de la enzima en las diversas
fracciones obtenidas durante la purificación. Este parámetro, la actividad específica, se calcula
a partir de una medida de la actividad enzimática o unidades, usualmente expresada en
términos de micromoles de producto formado por minuto, y una determinación de la proteína,
según la siguiente ecuación:

Actividad específica = unidades por miligramo de proteína

= micromoles de sustrato consumido por minuto por miligramo de proteína
= micromoles de producto formados por minuto por miligramo de proteína

También se debe estimar la eficiencia de una purificación enzimática a través de la

determinación de la cantidad de actividad enzimática que se recupera en cada etapa de
purificación. Esto requiere que usted calcule la actividad total en cada fracción.

Actividad total = (actividad específica) x (mg de proteína total en la preparación)

ó
Actividad total = (actividad por mililitro) x (volumen de la preparación en mililitros)

Después que usted conoce estos valores para cualquier preparación de una enzima,
usted puede proceder con la purificación de la enzima aplicando una o más técnicas. Es
esencial calcular la actividad específica, la actividad total, y el porcentaje de rendimiento para
cada fracción obtenida durante una purificación.

Porcentaje de rendimiento = (actividad total de una fracción dada/actividad total del material de partida) x
100%

Por lo tanto, la efectividad de una etapa particular puede ser evaluada según el
incremento de la actividad específica de la enzima y el porcentaje de rendimiento en las
fracciones de mayor enriquecimiento. Un incremento de la actividad específica indica una
purificación. Un fraccionamiento ideal debería proveer un enriquecimiento completo (enzima
pura) en un rendimiento del 100%; en la práctica, pocos procedimientos son altamente
selectivos y se combina varias etapas menos ideales para el fraccionamiento. De hecho, si el
enriquecimiento es grande, se debe esperar un rendimiento más bajo en una etapa particular.
La tabla 2.1 muestra una forma conveniente y usual para presentar los resultados obtenidos
durante un procedimiento de purificación. Debido a que la concentración de proteína y la
actividad enzimática se determinan usualmente como miligramos por mililitro y unidades por
mililitro, respectivamente, también es necesario registrar el volumen de cada fracción
enzimática. La presente práctica permite al estudiante ganar alguna experiencia en la aplicación
de estos conceptos a la purificación de una enzima.

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Tabla 2.1. Purificación de isocitrato deshidrogenasa (NADP+) (E.C. 1.1.1.42) a partir de hígado de cerdo
(basado en datos de Illingworth Y Tipton)

Vol. ml Conc. Unidades Prot. Act. Rend. Purificación

Procedimiento U/ml Totales mg/ml Esp. %

Homogenizado 7,000 2.25 19,950 35.5 0.080 100 1.0

Sobrenadante en cloroformo 5,890 3.60 20,880 19.2 0.187 105 2.34
Saturación de 37.5-55% con sulfato
de amonio fracción dializada 1,500 11.25 16,875 21.4 0.525 84.5 6.56
Eluato DEAE-Celulosa 2,380 3.82 9,090 1.0 3.82 45.5 47.7
Eluato en fosfato de calcio 450 15.05 6,772 0.9 16.7 34.0 209.0
Eluato de isocitrato, gel filtración 52 98.00 5,096 2.15 45.6 25.5 570.0
NOTA. Esta tabla es dada meramente como una ilustración de la forma estándar de colocar los resultados de una
purificación, aunque represente un caso real. La descripción del procedimiento ha sido grandemente abreviada, y si se
desea repetir la preparación deberá consultarse el trabajo original.

PROBLEMA
Utilizando los datos que se proporcionan en las siguientes tablas, complete los datos
que faltan para obtener una tabla estándar de purificación de enzimas. Una vez completadas
las tablas de purificación, analizar cada una de ellas con respecto a actividad específica,
rendimiento del proceso de purificación de la enzima y grado de pureza alcanzada. Asimismo,
haga un comentario sobre si el proceso de purificación presentado es aceptable, más o menos
aceptable o no aceptable.

CASO 1: Purificación de fosfatasa ácida a partir de hojas de tabaco. Se usó ATP como sustrato
Fracción Volumen Contenido proteico Actividad
(ml) (mg/ml) (U/ml)
Extracto crudo (I) 1480 10.2 0.34
Extracto centrifugado (II) 1390 4.3 0.32
Extracto en alúmina Cγ(III) 69 3.9 4.53
DEAE celulosa pH 5.5 (IV) 100 1.17 3.09
DEAE celulosa pH 7.5 (V) 12 0.65 7.02

CASO 2: Purificación de fosfatasa ácida a partir de hígado de rata

Fracción Volumen total Proteína total Actividad total
(ml) (mg) (Unidades)
Homogenizado 1612 211000 4320
Sobrenadante de pH 5 2881 21700 2420
Sulfato de amonio 278 18500 2296
Sephadex G-75 98.6 1860 500
DEAE-celulosa Pico I 38.4 360 404
Hidroxiapatita 388 37.0 398
Cristalización I 0.8 7.3 130
Cristalización II 0.5 5.1 91.2
DEAE-celulosa Pico II 242 140 92.4
Sephadex G-200 266 29 78.4

CASO 3: Purificación de fosfatasa ácida a partir de semillas de ricino (650 g). La actividad fue
medida usando p-Nitrofenil fosfato como sustrato
Volumen Proteína total Actividad total
Etapa
total (ml) (mg) (mKat)
Extracto 2140 36000 68.3
Precipitación con (NH4)2SO4 y acetona 385 19600 79.4
SP-Sephadex 42 1870 21
DEAE-Sephadex 20 378 18.3
Sephacril S-200 20 30 35
Concanavalina A Sepharosa 6 1.47 5.6