LABORATORIO 7

Informe de laboratorio biología experimental

Alumna:

Código:

Profesor:

Eric Cosio

10 de julio de 2022

Reacción de la amilasa salival

 Índice de contenido:

1. Resumen........................................................................................................................3

2. Introducción y marco teórico.........................................................................................3

3. Materiales y método….................................................................................................6

4. Resultados y discusión................................................................................................9

5. Conclusiones.................................................................................................................13

6. Bibliografía..................................................................................................................14
1. Resumen:
El laboratorio abordó principalmente el tema de la reacción de la amilasa salival. El
objetivo principal de la experiencia fue conocer la linealidad de la actividad amilasa
respecto al tiempo y hallar la concentración de la glucosa(M) a partir de la degradación
del almidón por la acción de la amilasa. La primera parte consistió en crear una curva de
calibración, cuyos valores fueron extraídos a partir de la absorbancia de 5 viales que
contenía una mezcla de glucosa, agua y BCA, un reactivo usado para la cuantificación de
azúcares reductores. Luego, y a partir de lo anterior, se obtuvo una ecuación de ajuste
lineal, la cual se empleó para hallar la concentración de glucosa(M) de 5 viales, cuyo
contenido era la enzima amilasa, almidón y BCA, mediante el reemplazo de la
absorbancia. También se realizó un control de blancos en la segunda parte del laboratorio
al solo mezclar el polisacárido con agua filtrada. Por otra parte, los resultados mostraron
que, al degradarse el almidón en glucosa, y al reaccionar con el BCA, este reactivo cuyo
color es el verde se va a poner morado, lo cual es una señal que indica que mientras exista
más glucosa en la solución, el color será más oscuro, pues el reactivo reaccionará más.
Asimismo, se puede ver la linealidad de la actividad amilasa en el tiempo mediante la
gráfica concentración de glucosa vs tiempo, y absorbancia vs tiempo, donde se obtiene
que conforme aumenta la concentración de glucosa, aumenta la absorbancia mediante el
transcurso de los minutos, y se forma una recta.
Lo anterior fue de interés, pues reforzó los conocimientos adquiridos en el laboratorio 4.

2. Introducción y marco teórico:

Hay diversos tipos de carbohidratos que son clasificados de acuerdo a su estructura

química y tamaño. En este laboratorio se van utilizar dos tipos de carbohidratos,
uno de gran tamaño conocido como polisacárido, el almidón, el cual está formado
por unidades de glucosa, monosacáridos que constituyen el otro tipo de
carbohidrato a evaluar, unidas por enlaces glucosídicos α-1,4.

Según Pérez y Montaño (s/f), la digestión de estos carbohidratos en seres humanos

comienza en la boca, donde interviene principalmente la saliva, en la cual existe
una enzima denominada como α-amilasa, la cual es una molécula que sirve como
catalizador biológico y se encarga de descomponer el almidón y a otros
polisacáridos ingeridos en la dieta, hasta producir moléculas más pequeñas como
la glucosa, un azúcar reductor.

La importancia de los catalizadores biológicos recae en su capacidad para acelerar

la velocidad de una reacción bioquímica entre 1014 y 1020 veces, sin que estas
enzimas se consuman o se transformen durante la reacción, en donde las
constantes de equilibrio de las reacciones no son alteradas pues actúan reduciendo
la energía de activación sin afectar la energía libre total de la reacción.

Con el fin de poder comprender a mayor profundidad la función de la α-amilasa

salival, es vital explicar el proceso catalítico que se lleva a cabo mediante la
interacción entre reactantes, denominados sustratos (S), con la enzima la cual los
convierte en productos (P) por medio de interacciones específicas reversibles que
contribuyen a reducir la energía de activación de la reacción, este mecanismo es
conocido como de “doble desplazamiento”, donde hay un intermediario entre
sustrato y producto que está ligado covalentemente a la enzima.

La reacción enzimática catalizada por la α -amilasa es la hidrólisis aleatoria de los

enlaces glucosídicos α-1,4 internos en el almidón, el glucógeno y otros polímeros
de glucosa. Según Zakowski y Bruns (1985), la α-amilasa salival puede actuar casi
en cualquier enlace glucosídico interno α-1,4 y fragmentarlo de manera aleatoria,
excepto en el enlace terminal en el extremo reductor y el penúltimo enlace en el
extremo no reductor. Los productos de esta hidrólisis son maltosa, glucosa y
“dextrina límite”, aunque también se puede obtener glucosa bajo ciertas
condiciones.

