Microbiología Ambiental ESAM – FCAG – UNJBG - 2021

PREPARACIÓN DE MEDIOS DE CULTIVO Y ESTERILIZACIÓN

En microbiología, un cultivo es un método para la multiplicación de microorganismos, tales como bacterias ,

hongos y parásitos, en el que se prepara un medio óptimo para favorecer el proceso deseado. Un cultivo es
empleado como un método fundamental para el estudio de microorganismos que realizan diversos procesos
metabólicos.

Un medio de cultivo consta de un gel o una solución que cuenta con los nutrientes necesarios para
permitir, en condiciones favorables de pH y temperatura, el crecimiento de virus, microorganismos, células,
tejidos vegetales o incluso pequeñas plantas. Según lo que se quiera hacer crecer, el medio requerirá unas u otras
condiciones. Generalmente se presentan desecados en forma de polvo fino o granular antes de ser preparados; ya
preparados pueden encontrarse en estado sólido, semisólido o líquido.

El desarrollo adecuado de los microorganismos en un medio de cultivo se ve afectado por una serie de factores de
gran importancia como son:

disponibilidad de nutrientes adecuados Un medio de cultivo adecuado para la investigación microbiológica ha

de contener, como mínimo, C, N, S, P y sales inorgánicas. En muchos casos es necesario vitaminas y otros. A
menudo se añaden ciertos colorantes, como indicadores o inhibidores selectivos.

Consistencia del medio: Partiendo de un medio líquido podemos modificar su consistencia añadiendo productos
como albúmina, gelatina o agar, con lo que obtendríamos medios en estado semisólido o sólido.

Oxígeno y otros gases: Las bacterias pueden crecer con tensión de oxígeno normal. Otras obtienen el oxígeno de
variados sustratos. Los MOs anaerobios estrictos sólo se desarrollarán adecuadamente en una atmósfera sin
oxígeno ambiental. Los MOs microaerófilos crecen mejor en condiciones atmosféricas parcialmente anaerobias,
mientras los anaerobios facultativos tienen un metabolismo capaz de adaptarse a ambas condiciones.

Humedad: Un nivel mínimo de humedad, del medio y de la atmósfera, es imprescindible para las células
vegetativas. Hay que prever el mantenimiento de estas condiciones mínimas en las estufas de cultivo a 35-37ºC.
Luz: La mayoría de los MOs crecen mucho mejor en la oscuridad que en presencia de luz solar. Hay excepciones
evidentes como sería el caso de los microorganismos fotosintéticos.

pH: La [H+] es muy importante para el crecimiento de MOs. La mayoría se desarrollan mejor en medios con un
pH neutro, aunque los hay que requieren medios más o menos ácidos.

Temperatura: Los MOs mesófilos crecen entre 15 y 43ºC. Los psicrófilos crecen a 0ºC y los termófilos a 80ºC o
incluso a temperaturas superiores (hipertemófilos). Los patógenos humanos crecen alrededor de 37ºC, y los
saprófitos tienen rangos más amplios.

Esterilidad del medio: Todos los medios de cultivo han de estar perfectamente estériles para evitar
contaminaciones que puedan alterar, enmascarar o incluso impedir el crecimiento microbiano normal de los MOs
inoculados en dichos medios. El sistema clásico para esterilizar los medios de cultivo es el autoclave.

Los medios de cultivo se clasifican según su origen:

NATURALES: son los preparados a partir de sustancias naturales de origen animal o vegetal, extractos de tejidos
o infusiones y cuya composición química no se conoce exactamente.
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SINTÉTICOS: contienen una composición química definida cuali y cuantitativamente. Se utilizan para obtener
resultados reproducibles.

SEMISINTÉTICOS son los sintéticos a los que se les añaden factores de crecimiento bajo una forma de un
extracto orgánico complejo, como por ejemplo extracto de levadura.

Según su consistencia:

LÍQUIDOS: se denominan caldos y contienen los nutrientes en solución acuosa.

SÓLIDOS: se preparan añadiendo un agar a un medio líquido (caldo) a razón de 15g/litro. El agar es una
sustancia inerte polisacárida, que se extrae de las algas. Como esta sustancia no es digerida por las bacterias no
constituye ningún elemento nutritivo. Es vertido en placas de Petri o tubos de ensayo y presentan la posibilidad de
aislar y diferenciar bacterias.

SEMISÓLIDOS: contienen 7,5 g de agar /litro de caldo. Se utilizan para determinar la motilidad de las especies
en estudio.

Según su composición:

COMUNES O UNIVERSALES: su finalidad es el crecimiento de la mayor parte de los MOs poco existentes. Es
el medio más utilizado para mantener colonias microbianas. Ejm: agar común o caldo común.

ENRIQUECIDOS: están compuestos de un medio base al cual se le puede agregar un gran exceso de nutrientes
como suplementos nutritivos, Ejm: sangre, suero, líquido ascítico, etc. Se utiliza para MOs exigentes
nutricionalmente.

SELECTIVOS: son sólidos en los que la selectividad se consigue alterando las condiciones físicas del medio o
añadiendo o suprimiendo componentes químicos específicos con el fin de inhibir el crecimiento de especies
químicas cuyo crecimiento no interesa. Ejm: Agar salado-manitol o Chapman (permite el crecimiento de ciertos
estafilococos).

DIFERENCIALES: permiten distinguir entre varios géneros y especies de MOs. Ejm: El citrato de Simmons es
un medio cuya única fuente de carbono es el citrato sódico. A menudo la separación se basa en la diferencia de
color de las colonias aisladas, como en el agar con azul de metileno - eosina que permite diferenciar E. coli
(colonias oscuras y de brillo metálico) de Enterobacter aerogenes (colonias rosadas de centro azul sin brillo).

