FACULTAD DE CIENCIAS AMBIENTALES

CARRERA DE INGENIERÍA AMBIENTAL

BIOQUÍMICA AMBIENTAL

FACTORES AMBIENTALES
QUE AFECTAN LA ACTIVIDAD
ENZIMÁTICA
Flores Claudia; Ormeño Enzo; Ramírez Juan; Veliz Josue

2018
Introducción:
Las enzimas son proteínas que funcionan como catalizadores biológicos,
disminuyendo la cantidad de energía de activación requerida, barrera
energética (Kimball, 1978). Estas aceleran las reacciones químicas que ocurren
en todo el cuerpo, y en el medio, sin alterar la estructura; y son las encargadas
de dirigir toda la actividad relacionada a la variedad de reacciones debido a que
hace posible que ocurra la reacción necesaria, en el momento preciso, ya que
la α-amilasa es una enzima presente en la saliva y en el jugo pancreático, su
función consiste en la digestión bucal del almidón proveniente de la dieta.
Cataliza la ruptura de los enlaces polimerizantes (1-4), acción determinada por
la estructura de su centro activo (Espitia. L, 2009)
Las reacciones químicas se realizan en los seres vivientes a gran velocidad, en
condiciones muy moderadas de temperatura, pH, presión, etc., gracias a la
existencia de los catalizadores. Un catalizador es un agente capaz de acelerar
una reacción química, sin formar parte de los productos finales ni desgastarse
en el proceso. En los medios biológicos se desempeñan como catalizadores
macromoléculas de naturaleza proteica denominadas enzimas (Tena & Jorrín,
2010). Las enzimas son proteínas solubles, de naturaleza orgánica y estado
coloidal, elaboradas por las células vivas, que actúan independientemente de
éstas, tienen poder catalítico específico (Benjamin. F ,2011). La velocidad y
eficiencia con las cuales se realizan las transformaciones bioquímicas son
notables. Estás solo ocurren si se suministra calor, o pH extremos, o grandes
presiones, etc., recursos todos incompatibles con la subsistencia de las células
(Voet. D; Voet. J, 2006)
Lo factores ambientales (efecto ion cloruro, pH, temperatura, concentración de
enzimas y concentración de sustrato) hacen que muchos microrganismo que
son de gran importancia alteren su ciclo normal por la inhibición de su enzima y
a consecuencia de ello se produzca una alteración en el sistema (Neil A.
Campbell, Jane B. Reece. 2007). Es por este motivo que, el presente trabajo
pretende encontrar la actividad enzimática versus la concentración del: Ion
Cloruro, temperatura, pH, enzima y sustrato a 660 nm, usando la enzima α-
amilasa; debido a que determinadas concentraciones podrían ser factores
ambientales predominantes para alterar el correcto funcionamiento de las
enzimas.
Materiales:
 Buffer fosfato pH 7 (100mL)
 NaCl 0,9% (100mL)
 Almidón 1% (100mL)
 Lugol débil
 Pizeta con agua destilada
 Parafilm  
 Tubos de ensayo (12)  
 Espectrofotómetro  
 Goteros (4)  
 Crayón marcados  
 Masking tape
 Bagueta de vidrio  
 Pipeta 20mL (1)  
 Pipeta 1mL (5)  
 Pipeta 5mL (4)  
 Bombilla de succión (4)
MÉTODOS

Para la experiencia del efecto ion cloruro, requerimos una serie de compuestos
(indicados en la figura 1) para tener la muestra a analizar y un blanco que será
el punto de comparación.

Figura 1. Efecto del Ion Cloruro

Se incubaron los tubos por 5 minutos a 37°C, seguidamente se agregó dos

gotas de Solución de Yodo y se dejó reposar por cinco minutos. Además se
midió la absorbancia a 660nm en el espectrofotómetro y se graficó la actividad
enzimática versus concentración del ion Cloruro (mostrado en la tabla n°2).
Continuando con las experiencias, pasaremos a trabajar el efecto de la
temperatura. Para éste requeriremos también ciertos compuestos (expresados
en la figura 2) para la realización de la muestra y el blanco con el que lo
compararemos.

