Laboratorio de Microbiología.

LABORATORIO N°3.
PREPARACION DE MEDIOS DE CULTIVOS

Padilla Reynero Diana, Seguanes Domínguez Andrea Lucia, Sotomayor

Jiménez Katry Mileth, Sierra Pestana Eiris Patricia, Vega Regino
Valentina.

Facultad de Ingeniería
Ingeniería de Alimentos – Sede Berástegui
Universidad de Córdoba, Montería

RESUMEN

La preparación de medios de cultivo son uno de los métodos más usados para el análisis
de microorganismos con varios fines, como el de multiplicación, identificación o
examen microbiológico entre otros, y puede ofrecer información valiosa sobre los
mismos sí se realiza de manera adecuada e higiénica para evitar la contaminación del
medio y la alteración de los resultados, Fue una práctica muy interesante, sobre todo ver
como las bacterias se van reproduciendo y creciendo.

INTRODUCCIÓN. excepciones no tiene efecto sobre el crecimiento de

las bacterias y no es atacado por aquellas que crecen
Uno de los sistemas más importantes para la en él.
identificación de microorganismos es observar su Los medios de cultivo según su estado físico, que
crecimiento en sustancias alimenticias artificiales depende de la concentración de agar en la
preparadas en el laboratorio composición del medio de cultivo, se clasifican en:
Un medio de cultivo es un sustrato estéril que
contiene elementos inhibitorios o nutricionales que ➢ Sólidos: 1 – 2% agar
permiten o regulan el crecimiento y la
multiplicación bacteriana; el crecimiento de los ➢ Semisólidos: 0,2 - 0,5% agar
microorganismos es el cultivo.
Un medio de cultivo debe contener los nutrientes y ➢ Líquidos: 0%
factores de crecimiento necesarios y debe estar
exento de todo microorganismo contaminante.
Para que las bacterias crezcan adecuadamente en un
medio de cultivo artificial debe reunir una serie de
condiciones como son: temperatura, grado de De acuerdo con su composición bioquímica pueden
humedad y presión de oxígeno adecuado, así como ser; selectivos, diferenciales, de identificación y de
un grado correcto de acidez o alcalinidad; el agar es transporte; y de acuerdo con las composiciones
un elemento solidificante muy empleado para la nutricionales simples, de enriquecimiento y
preparación de medios de cultivo, se licúa enriquecidos.
completamente a la temperatura del agua hirviendo
y se solidifica al enfriarse a 40 grados con mínimas
OBJETIVOS.
GENERALES: Preparar medio de cultivo para:
• Sólidos: XLD
• Semisólido: Tetrationato
• Inclinado: Kia
ESPECÍFICOS:
• Familiarizarse con las técnicas básicas
utilizadas en el laboratorio de microbiología,
preparación de medios de cultivo.
• Emplear las técnicas y cantidades adecuadas
para la preparación de los medios de cultivo.
• Aplicar y practicar la preparación de
cualquier medio de cultivo utilizado en
microbiología.
1. METODOLOGÍA.
Los medios de cultivo son una mezcla compuesta
de nutrientes que, en concentraciones adecuadas y
en condiciones físicas óptimas, permiten el
crecimiento de los microorganismos. Estos medios
son esenciales en el Laboratorio de Microbiología
por lo que un control en su fabricación, preparación,
conservación y uso asegura la exactitud,
confiabilidad y reproducibilidad de los resultados
obtenidos.
Un medio de cultivo consta de un gel o una
solución que cuenta con los nutrientes necesarios
para permitir, en condiciones favorables de pH y
temperatura, el crecimiento de virus,
microorganismos, células, tejidos vegetales o
incluso pequeñas plantas.
Por otro lado, existen diferentes tipos de medios de
cultivo que cuentan con una elaboración ya sea,
sólido, líquido, semisólido e inclinados. En este
caso, solo trabajamos con medios sólidos,
semisólidos e inclinados, de manera breve se
describirán.
• Medios solidos: se utilizan para obtener
bacterias aisladas por la formación de
colonias sobre la superficie del medio de
cultivo y para el estudio de la morfología de
las colonias, lo que no permiten los medios
líquidos. Se diferencian porque tienen una
sustancia de sostén, que puede ser agaragar.
• Medios semisólidos: se utilizan para estudiar
la motilidad de las bacterias. Tienen un
menor porcentaje de agar, por lo que no
solidifican totalmente a la temperatura
ambiente.
• Medios inclinados: Los medios de agar
inclinado pueden usarse para cultivar e
identificar células bacterianas. Es difícil
intentar identificar bacterias desde una
muestra muy grande, que estas son pequeñas
y pueden ser difíciles de encontrar
2
3
 2. MATERIALES Y MÉTODOS 9. Si son medios para pruebas bioquímicas, se
sirven en tubos taparrosca 8 ml del medio de cultivo
MATERIALES
➢ Mechero 10. Esterilizar en autoclave a 121ºC por 15 minutos
➢ Incubadora a 15 lb/plg2 de presión
➢ Medios de cultivo
11. Colocar los tubos en forma inclinada (Pruebas
➢ Frascos tapa rosca de 100 ml
bioquímicas) y dejar que solidifiquen
