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FACULTAD DE AGRONOMA UNICA
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CURSO : FITOPATALOGA GENERAL
DOCENTE : ING. JUAN TEJADA
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HINOJOZA
SEMESTRE : 3 AO - V CICLO A

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ESTUDIANTE: MAVILA PEA, DAVID

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 PREPARACIN DE MEDIOS DE CULTIVO

I. INTRODUCCIN

En el diagnstico de las enfermedades vegetales, el trabajo de laboratorio es de suma

importancia debido a que ah se efecta la identificacin del agente causal, lo que
posibilita la aplicacin de los mtodos de control ms adecuados. El proceso de
identificacin de un patgeno requiere el aislamiento del mismo, para lo que es
necesaria la elaboracin de medios de cultivo que permitan su desarrollo.

Los medios de cultivo son una mezcla de nutrientes que, en concentraciones

adecuadas y en condiciones fsicas ptimas, permiten el crecimiento de los
microorganismos. Estos medios son esenciales en el Laboratorio de Fitopatologa por
lo que un control en su fabricacin, preparacin, conservacin y uso, asegura la
exactitud, confiabilidad y reproducibilidad de los resultados obtenidos.

En los laboratorios de fitopatologa se utilizan diferentes tipos de medios de cultivo

que pueden ser preparados en forma lquida o en forma slida. Usualmente para
preparar un medio slido, se parte de un medio lquido al que se le aade un agente
solidificante como el agar, la gelatina o la slicagel.

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 PREPARACIN DE MEDIOS DE CULTIVO

II. OBJETIVOS

- Aprender las tcnicas de preparacin de diferentes medios de cultivo

- Desarrollar ciertas habilidades empleadas en fitopatologa para el cultivo y la
manipulacin de microorganismos en condiciones de esterilidad.
- Conocer el adecuado manejo del microscopio ptico para la visualizacin de
microorganismos, equipo base para la realizacin de esta prctica.
- Aprender tcnicas, mtodos de preparacin y uso de medios de cultivo para
el desarrollo de microorganismos presentes en el ambiente, suelo, aire y
agua, para poderlos estudiar, diferenciar y clasificar

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 PREPARACIN DE MEDIOS DE CULTIVO

III. MARCO TERICO

LOS HONGOS FITOPATOGENOS

Los hongos y las bacterias son los dos principales grupos de organismos cuya forma
de vida predominante es saprofita y que obtienen sus nutrientes por la secrecin de
enzimas extracelulares en el medio en que se desarrollan. En la mayora de los casos,
son incapaces de atacar a organismos vivos debido a la presencia de barreras fsicas
o qumicas. Sin embargo, algunos han superado esas barreras y pueden atacar a
plantas o animales vivos. Los hongos son quiz an los fitopatgenos ms
importantes, aunque con el desarrollo de fungicidas eficientes y variedades
resistentes estn adquiriendo una importancia similar a los virus, que rara vez pueden
controlarse mediante cualquier mtodo, (Manners, 1996).

REPRODUCCION
Los hongos se reproducen principalmente mediante esporas. Las esporas son
estructuras reproductoras o especializadas para la propagacin del hongo, que
constan de una o varias clulas. Estas estructuras pueden formarse asexualmente
(mediante la separacin de pequeos fragmentos del micelio en esporas) o ser el
resultado de un proceso sexual. (Agrios, 2005).
En la mayora de los hongos, los gametos masculino y femenino se forman en un
mismo micelio (como es el caso de los hongos hermafroditas). Cuando los gametos
masculinos fecundan a los femeninos del mismo micelio, al hongo se le denomina
homotlico. Sin embargo, en la mayora de los casos, los gametos masculinos
fecundan nicamente a los gametos femeninos de otro micelio sexualmente
compatible por lo que se dice que el hongo es heterotlico, (Agrios, 2005).

AISLAMIENTO
En la naturaleza abundan los microorganismos que se desarrollan estrechamente
relacionados entre s, de manera que encontramos bacterias, hongos y otros
organismos de muy diversos tipos, tanto de vida libre como parsitos. Para poder
estudiarlos y conocerlos se deben cultivar en medios adecuados aislndolos del suelo
o de partes vegetales enfermas.