Figura 2. Efecto de la temperatura

Se

pre-incubaron los tubos por cinco minutos a las diferentes temperaturas

establecidas, seguidamente se agregó 0.5mL del preparado enzimático
(excepto a los Blancos). Posteriormente se incubó a cada temperatura por
cinco minutos y se agregó dos gotas de Solución de Yodo, se dejó reposar por
cinco minutos  Por último se midió la absorbancia a 660nm en el
espectrofotómetro y se graficó actividad enzimática versus temperatura
(mostrado en la tabla n°3).
Siguiendo con los procedimientos, pasaremos a realizar la experiencia de
efecto del pH. Para esto necesitaremos otra serie de soluciones (mencionadas
en la figura 3) para 3 tipos de muestra distintas, cada una con su respectivo
blanco.

Figura 3. Efecto del pH

       

Se pre-incubaron los tubos por cinco minutos a 37°C, seguidamente se agregó

0,5 ml del preparado enzimático a todos los tubos a excepción de los blancos y
se incubó por otros cinco minutos. Seguidamente se agregó dos gotas de
Solución de Yodo y se dejó reposar por cinco minutos. Al finalizar, se midió la
absorbancia a 660 nm en el espectrofotómetro y se graficó la actividad
enzimática versus pH del medio (mostrado en la tabla n°6)
Como última experiencia, trabajaremos el efecto de la concentración de la
enzima. Requeriremos de unas últimas soluciones (presentadas en la figura 4)

Figura 4. Efecto de la concentración de la Enzima

Se volvió a incubar los tubos durante cinco minutos, seguidamente se agregó

tres gotas de Solución de Yodo y se dejó reposar por cinco minutos. Por último
se midió la absorbancia a 660 nm en el espectrofotómetro y se graficó la
actividad enzimática versus concentración de la enzima.
Resultados:

Efecto del ion cloruro:

Se calculó la absorbancia a 660 nm de cada batería en el espectrofotómetro
(Tabla n°1) dando los siguientes resultados:

Tabla n°1: Datos obtenidos de la absorbancia de la muestra a una

misma longitud de onda.

Muestra Absorbancia (660nm)

s

Tubo 1 0,015

Blanco 1 0,353

Tubo 2 0,006

Blanco 2 0,339

Tubo 3 0,213

Blanco 3 0,450

Tubo 4 0,351

Blanco 4 0,496
Posteriormente se calculó la actividad enzimática (Tabla n°2)

Tabla n°2: Datos de la actividad enzimática con respecto a la

concentración del Ion Cloruro.

Muestra Actividad enzimática (mg/ml.min)

s

Tubo 1 0,06376

Tubo 2 0,06282

Tubo 3 0,02642

Tubo 4 0,0038

Figura 5. Actividad enzimática con respecto a la concentración de Cloruro

0.03

0.03

0.02
Concentracion

0.02

0.01

0.01

0
0.5 1 1.5 2 2.5 3 3.5 4 4.5
Actividad enzimatica
Efecto de la temperatura:

Con las muestras ya obtenida y trabajadas bajo efecto de diferentes

temperaturas en la experiencia 2, medimos sus absorbancias bajo una longitud
de onda de 660 nm (Tabla 3)

Tabla n°3: Datos de la absorbancia medida con respecto al efecto de la

temperatura.

Efecto de temperatura

T° C Tubo Absorbancia

0° C Tubo 1 0.304

Blanco 1 0.417

20° C Tubo 2 0.259

Blanco 2 0.386

37° C Tubo 3 0.187

Blanco 3 0.253

100° C Tubo 4 0.314

Blanco 4 0.38
Posteriormente hallamos la actividad enzimática de cada tubo. (Tabla 4)

Tabla n°4: Resultados de la actividad enzimática de los tubos expuestos a

diferentes temperaturas.

Temperatura Actividad Enzimática (mg/min)

Tubo 1 0°C 0.019

Tubo 2 20 ° C 0.008

Tubo 3 37° C 0.012

Tubo 4 100° C 0.09

Figura 6. Efecto  de la temperatura en la actividad enzimática

Efecto del pH:

Se calculó la absorbancia a 660 nm de cada batería en el espectrofotómetro.

(Tabla n°5)

Tabla n°5: Datos obtenidos de la absorbancia de la muestra a una misma

longitud de onda.