DE ENRIQUECIMIENTO: son medios líquidos que contienen un agente que inhibe las especies no deseadas
pero que favorece el crecimiento irrestricto del agente infeccioso. Ejm: Muller - Kauffman, permite el crecimiento
de Salmonella inhibiendo a su vez el de numerosos coliformes. El agua de peptona alcalina se utiliza para Vibrio
cholerae.

DE TRANSPORTE: son utilizados para asegurar la viabilidad de la bacteria sin multiplicación significativa de
los MOs desde el momento de su extracción hasta su posterior estudio. Se recomienda un límite de 2 h desde la
recolección de las muestras y su estudio en el laboratorio, Ejm: Stuart, Amies y Carey - Blair.
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OBJETIVO

 Conocer correctamente la preparación y esterilización de medios de cultivo.

 Explicar el concepto de esterilización y su aplicación en microbiología.
 Conocer el preparado correcto del material que se someterá a esterilización.

MATERIALES
Balanza, probeta, matraz, vasos de precipitados, bagueta, medios de cultivo deshidratados, cocina eléctrica.
Autoclave, pH-metro, incubadora.

PROCEDIMIENTO

A. PREPARACIÓN DE MEDIOS DE CULTIVO Y CONSERVACIÓN.

• Para la preparación de los medios de cultivo y los reactivos se utiliza únicamente agua destilada
desmineralizada con una calidad microbiológica y fisicoquímica adecuada.
• Los medios de cultivo y reactivos de preparan siguiendo las instrucciones del fabricante, de la norma o la
bibliografía correspondiente. Nunca debe prepararse medios a partir de ingredientes básicos si se dispone de
medios deshidratados adecuados.
• Se preparan los medios en recipientes de al menos el doble de volumen del medio que se va a preparar.
• Pesar la cantidad exacta del medio de cultivo deshidratado. Cerrar inmediatamente el frasco del medio de
cultivo.
• Disolver la porción pesada de acuerdo con las indicaciones del fabricante. Si es necesario calentar se debe
tener cuidado de no sobrecalentar.
• Los medios de cultivo se esterilizarán en autoclave de acuerdo a las siguientes instrucciones:
- Revisar que el nivel de agua destilada sobrepase la resistencia del equipo.
- Colocar la parrilla con los medios de cultivo a esterilizar dentro del autoclave y Conectarlo
- Cerrar la puerta y apretar las manijas de dos en dos en posición encontrada y esperar a que salga el vapor
de agua por el orificio purgador. Y después cerrarlo.
- Darle todas las condiciones y parámetros de esterilización.

B. PREPARACIÓN DE MEDIOS DE CULTIVO EN PLACAS DE PETRI Y TUBOS DE ENSAYO

• Los tubos de ensayo con medios de cultivo solido deben colocarse en superficie inclinada de tal forma que el
medio se solidifique inclinado
• Dejar que los medios de cultivo en matraces que se han sacado del autoclave se enfríen a una temperatura de
40 a 50 °C, que coincida con la posibilidad de sostener el matraz en la palma de la mano sin sentir un calor
excesivo.
• Cerca del mechero servir el medio del cultivo contenido en el matraz, en un volumen aproximado de 15 ml,
todo esto en una zona aséptica cerca del mechero o en una campana de flujo laminar.
• Dejar que se solidifiquen los medios, por lo menos 30 minutos, y posteriormente envolver las cajas de Petri
cuidadosamente con papel craf o estarza y acomodarlas en forma invertida en bolsas de plástico limpias.
• Guardarlas en refrigeración hasta 24 horas antes de utilizarlas.

C. ALMACENAMIENTO DE MEDIOS DE CULTIVO PREPARADOS

• Los medios de cultivo se prepararán en lotes que se utilizarán en menos de una semana. Sin embargo, cuando
se preparan en tubos de tapa rosca estos se pueden guardan hasta tres meses. La tabla I recoge los límites de
tiempo para la manipulación de los medios preparados
• El personal responsable debe colocar una etiqueta en los medios de cultivo preparados indicando el tiempo de
conservación.
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• Los medios se mantendrán protegidos de la luz solar directa para evitar su contaminación y evaporación
excesiva.
• Los medios líquidos contenidos en tubos de fermentación, si se guardan en refrigeración o incluso a
temperaturas moderadamente bajas, pueden disolver una cantidad de aire suficiente para producir burbujas en
el tubo tras la incubación a 35°C. Por tanto, todos los tubos de fermentación que hayan estado guardados a
baja temperatura, se incubaran durante una noche antes de utilizarlos, y se comprobará que no existen falsos
positivos debido a burbujas de gas.
• Los tubos de fermentación pueden guardarse a una temperatura alrededor de 25°C; sin embargo, como en estas
condiciones la evaporación puede ser rápida y dar lugar a importantes alteraciones de la concentración de los
ingredientes, no deberán permanecer a esta temperatura más de una semana. La comprobación de la pérdida de
humedad en los tubos con caldo se realizará marcando el nivel original en varios tubos de cada lote para
comprobar si desciende.
• Cuando la perdida calculada supere el 10 % (1mL), se rechazarán los tubos.
Medio Tiempo de mantenimiento
Filtro de membrana (FM) Medio líquido en frascos de tapa rosca a 4°C. 96 horas
Agar FM en placas con cubierta de cierre hermético a 4°C. 2 semanas
Agar o medio líquido en tubos de tapón flojo a 4°C 1 semana
Agar o caldo en tubos de cierre hermético tapa rosca a 4°C. 1 semana
Placas con agar vertido con cubiertas flojas en bolsas de 2 semanas
plástico selladas a 4°C.
Grandes volúmenes de agar en frasco o botella de cierre 3 meses.
Hermético, tapa rosca a 4°C.