➢ Cucharas estériles
➢ Pipetas 12. Enfriar a 45ºC y verter en las cajas de Petri
➢ Autoclaves estériles
➢ Hornos
13. Dejar solidificar
➢ Tubos taparrosca
➢ Cajas de Petri estériles 14. Realizar prueba de esterilidad, con incubación a
➢ Nevera 37ºC por 24 horas
15. Si no crece ningún tipo de microorganismos
METODOS
almacenar en refrigeración.
En la preparación de medios de cultivo siempre es
✓ Medios de Cultivo Semisólido
recomendable y se incluye como una regla básica la
de leer las instrucciones de las etiquetas de los 1. Seguir los pasos del 1-8 de los medios de cultivo
medios de cultivo, por ello no se recomienda re- solidos mencionados anteriormente
envasar los medios sino, mantenerlos en los
2. Verter en tubos tapa rosca de 3 a 6 ml del medio
recipientes originales. Para lograr una preparación
adecuada de los medios de cultivo. Es 3. Esterilizar en autoclave a 121ºC por 15 minutos a
recomendable seguir las siguientes instrucciones 15 lb/plg2 de presión
para cada medio de cultivo:
4. Enfriar y dejar solidificar
✓ Medios de Cultivo Sólidos
5. Almacenar en refrigeración
1. Verificar que todos los materiales estén limpios y
que se usen frascos de vidrio por ser resistentes y
✓ Medios de Cultivo Inclinado
poco reactivos.
1. Seguir los pasos del 1-8 de los medios de cultivo
2. Leer la etiqueta del material que va a preparar
solidos mencionados anteriormente
3. Pesar la cantidad indicada según señala la
2. Servir en tubos tapa rosca de 5 a 10 ml del medio
etiqueta
3. Esterilizar en autoclave a 121ºC por 15 minutos a
4. Medir la cantidad de agua la cual debe ser
15 lb/plg2 de presión
desmineralizada, de reacción neutra y en lo posible
libre de gérmenes 4. Dejar enfriar y almacenar en refrigeración
5. Adicionar la primera mitad de agua y agitar hasta
que se disuelva 3. RESULTADOS E
INTERPRETACIÓN
6. Adicionar la segunda mitad y terminar la
✓ KIA
disolución
Es un medio desarrollado para diferenciar
7. Homogenizar al calor en baño de María (calor no
enterobacterias (fermentación de glucosa y lactosa,
excesivo) por 15 minutos
producción de H2S) de siembra para la preparación
8. Agitar constantemente evitando formar espuma
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de los tubos, dejando solidificar de forma inclinada
con pico corto. Inocular la muestra con asa de
platino, en zigzag sobre la superficie inclinada y en
picadura hasta el fondo. Incubar a 37 ºC aprox.,
durante 24-48 horas.
Se obtuvieron resultados donde la superficie o
profundidad alcalinas es de color rojo /fondo rojo
obteniendo como resultado que el microorganismo
no presenta fermentación de la Glucosa y no se
presentaron burbujas esto quiere decir que el
microorganismo no produce gas.
✓ XLD
Una vez completado el período de incubación,
observamos el desarrollo bacteriano y verificamos
lo siguiente:
Las bacterias fermentadoras de xilosa, lactosa y
sacarosa produjeron acidificación del medio de
cultivo, provocando un viraje del color desde el rojo
al amarillo.
Las bacterias que decarboxilan la L-lisina generan
cadaverina y produciendo una zona rojo púrpura por
efecto de la elevación del pH.
✓ TETRATIONATO
El caldo tetrationato tiene un estricto control de
calidad a lo largo del proceso de producción. El
producto final tiene un cuidadoso control para
asegurar que cada lote llene las especificaciones del
medio: Color, consistencia, esterilidad, pH.
Apariencia, medio solido de color blanco debido a
la presencia de carbonato de calcio, Tiene partículas
pequeñas en suspensión de color blanco propias de
la presencia de carbonato de calcio ósea que
podemos decir que su transparencia no es total.
4. INVESTIGACIÓN
Fundamento de las cepas de microorganismos
sembradas y de los medios de cultivo preparados
FUNDAMENTO DE LAS CEPAS DE
MICROORGANISMOS SEMBRADAS:
XLD (XILOSA, LISINA, DESOXICOLATO):
(agar de xilosa, lisina, desoxicolato) es un medio
moderadamente selectivo y de diferenciación para
el aislamiento y la diferenciación de patógenos
entéricos gram negativos (Salmonella y Shigella) a
partir de muestras clínicas. Es adecuado en especial
para el aislamiento de la especie Shigella
XLD Agar es un medio selectivo y de
diferenciación. Contiene extracto de levadura como
fuente de nutrientes y vitaminas. Utiliza el
desoxicolato de sodio como agente selectivo y, por
consiguiente, inhibe los microorganismos gram
positivos. La xilosa se incorpora en el medio dado
que la fermentan prácticamente todos los entéricos,
excepto Shigella, y esta propiedad hace posible la
diferenciación de dicha especie. La lisina se incluye
para permitir la diferenciación del grupo Salmonella
de los organismos no patógenos, dado que, sin
lisina, Salmonella fermentaría rápidamente la xilosa
y no se distinguiría de las especies no patógenas.
Cuando la Salmonella agota el suministro de xilosa,