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A partir de la primera muestra que se coloca en un medio de cultivo, se obtiene un

cultivo mixto del que se deben tomar nuevas muestras para realizar otros cultivos,
seleccionando las diferentes colonias hasta lograr que en el medio se desarrolle un
solo tipo de organismo, consiguiendo de esta forma un cultivo puro. . (Manners, 1996).

MEDIOS DE CULTIVO
Los medios de cultivo son mezclas de sustancias nutritivas que se utilizan para el
aislamiento, determinacin, desarrollo, reproduccin e identificacin de aquellos
organismos productores de enfermedades de las plantas, que se comportan como
parsitos facultativos.

Para lograr el desarrollo y reproduccin de las diferentes especies fitopatgenas, los

medios de cultivo deben reunir caractersticas especiales, tomando en cuenta los
factores que se mencionan a continuacin:

- Nutrientes. En el medio de cultivo debern estar presentes elementos

nutricionales tales como fuentes de carbono, nitrgeno, macroelementos (P, K,
Mg, Ca), microelementos (Fe, Zn, Mn, Cu, Mo), vitaminas, etc.
- Humedad. Deber proporcionarse una humedad relativa favorable a los
fitopatgenos que se desee cultivar. Por lo general requieren del 50 % o ms.
- Temperatura. Los valores ptimos de sta son muy variables para cada
especie, pero la mayora de ellas pueden crecer en un rango de 20 a 25 C.
Este es un factor determinante para el desarrollo y la reproduccin.
- pH. Tambin en este caso los valores ptimos son muy variables, pero en
general los hongos fitopatgenos se desarrollan y reproducen mejor en pH
ligeramente cidos, mientras que las bacterias prefieren los ligeramente
alcalinos.
- Luz. Este factor en algunos casos afecta la reproduccin de los hongos
fitopatgenos, pero en general no influye.
- Asepsia. Los medios de cultivo deben esterilizarse y mantenerse a salvo de
cualquier contaminacin por otros microorganismos.

Generalmente se prefiere el uso de los medios de cultivo deshidratados porque,

adems de simplificar el trabajo, con ellos se tiene mayor probabilidad de obtener
resultados reproducibles. (Mayea y Padrn, 1983).

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 PREPARACIN DE MEDIOS DE CULTIVO

ALMACENAMIENTO DE LOS MEDIOS DE CULTIVO

Los medios de cultivo deshidratados se deben almacenar en envases sellados bajo
las condiciones que seale el fabricante. Generalmente se almacenan en un lugar
fresco (entre 15 y 25), con poca humedad y protegidos de la luz solar directa. Nunca
se deben almacenar cerca de autoclaves, hornos, ni otra fuente de calor o vapor.

Una vez que el medio de cultivo ha sido preparado y esterilizado, puede almacenarse
a temperatura ambiente por un periodo mximo de 2 semanas protegido de la luz, o
por periodos mayores a 12 -15C. Los medios de cultivo se deben mantener en
recipientes bien cerrados para evitar su deshidratacin y cuando se usa tapn de
algodn, se debe colocar por encima una envoltura de papel (Craft).

IV. MATERIALES Y PROCEDIMIENTO

IV.1. MATERIALES.

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 PREPARACIN DE MEDIOS DE CULTIVO

TUBOS DE ERLENMEYE PLACAS

ENSAYO R PETRI

PIPETAS MECHERO DE PROBETAS

VOLUMETRICAS ALCOHOL

VASOS DE KIT DE
MATRAZ PRECIPITADO
AFORADO DISECCIN
S

IV.2. PROCEDIMIENTO

1. PREPARACIN DE LOS MEDIOS DE CULTIVO.

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 PREPARACIN DE MEDIOS DE CULTIVO

Cada equipo elaborar el medio de cultivo que le indique el profesor, de acuerdo con
las necesidades de su Proyecto Semestral.

2. VACIADO DEL MEDIO DE CULTIVO A LAS PLACAS PETRI.

Para llenar las placas petri con el medio de cultivo de una manera asptica se debe

- Limpiar la mesa con una solucin de cloro 5:1 en agua.

