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Instituto Politécnico Nacional

Escuela Nacional de Ciencias


Biológicas
Departamento de Bioquímica
Laboratorio de Métodos de Análisis
Determinación de la actividad de enzimas proteolíticas.
Método de Kunitz
Objetivos:
 Determinar la actividad enzimática de la tripsina en base a una curva de actividad
enzimática.
 Conocer la relación entre la actividad enzimática de la tripsina y su actividad específica
para obtener las unidades específicas para tripsina
 Comparar unidades específicas de tripsina de cada proteasa.

Introducción
Las enzimas son catalizadores biológicos con funciones selectivas y de gran eficiencia. Las
enzimas tanto de organismos sencillos como complejos, catalizan reacciones de rutas
metabólicas vitales. Una de sus funciones principales es acelerar dichas reacciones, reduce en
gran parte la energía necesaria para efectuar la reacción. Las enzimas son muy específicas para
cada sustrato sobre el cual actúan y su grado de especificidad varia dependiendo de ello.
Las enzimas proteolíticas son responsables de la coagulación de la sangre. Hay enzimas
proteolíticas en las células fagocíticas de la sangre que se encargan de hidrolizar las proteínas
extrañas.
Las enzimas proteolíticas pertenecen a uno de los más importante grupos de enzimas en el
proceso industrial de alimentos. Son usadas en la producción de quesos, ablandamiento de
carne y la modificación de propiedades de las proteínas de cereales en el pan y para la
manufactura de cereales. La reacción de catálisis mas común realizada por estas enzimas es la
hidrólisis de enlaces peptidicos de una proteína.

La enzima proteolítica
papaína (EC 3.4.22.2)
pertenece al grupo de
las sulfhidril proteasas
y fue encontrada por
primera vez en la
papaya.
Resultados:
1. Curva de actividad enzimática
Tabla 1. Actividad enzimática de la tripsina
Tubo Concentración de Tripsina (mg) A280 A280 corregida
Problema Testigo
T1 Y 1 0.04 0.211 0.062 0.149
T2 Y 2 0.08 0.346 0.063 0.283
T3 Y 3 0.12 0.464 0.062 0.402
T4 Y 4 0.16 0.535 0.062 0.473
T5 Y 5 0.20 0.593 0.066 0.527
PROBLEMAS
TI Y I Bromelaína 1:10 0.705 0.204 0.501
TII Y II Bromelaína 1:20 0.436 0.110 0.326
TIII Y III Papaína 0.346 0.108 0.238

Ecuación de la recta

Donde:
2. Calculo de Unidades Trípticas

Las Unidad Tríptica se define como la cantidad de enzima necesaria para aumentar una unidad
de absorbancia a 280 nm por minuto de digestión, bajo las condiciones experimentales
descritas.

3. Curva de actividad enzimática especifica

Si existen 0.11825 UT en 1 mg:

Determinar UT en 0.04 mg

Tabla 2. Curva de actividad enzimática especifica para la digestión de caseína por tripsina
Tubo Unidades Trípticas A280 corregida
1 0.0047 0.149
2 0.0095 0.283
3 0.0142 0.402
4 0.0189 0.473
5 0.0237 0.527
Ecuación de la recta

Ecuación empírica

La absorbancia que presento 1 ml de la muestra Bromelaína a una dilución de 1:20 se


encuentra en un intervalo casi lineal de la recta de la curva de actividad enzimática, por lo que
se determinara unidades trípticas de bromelaína a esta concentración. Para ello:

Despejando UT de la ecuación empírica:

Unidades Trípticas de Bromelaína

A280 corregida de bromelaína 1:20=0.326

Sustituyendo en UT
UT por gramo de piña:

Unidades Trípticas de Papaína

A280 corregida de papaína=0.238

Sustituyendo en UT

UT por gramo de ablandador

Preguntas adicionales

a) Defina actividad enzimática y actividad enzimática especifica

Actividad enzimática: Capacidad de la enzima para inducir una reacción química determinada.
A menudo esta reacción se mide de forma indirecta

Actividad enzimática específica: Es la relación entre la actividad enzimática y la cantidad de


proteína

b) Escriba la clasificación de las proteasa, en función de su mecanismo de acción y diga en


que grupo se ubican las determinadas en la práctica.