Ahora, con el fin de analizar la linealidad de la actividad amilasa respecto al

tiempo, es imprescindible la cuantificación de azúcares reductores liberados
durante el análisis como lo señalan Gordon y Barrett (2002). Ello se establece
mediante un procedimiento colorimétrico, que está basado en la reducción de
Cu(II) a Cu(I) por aldosas y la complexación del Cu(I) por ácido bicinchonínico
(BCA) para dar un complejo coloreado de color violeta que da absorbancia
cuantitativa a cierta longitud de onda, lo cual se calcula mediante un
espectrofotómetro UV.
Según Fernández y Galván (s/f), el método analítico del ácido bicinconínico
(BCA) es comúnmente utilizado para las proteínas más que los carbohidratos; sin
embargo, el proceso es similar, pues este también está basado en la reducción del
cobre, solo que, por proteínas, donde el BCA es un compuesto capaz de formar un
complejo púrpura intenso con iones Cu+ en medio alcalino.

Para explicar el método del BCA en azúcares reductores como la glucosa, Luotola
y otros (2008) señalan que, en este caso, el Cu2+ oxida el azúcar bajo condiciones
alcalinas de ebullición. Durante este proceso el Cu2+ se reduce a Cu+ que
reacciona con ácido bicinconínico y forma un complejo coloreado cuya formación
se atribuye a la existencia de azúcar. A continuación, una imagen que explica el
proceso descrito anteriormente:

Nota: Método para la determinación de azúcares reductores usando la reducción

de Cu(II) a Cu (I) y su unión a un agente de color. Extraída de los archivos de la clase
teórica.

La absorbancia está relacionada directamente con la concentración de la sustancia

(c – mol/L) por la ley de Lambert-Beer (A = ε b c), donde b es la longitud del
camino óptico (cm), y ε es la absortividad molar. Verde, Vega, López y otros
(2013: 82). Lo anterior es importante para el desarrollo de este laboratorio, pues
indica que, si la concentración de glucosa es mayor, la absorbancia también lo será
y eso se verá reflejado en los gráficos posteriormente descritos en la parte de
resultados.
3. Materiales y Método:
3.1 Materiales:
Material de laboratorio
Físico Químico
 6 microtubos de  Reactivo de ácido
centrífuga de 1.5 y 2 bicinchonínico
mL  Agua destilada
 Micropipetas de 20, 200 y  Solución estándar de
1000 µL glucosa de 0.1 mg/mL
 Vortex  Suspensión de almidón al
 Bloque termostatizado 1 % (p/v) en 10 mM
 Baño termostático fosfato de potasio pH 7 y
 Espectrofotómetro UV- 10mM NaCl
visible conectado a una
laptop
 11 Viales de 4 mL
 Tubo de centrifuga de 15
mL
 Pipeta de 5 mL
 Pera pipeteadora
 Cronómetro
 Vaso precipitado
 Rotulador negro
(marcador)
 Puntas de pipeta

Material Biológico
 Preparado de amilasa salival cruda, centrifugada y filtrada estéril

3.2 Método:
En la primera parte de la práctica del laboratorio, se desarrolló la preparación de
curvas de calibración, todo el proceso se llevó a cabo en equipo:
I) Primero, y luego de familiarizarse con el manejo de las micropipetas, donde
se aprendió el uso adecuado de estas. Por ejemplo: Cada que se termina de
usar un reactivo, se expulsa la punta de la pipeta en un vaso precipitado y para
trabajar con el siguiente reactivo, se usa una nueva. Asimismo, nunca
debemos sostener estas incorrectamente de tal forma que la punta con el
líquido apunte hacia arriba.
II) Como segundo paso, se usó un marcador para rotular 5 viales de 4ml con los
números “0”, “10, “20”, “40” y “60”. Estos fueron colocados en una gradilla.
III) Posteriormente, se usó la micropipeta con el mayor rango permisible de µL
junto con la punta de pipeta correspondiente para preparar una mezcla de agua
filtrada y glucosa en los viales rotulados anteriormente. Ello se realizó de la
 siguiente forma: Al vial con el número “0”, se le echaron 1000 µL de agua
destilada. Al vial con el número “10”, se le echó 100 µL de glucosa y 900 µL
de agua destilada. Al vial con el número “20”, se le echó 200 µL de glucosa y
800 µL de agua destilada. Al vial con el número “40”, se le echó 400 µL de
glucosa y 600 µL de agua destilada. Al vial con el número “60”, se le echó
600 µL de glucosa y 400 µL de agua destilada. Como se puede notar, en cada
uno de los viales se tiene 1ml de solución de glucosa y agua destilada,
excepto en el primer vial.
IV) Luego, se usó una pera pipeteadora que se conectó a la pipeta de 5ml para
añadir 3ml de BCA en cada vial y todos estos se agitaron de arriba abajo para
que la mezcla se homogenice.
V) Después, se llevó cada vial a un bloque a 100°C para que sean incubados
durante 10 minutos. El tiempo se midió apenas se colocaron los viales en el
bloque, ello se llevó a cabo con un cronómetro.
VI) Luego del periodo de incubación, se dejaron enfriar los viales hasta que
alcanzaron la temperatura del ambiente.
VII) Finalmente, y luego de desarrollar la segunda parte de la práctica de
laboratorio, se midió la absorbancia de cada vial a 555nm en un
espectrofotómetro.