- Colocar y encender el mechero o lmpara de alcohol.
- Poner las cajas y recipientes con el medio sobre la mesa.
- Tomar el recipiente con el medio de cultivo y destapando con la mano
izquierda, pasar la boca del recipiente sobre la llama del mechero. Conservar
el tapn en la misma mano con que se sostiene el recipiente del medio.
- Tomar con la mano derecha una caja de PETRI y levantar la tapa lo suficiente
para verter el medio de cultivo. Vaciar en cada una de 10 a 12 mL.
- Colocar la tapa de la caja de PETRI suavemente, y tapar el recipiente del
medio de cultivo.
- Distribuir de manera uniforme el medio con movimientos de rotacin.
- Colocar las cajas en una superficie horizontal y dejar solidificar.
- Una vez solidificado el medio, realizar pruebas de esterilidad por incubacin a
35 C durante 48 horas.

3. AISLAMIENTO
Todos los aislamientos deben hacerse en un medio estril, es decir, a la flama del
mechero, para evitar contaminaciones. Existen varias tcnicas de aislamiento. El
aislamiento que se va a llevar a cabo es el que utiliza las partes vegetales enfermas,
con sus tres variantes.

- Aislamiento directo. Si se observan las fructificaciones o el micelio en el

ejemplar enfermo, se toma una muestra de este material con una aguja de
diseccin estril y se coloca en directo sobre el medio de cultivo. Se incuba a
24 C y se observan resultados despus de 4 a 5 das.
- Partes vegetales en medio de cultivo. La porcin vegetal que muestra los
sntomas se desinfecta con una solucin de cloro (NaOCl) y agua destilada
estril 5:1. Se enjuaga con agua destilada estril y se coloca en cajas de Petri
con medio de cultivo. Se incuba a 24 C y se observan resultados despus de
cuatro a cinco das.

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- Cmara hmeda. Cuando las partes vegetales afectadas presentan micelio,

pero no hay fructificaciones, o cuando no se aprecia el crecimiento del
patgeno, se recurre al uso de la cmara hmeda. Se toma una porcin del
tejido enfermo y se desinfecta en una solucin de cloro (NaOCl) y agua
destilada estril 5:1. Se enjuaga con agua destilada estril y se coloca en cajas
de Petri con un papel filtro en su interior, previamente esterilizadas. Se
humedece con agua destilada estril y se tapa la caja Se incuba a 24 C y se
observan resultados despus de cuatro a cinco das.

V. DESARROLLO DEL TEMA

Entre los medios de cultivo de uso frecuente en Fitopatologa estn los siguientes:
- PDA (papa-dextrosa-agar)
- AN (agar nutritivo)
- HFA (harina de frijol-agar)

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- AVA (avena-agar)
- VFA (vainas de frijol-agar)
- AA (agua-agar)
- HMA (harina de maz-agar)
- JFA (jugo de frijol-agar)

1. AGAR - PAPA DEXTROSA. Es uno de los medios de mayor uso en los

estudios fitopatologicos ya que permite el crecimiento micelial de las mayora
de los microorganismos de diferentes grupos taxonmicos; en algunos casos
limita la esporulacin de algunos gneros por lo cual es necesario, esperar el
crecimiento micelial y luego usar medios que permitan el desarrollo
reproductivo del microorganismo en estudio.

COMPOSICION CANTIDAD
Papa 200 g
Dextrosa 20 g
Agar-Agar 20 g
Agua destilada 1000 ml

- Preparacin: Lavar las papas, cortarlas en cubos y hervirlas en agua

destilada por 10 a 20 minutos, colar, agregar el agar-agar y completar a 1 litro,
autoclavar a 121C por 15 min a 15 lbs de presin y servir.

2. AGAR AVENA (OMA-OATMEAL AGAR)

COMPOSICION CANTIDAD
Avena 30 g
Agar 15 g
Agua destilada 1000 ml

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- Preparacin: Hervir la avena durante 1 hora en un litro de agua, colar gasa

agregar el agar, completar el litro de agua, autoclavar a 121C por 15 min a
15 lbs de presin y servir.