la lisina es atacada por la enzima lisina
descarboxilasa, lo que genera un cambio a un pH
alcalino que imita la reacción de Shigella. Para
evitar el cambio similar en los organismos
coliformes positivos a la lisina, se añaden lactosa y
sacarosa para producir ácido en exceso. Para
aumentar la capacidad de diferenciación de la
fórmula, se incluye un sistema indicador de H2S,
formado por tiosulfato sódico y citrato férrico
amónico, para la visualización del ácido sulfhídrico
producido, lo que origina la formación de colonias
con centros de color negro. Los organismos no
patógenos no productores de H2S no descarboxilan
la lisina; por tanto, la reacción ácida producida por
dichos organismos evita el oscurecimiento de las
colonias, lo que sucede sólo con pH alcalino o
neutro.
TETRATIONATO:
Medio de cultivo utilizado para el enriquecimiento
selectivo de Salmonella spp. a partir de heces,
alimentos y otros materiales de importancia
sanitaria. El caldo de tetrationato fue descrito en un
principio por Mueller, quien descubrió que el medio
inhibía selectivamente los organismos coliformes,
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lo que por consiguiente permitía el crecimiento de
los patógenos entéricos prácticamente sin
restricción.
El medio de cultivo contiene peptona que provee
los nutrientes necesarios para el desarrollo
bacteriano, y carbonato de calcio que neutraliza y
adsorbe metabolitos tóxicos. La selectividad está
dada por la presencia de sales biliares y tetrationato
(compuesto generado en el medio de cultivo al
reaccionar el tiosulfato de sodio con la solución
iodo-iodurada) que inhiben el desarrollo de
microorganismos Gram positivos y algunas
enterobacterias. Salmonella spp. contiene la enzima
tetrationato reductasa y puede crecer
satisfactoriamente en el medio de cultivo debido a
que no la afecta la toxicidad del tetrationato.
KIA (KLIGLER IRON AGAR):
El medio KIA es un medio de cultivo diferencial
para Enterobacterias. Permite detectar especies
fermentadoras de glucosa y lactosa, producción de
gas y producción de ácido sulfhídrico.
El medio se solidifica en forma inclinada
permitiendo tener dos cámaras de crecimiento: una
aeróbica, el pico de flauta y otra anaeróbica, el
fondo del tubo.
Permite un diagnóstico rápido orientativo del tipo
de enterobacteria aislado. Las enterobacterias más
patógenas no suelen fermentar (producir ácidos de)
la lactosa. Se detecta la producción de ácidos
(acompañada o no del desprendimiento de gases) de
glucosa o lactosa y producción de SH2.
FUNDAMENTO DE LOS MEDIOS DE
CULTIVO PREPARADOS:
MEDIOS SÓLIDOS: se utilizan para obtener
bacterias aisladas por la formación de colonias
sobre la superficie del medio de cultivo y para el
estudio de la morfología de las colonias, lo que no
permiten los medios líquidos. Se diferencian porque
tienen una sustancia de sostén, que puede ser
agaragar. - Ejemplo: Agar Común, Agar SS, Agar
Cerebro Corazón, Agar Saboureaud, El agar XLD
(Xilosa, Lisina, Desoxicolato) etc.
Este medio tiene generalmente agar–agar como
agente solidificante, espesante o gelificante. El
agaragar es una sustancia hidrofílica de carácter
coloidal procedente de diversas especies de algas
marinas, especialmente del género Gelidium, que
tiene la propiedad de formar un gel. Químicamente
el agaragar es un polisacárido de cadena larga,
dependiendo de su tamaño el poder gelificante. La
gelatina no puede reemplazar al agar en la
preparación de medios sólidos, ya que
descompuesta por muchos tipos de bacterias. Se
añade a los medios de cultivo para estudiar si las
bacterias son capaces de degradarla (presencia de
enzimas gelatinosas).
MEDIOS SEMISÓLIDOS: se utilizan para
estudiar la motilidad de las bacterias. Tienen un
menor porcentaje de agar, por lo que no solidifican
totalmente a la temperatura ambiente. - Ejemplo:
Agar MIO, Tetrationato, Agar SIM, entre otros.
Se manejan tubos sin inclinar. Se siembra por
picadura o punción utilizando un hilo. Este tipo de
medio contiene una proporción menor de agar que
los medios sólidos.
MEDIOS INCLINADOS: Es cuando se coloca en
un tubo de ensayo, el agar está en forma líquida,
Estos luego son colocados en ángulo para que se
enfríen y solidifiquen, creando una
superficie inclinada, o un agar inclinado.
Este medio puede usarse para cultivar e identificar
células bacterianas. Es difícil intentar identificar
bacterias desde una muestra muy grande, que estas
son pequeñas y pueden ser difíciles de encontrar. En
este caso se colocan 5 ml de medio de cultivo
fundido y estéril, se inclina el tubo y se deja enfriar,
ansa de punta: se pica con el ansa el cultivo a
sembrar y se introduce mediante punción en el
medio contenido en la parte inferior del tubo.
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 5. CONCLUSIONES