Existe una división de enzimas proteolíticas en cuatro grupos con base en su mecanismo de
acción:

i) Serina proteasas: estas proteasas tienen en común la característica de ser inhibidas


por el diisopropilfosforofluoridato (DFP) que reacciona con el grupo hidroxilo de un
residuo serilo específico en el sitio activo de la enzima.
ii) Sulfhidrilo proteasas: este grupo tiene la habilidad de hidrolizar los enlaces
peptidicos de proteínas y la inhibición por reactivos con grupo sulfhidrilo.
iii) Metal proteasas: Las enzimas pertenecientes a este grupo son inhibidas por un
agente metal-quelante.
iv) Acido proteasas: el nombre de este grupo indica que el pH óptimo de las enzimas
es muy acido, en un rango de 2 a 4, y esto causa que los grupos no participen en el
sitio activo.
La tripsina pertenece al grupo de las serina proteasas; la papaína y la bromelaína se
encuentran en el grupo de las sulfhidrilo proteasas

c) ¿Para que se adiciona cisteína en las muestras de piña, y de ablandador?

El mecanismo usado para romper un enlace péptidico implica utilizar un residuo del péptido
que contenga Cisteína y Treonina o una molécula de agua, de tal forma que sea posible atacar
al grupo carbonilo del péptido. Una forma de hacer nucleófilos es mediante una triada
catalítica, en donde un residuo de histidina es usado para activar la serina, cisteína o treonina
como nucleófilo.

d) ¿Cuál es la especificidad de enlace de la tripsina, la bromelaína y la papaína?

Tripsina

La especificidad de sustrato de la tripsina es la Lisina y la Arginina

Bromelaína y Papaína

La especificidad de sustrato es Serina, Cisteína y Treonina.

Discusión.

El uso de los tubos testigos tiene como función principal evidenciar la presencia de sustancias
extrañas que absorban a 280 nm y que se encuentren presentes antes y después de la hidrólisis
de la caseína. Estas sustancias afectan la lectura de absorbancia, debido a que después de
realizar la hidrólisis en los tubos problema, la solución absorberá como si esta tuviera una
cantidad de proteína mayor a la adicionada. Por lo tanto debe obtenerse una absorbancia
corregida, siendo esta la diferencia entre la absorbancia del problema y la absorbancia del
testigo, lo anterior con la finalidad de obtener resultados experimentales mas confiables.

Con el fin de comparar la actividad enzimática de cada proteasa, se obtiene unidades


específicas de la tripsina (unidades trípticas). La actividad enzimática específica por miligramo
de muestra de la tripsina es de 0.11825 UT, las actividades específicas de bromelaína y papaína
por gramo de muestra es de 0.3073 UT y 0.1283 UT respectivamente. Cabe resaltar que se
necesita menor cantidad de papaína para hidrolizar la proteína en cuestión, en comparación a
la tripsina. Ambas tienen UT muy parecidas, sin embargo la cantidad de tripsina que se evalúa
es para un miligramo de muestra, la cantidad de papaína necesitada es por gramo de muestra.
Por último la cantidad de bromelaína para realizar la reacción es mayor a la cantidad
necesitada de papaína. La cantidad de tripsina es mayor a la cantidad de bromelaína:

Esto explica la utilización de la papaína en los ablandadores de carne.

Conclusión.

 La actividad enzimática de la tripsina es de 0.11825 UT por miligramo


 La actividad enzimática de la bromelaína es de 0.3073 UT por gramo
 La actividad enzimática de la papaína es de 0.1283 UT por gramo
 La cantidad de enzima mínima necesaria por minuto de digestión para aumentar una
unidad de absorbancia corresponde a la papaína.

Referencia bibliográfica

Berg, J. Stryer, L. 2008. “Bioquímica”. 6° Edición. Editorial Reverte. España. Pag. 67

Whitaker, J. 1972. “Principles of Enzymology for the Food Sciences”. Editorial Marcel Dekker,
Inc. New York, U.S.A. pp. 511-512, 515-517, 526-537

Horton, H. Moran, L. 2008. “Principios de Bioquímica”. 4° Edición. Editorial Pearson Educación


de México. México. pp 129-130