3. AGAR AGUA (AA)

COMPOSICION CANTIDAD
Agar- Agar 15 g
Agua destilada 1000 ml
- Preparacin: Disolver el agar-agar en el agua, autoclavar a 121C por 15
min a 15 lbs de presin y servir.

4. AGAR HARINA DE MAIZ

COMPOSICION CANTIDAD
Agar harina de maz 1000 ml
Piramicina 100 ppm
Penicilina G* 50 ppm
Sulfato de polimixina B 50 ppm
- Preparacin: Disolver la harina de maz, en un litro de agua destilada,
adicionar el agar, mezclar bien, autoclavar a 121C 15 min 15 lbs de
presin. Disolver los antibiticos en agua destilada estril y aadir despus
de autoclavar el medio.

5. AGAR PAPA ZANAHORIA

COMPOSICION CANTIDAD
Papa rallada 20 g
Zanahoria rallada 20 g
Agar-Agar 20 g

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Agua destilada 1000 ml

- Preparacin: Hervir la papa y la zanahoria rayada en el agua destilada
durante 1 hora, colar, agregar el agar, autoclavar a 121C por 15 min a 15
lbs de presin y servir.

6. AGAR GARBANZO
COMPOSICION CANTIDAD
Semillas de garbanzo 250 g
Sucrosa 20 g
Agar 15 g
- Preparacin: Lavar las semillas de garbanzo (Cicer arietinum) en agua
potable por una hora, remojarlas en agua destilada de la noche a la
maana. Eliminar el agua y triturar las semillas. Agregar 500 ml de agua y
llevar a ebullicin por una hora, filtrar a travs de una gasa. Separadamente
disolver el agar y la sucrosa, y aadirlos al filtrado. Ajustar el volumen a 1
litro. Mezclar bien, autoclavar a 121C 15 min 15 lbs de presin y servir.

7. AGAR FRIJOL
COMPOSICION CANTIDAD
Semillas de frjol (Phaseolus vulgaris) 30 g
Agar 20 g
Agua 1L
- Preparacin: Tomar las semillas de frjol colocarlas en el aguas detilada a
calentar por 10 a 20 minutos, filtar con gasa y agregar el extracto de las
semillas en el litro de agua destilada con el agar, calentar hasta disolver
autoclavar a 121C 15 min 15 lbs de presin y servir.

VI. CONCLUSIONES

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Se determin la importancia que tiene los medios de cultivo en una

investigacin en el campo agrcola como en la medicina, industria alimentaria
ya que gracias a ello se puede hacer el aislamiento de microorganismos tanto
patgenos como benficos y as identificarlos para su posterior uso.

Se puede elaborar medios de cultivo de manera sencilla, siendo muy til para
el estudio de microorganismos debido a que en este tipo de medio se los
puede reproducir con facilidad.

Elaborar medios de cultivo resulta eficiente para la reproduccin y el posterior

aislamiento de alguna cepa de microorganismo que nos interese estudiar.

VII. LITERATURA CONSULTADA

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- Agrios, G. N. 2005. Plant pathology. 5th ed. Elsevier academic Press.

Amsterdam, Prctica 2 Boston, Heidelberg, London, New York, Oxford,
Paris, San Diego, san Francisco, Singapore, Sydney, Tokyo. 992 pp.

- Clavell, L.; Pedrique de Aulacio, M. 1992. Microbiologa. Manual de

Mtodos Generales (2da edicin). Facultad de Farmacia. Universidad
Central de Venezuela.

- Ortega, Y; Quevedo F. 1991. Garanta de la Calidad de los Laboratorios de

Microbiologa Alimentaria. Organizacin Panamericana de la Salud. Harla
S.A. Mxico D.F.

- Lecuona, R.E, ed. 1996. Microorganismos patgenos empleados en el

control microbiano de insectos plaga. Buenos Aires, 338 p.

- Monzn, A. 2001. Produccin, uso y control de calidad de hongos

entomopatgenos en Nicaragua. Manejo Integrado de Plagas. 63, 95 103.

- Prez, C.N. 2004. Manejo Ecolgico de Plagas. Centro de Estudios de

Desarrollo Agrario y Rural CEDAR.296 pp

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