En el presente laboratorio de microbiología

referente a la práctica de medios de cultivo se
obtuvo conocimiento variado y relacionado con las
zonas de crecimiento de los microorganismos, así
mismo, se realizaron procedimientos básicos para
preparación de medios de cultivo existentes o
comunes en el curso de microbiología (medios
sólidos, semisólidos, inclinados y líquidos).

Por otro lado, se adquirieron conocimientos

relacionados con la practica desarrollada, de esta
manera, se puede mencionar que los medios son
sustratos o soluciones de nutrientes que logran
permitir el desarrollo de los microbios. Las
muestras deben de ser sembradas en un medio
elegido, de lo contrario los microorganismos no se
multiplicarán ni darán colonias.

Así pues, esta práctica es primordial para conocer

las condiciones iniciales y optimas de diversas
bacterias existentes, lo cual, nos ayuda a estudiarlas
desde las condiciones en donde estas se
desarrollaron observando las características propias
de los medios de cultivos ya sean, compactos,
líquidos o gelatinosos.

6. REFERENCIAS

[1] Microbiología/Medios de cultivo. (2021,

noviembre24). Wikilibros, https://es.wikibooks.org/w/index
.php?title=Microbiolog%C3%ADa/Medios_de_cultivo&ol
did=401016.

[2] S/f-b). Ucv.ve. Recuperado el 24 de octubre de

2022, de
http://www.ucv.ve/fileadmin/user_upload/facultad_
farmacia/catedraMicro/10_Preparaci%C3%B3n_de
_medios_de_cultivo.pdf