Muestra Absorbancia (660nm)

Tubo 1 0,479

Blanco 0,534
1

Tubo 2 0,394

Blanco 0,524
2

Tubo 3 0,340

Blanco 0,315
3
Posteriormente se calculó la actividad
enzimática con respecto al efecto del PH. (Tabla n°6)

Tabla n°6: Datos obtenidos de la actividad enzimática con respecto al PH.

Muestras Actividad enzimática pH

(mg/ml.min)

Tubo 1 0,0068 4.0 pH

Tubo 2 0,0166 6.9 Ph

Tubo 3 0 10 Ph
Efecto de la concentración de enzima:
En la experiencia 4 se realizó una batería, bajo efecto de la concentración de
enzimas, para luego medir sus absorbancias bajo una longitud de onda de 660
nm. (Tabla 7)

Tabla n°7: Datos obtenidos de la actividad enzimática con respecto al PH.

Efecto de la concentración de la enzima

Absorbancia Concentración (mg/ml)

Blanco 0.499 0.357

Tubo 1 0.391 0.279

Tubo 2 0.457 0.326

Tubo 3 0.318 0.227

Tubo 4 0.343 0.245

Tubo 5 0.136 0.097

Figura 7. Efecto  de la concentración de la enzima en la actividad enzimática

0.04
0.03
0.03
Actividad Enzimatica

0.02
0.02
0.01
0.01
0
0.05 0.1 0.15 0.2 0.25 0.3 0.35 0.4
-0.01
-0.01
-0.02

Concentración
Discusiones:

En el aumento de la concentración de ion cloruro, la actividad enzimática de la

α- amilasa fue disminuyendo. Se obtuvo un pico máximo a una concentración
de ion cloruro de 0 con un resultado de actividad enzimática de 0.65, por lo que
significa que la actividad enzimática disminuyó de manera inversa,
observándose una tendencia a la disminución de la actividad enzimática desde
dicho punto, como se muestra en la Figura 1. Esto coincide con lo establecido
por Vargas, (2000) el cual manifiesta que la presencia en la actividad
enzimática de la amilasa hace que esta se incremente pues necesita un tiempo
menor al del control para lograr el efecto acromático. Entonces, la presencia de
estos iones Na+ o Cl- pueden afectar la acción enzimática de amilasa. De igual
manera, al contrastar lo expuesto por Krüger, Stülke y Hecker, (1993) afirman
que la amilasa cataliza la hidrólisis al azar de enlaces  1-4 en la región central
de la cadena amilosa y amilopeptina, exceptuando moléculas cercanas a la
ramificación debido a la disminución general que experimenta la actividad
enzimática conforme vaya aumentando la concentración. Asimismo, Aragón y
Camus (2011) menciona que el ion cloruro influye en la sobretensión catódica
puesto que se comporta como un despolarizador catódico hasta que su
concentración actúe como factor que afecta la actividad enzimática.
Al aumentar la temperatura en la actividad enzimática de la α-amilasa, se
obtuvo en la curva su pico máximo a una temperatura de 37° C, significa que la
velocidad de reacción enzimática fue aumentando de manera directamente
proporcional con la temperatura, sin embargo, desde este punto hasta los
100°C observamos que la velocidad enzimática fue disminuyendo,, esto
concuerda con el trabajo realizado por Espinel, E. y López, E.(2009) quienes
sostienen que la velocidad de una reacción enzimática se incrementa al
aumentar la temperatura dentro de un determinado rango, alcanzando un valor
máximo denominado temperatura óptima, y a una temperatura superior a esta
la actividad enzimática disminuirá debido a que la enzima por su naturaleza
proteica se desnaturalizará. Del mismo modo nuestros resultados son
comparados con el trabajo de Tena, A. y Jorrín, N. (s.a) donde plantean que la
velocidad de una reacción enzimática varía al aumentar la temperatura y tal
dependencia refleja un doble efecto de la temperatura: positivo a bajos valores,
debido al incremento general que experimenta la velocidad de cualquier
reacción química al hacerlo la temperatura, y negativo a valores altos, debido a
la desnaturalización térmica del enzima.
Con el efecto del pH en la actividad enzimática se determinó que a un pH 6.9 la
enzima presentó mayor actividad, mientras que a un pH 4 la actividad fue
menor, mientras que a un pH 10 la actividad fue mayor que la anterior.
Precisamente, Voet (2006) sostiene que las proteínas poseen propiedades que
son muy sensibles al pH y que la mayoría de proteínas sólo son activas en un
estrecho intervalo de pH, entre 5 y 9. Para la enzima la amilasa de Penicillium
chrysogenum, Espinel, E. y López, E. (2009) sostienen que la actividad de la
enzima fue máxima actividad a  un pH 6,0.
El efecto de la concentración de enzimas en la actividad enzimática, refleja que
al agregar mayor cantidad de enzima se absorbe mayor cantidad de sustrato y
por ende mayor actividad enzimática tal como sostiene Espitia (2009), que si en
la reacción enzimática, si se incrementa la concentración de enzima, se forman
mayor cantidad de producto por unidad de tiempo. El incremento de la
velocidad de reacción es directamente proporcional al incremento en la
concentración de la enzima, siempre y cuando la cantidad de sustrato no sea
limitante, es decir, que el sustrato no llegue a agotarse.

El aumento en la velocidad de reacción se produce porque con temperaturas

más altas, existen más moléculas de sustrato con suficiente energía para
reaccionar; la disminución de la velocidad de la reacción es debida a la
desnaturalización de la enzima (la mayoría de las proteínas globulares se
desnaturalizan por encima de 60 - 70°C) (Benjamin, 2011).

El pH óptimo o intervalo de pH de cada enzima es diferente y cuando varía, la

conformación de la enzima se altera, produciéndose un cambio en el estado de
ionización de grupos del sitio activo y llegando a no ser funcional (Benjamin,
2011).
Recomendaciones

En esta práctica de laboratorio se reportaron una serie de incidentes, entre

ellos la contaminación del agua destilada de la pizeta al introducir la pipeta
dentro de éste. Para evitar esto se requiere el uso de un vaso de precipitado
para sacar la muestra de agua destilada y no afectar a otros grupos.

Otro incidente ocurrido en la práctica fue el ingreso de reactivo a la propipeta

debido a un mal uso de la misma, por ello se recomienda no hacer mucha
presión al momento de la absorción de reactivo para evitar dicho problema.

CUESTIONARIO

¿Por qué las enzimas reducen la energía de activación en una reacción

química?

La energía de activación es la cantidad de energía requerida para empujar a

los reactantes más allá de la barrera energética de modo que pueda iniciarse
en la parte más baja de la cuesta.

Las barreras para algunas reacciones deben ser superadas ocasionalmente

para que las células lleven a cabo los procesos necesarios para la vida. El calor
acelera una reacción y permite que los reactivos logren el estado de transición
con mayor frecuencia. Una enzima cataliza una reacción disminuyendo la
barrera de energía de activación lo que permite que las moléculas de reactivo
absorben suficiente energía para alcanzar el estado de transición. Las enzimas
solo pueden acelerar las reacciones que de cualquier modo ocurrirán, pero esta
función facilita un metabolismo dinámico para digerir el tráfico químico de la
célula en forma ligera a través de ella. Las enzimas aceleran las reacciones al
reducir la energía de activación, de esta forma un mayor número de moléculas
de los sustratos tendrán la energía suficiente para unirse y formar un producto.
(Robert K .2002)

Se requiere una mayor energía de activación y lleva mayor tiempo obtener los
productos a partir de los sustratos. Las enzimas reducen la energía de
activación y permite que la reacción química se produzca a velocidades
compatibles con la actividad celular.
2. ¿Explique la gráfica de los dobles recíprocos en función a la
ecuación de Michaelis - Menten?

En un estudio de cinética de enzimas se mide la actividad enzimática en

términos de producto formado por minuto, a distintas concentraciones de
sustrato. Si la actividad es graficada en términos de la concentración inicial del
sustrato versus el producto generado en un lapso de tiempo (velocidad de
reacción), la curva generada es la gráfica Michaelis-Menten. La ecuación que
describe todos los puntos en esa línea viene dada por actividad enzimática. La
forma lineal de la ecuación de Michaelis-Menten se conoce como gráfica de
Lineweaver-Burk la ventaja es que se pueden obtener valore estadísticamente
significativos de Km (constante de michaelis) y Vmax a partir de seis u ocho
datos.

Esta gráfica se usa para determinar la actividad enzimática vs concentración de

sustrato. Para ello se calcula el recíproco de la ecuación de M-M . (Peter J.
Kennelly y Victor W. 2012)

1/v = 1/Vmax + Km/Vmax × 1/[S]

3. El 50% del azúcar libre del maíz, se convierte en almidón de 24 a

48hrs después de la cosecha, perdiendo su sabor dulce y característico.
Sin embargo el sabor se podría mantener, si las mazorcas se sumergen
en agua hirviendo, para luego enfriarse en agua fría. Explique el
mecanismo bioquímico de este proceso.

Las membranas celulares en las hojas son sensibles a los cambios de

temperatura. El Instituto Nacional de Investigaciones Agrícolas de Venezuela,
mediante el CENIAP, presentó un estudio sobre el maíz, donde afirma que en
el caso del maíz dulce, la semilla y el fruto son arrugadas, pues tienen bajo
contenido de almidón y como consecuencia su tamaño va por debajo del maíz
normal. De la misma forma se menciona que las altas temperaturas tienden a
convertir el azúcar del grano en almidón; razón por la cual, el maíz dulce no ha
tenido demasiado éxito en los países tropicales. (CENIAP, 2001)
De esta forma al sumergir las mazorcas en agua hirviendo y enfriarlo con agua
fría, la variación de la temperatura es lo suficientemente rápida como para no
causar cambios en la concentración de azúcar de las mazorcas. Las bajas
temperaturas sellan las membranas de las células y logran mantener el sabor
dulce.

Referencias Bibliográficas:

Kimball, J.W, (1978) Biología. 4ta Edición. Ciudad de México. Fondo Educativo
Interameric) Selección y evaluación de bacteria del género
bacillusproductora de amilasa en cultivo sumergido.
Espinel, E; López, E. (2009) Purificación y caracterización de α-amilasa
dePenicillium Commune producida mediante fermentación en fase
sólida.Orgánica y Bioquímica
Neil A. Campbell, Jane B. Reece. 2007. Biología. Efecto de las condiciones
locales sobre la actividad enzimática. 7º edición. Editorial Médica
Panamericana: España. p- 154
Espitia, L. C. (2009) Determinación de concentración de alfa y beta amilasas
comerciales en la producción de etanol a partir almidón de cebada
empleando saccharomyces cerevisiae. Tesis de maestria.  Esapaña,
Pontificia Universidad Javeriana
Guadarrama,A; Orozco, J; Morales, M. Obtención de α-amilasa a partir de
Aspergillus oryzae. Ciudad de México. Universidad Autónoma del
Estado de México.
Krüger, S; Stülke, J; Hecker, M. (1993) Catabolite repression of beta-
glucanase synthesis in Bacillus subtilis. Alemania.  Ernst Moritz Arndt
Universität Greifswald.
LEHNINGER, A., NELSON, D. (2006) Bioquímica: Principios de Bioquímica
4º Edición, Ed. Omega, Barcelona.
Tena, A. M; Jorrín, N. J. (s.a) Estudio cinético de la actividad invertasa de
levadura de panadería. [on line], p.1-14.
Vargas, S. L. (2000) Selección y evaluacion de bacteria del genero
bacillusproductora de amilasa en cultivo sumergido. Tesis de
maestria. UNMSM.
Voet, D; Voet, J. G., (2006) Bioquímica. 3ra Edición. Ed. Médica
Panamericana.
Voet, D; Voet, J. G.; Pratt, C. W., (2009) Fundamentos de Bioquímica: La
vida a nivel molecular. 2da Edición. Argentina, Ed. Médica
Panamericana.
Benjamin, F. (2011), Las Enzimas, Tesis Doctoral, Capítulo 1, P 11-12.
Robert K. Murray, M. P., 2002. Harper: Bioquímica Ilustrada. 29th ed.
s.l.:LANGER.

Peter J. Kennelly y Victor W. Rodwell. 2012. Harper Bioquímica ilustrada.

Enzimas: mecanismo de acción. 29º Edición. Editorial Mexicana:
México D, F. p- 5