La segunda parte de la práctica del laboratorio, se desarrolló justo después de colocar

los viales de la primera parte en el bloque a 100°C:

a) Primero, con un rotulador negro se colocaron en las tapas de 6 microtubos de

centrífuga de 1.5 mL los números “0”, “5”, “10”, “20” y “30” y la letra “B”, en
ese orden y por cada microtubo. Estos fueron colocados en una gradilla.
Asimismo, se rotularon 6 viales de 4ml con los números “0”, “5”, “10”, “20” y
“30” y la letra “B
b) Posteriormente, se usó nuevamente la micropipeta con el mayor rango permisible
de µL junto con la punta de pipeta correspondiente para echar 500 µL del
preparado de amilasa a un tubo de centrifuga de 15ml.
c) Luego, y con la pipeta de 5ml conectada anteriormente a la pera pipeteadora, se
obtuvieron 4.5 ml de almidón, del recipiente donde estaba contenido, para luego
llevarlos al tubo de 15ml.
d) Este tubo fue traslado a un vortex por 5 segundos para que se agite la mezcla y
luego, se colocó en un baño termostático a 37°C.

e) Apenas realizado el paso anterior, se inició el cronómetro para contabilizar el

tiempo en el cual se recolectarían 500 µL de la mezcla del tubo de centrifuga para
posteriormente vaciarlos en los microtubos rotulados en la sección “a)”. Ello se
realizó de la siguiente forma: Luego de 5 minutos, se recolectaron los 500 µL, con
a una micropipeta, del tubo de centrifuga y se vaciaron en el microtubo con el
número “5”. Luego de 10 minutos, se recolectaron los 500 µL, con a una
micropipeta, del tubo de centrifuga y se vaciaron en el microtubo con el número
“10”. Luego de 20 minutos, se recolectaron los 500 µL, con a una micropipeta,
del tubo de centrifuga y se vaciaron en el microtubo con el número “20”. Luego
de 30 minutos, se recolectaron los 500 µL, con a una micropipeta, del tubo de
centrifuga y se vaciaron en el microtubo con el número “30”.
f) Una vez realizado el paso anterior, los microtubos fueron llevados al bloque
termostatizado a 100°C por 5 minutos.
g) Para trabajar con los microtubos rotulados con el número “0” y la letra “B”, se
realizó lo siguiente: Primero, al microtubo con la letra, se le echaron 900uL de
agua destilada y 100uL de almidón con una micropipeta. Al microtubo rotulado
con “0”, se le echaron 900uL de almidón con 100 uL de la solución del preparado
de amilasa. Luego se agitaron por 5 segundos en un vortex e inmediatamente se
colocaron en el mismo bloque termostatizado, con el que se trabajó en el paso
anterior, por 5 minutos.
h) Luego de la incubación de los microtubos por 5 minutos (paso descrito en “f)” y
“g)”), se tomaron alícuotas de 30 µL de cada uno de los microtubos con
micropipetas, con el rango permisible de µL que encajara con el buscado junto
con la punta de pipeta correspondiente, y se colocó estas en los viales de 4 ml que
fueron rotulados en “a)”.
i) Posteriormente, se añadieron 3 mL de reactivo de bicinchoninato a cada vial con
el uso de la pipeta de 5ml y la pera de esta.
j) Después, estos 6 viales fueron llevados al bloque a 100 °C por 10 minutos.
k) Luego del periodo de incubación, se dejaron enfriar los tubos hasta que
alcanzaron la temperatura del ambiente.
l) Finalmente, se midió la absorbancia de cada vial a 555nm en un espectrofotómetro.
4. Resultados y discusión:
1. Observando la concentración de glucosa conocida (μg/ml) y la absorbancia obtenida a
partir de espectrofotómetro UV-visible a 555nm.

Figura 1.1: Viales obtenidos, cuyo contenido es una mezcla de glucosa, agua destilada
y BCA, luego de enfriarse.

(Imagen referencial)
Tabla 1.1: Concentración de glucosa (μg/ml) y su absorbancia
Muestras Concentración de glucosa Absorbancia
(μg/ml)
0 0 0
C10 10 0,8363
C20 20 1,1371
C40 40 1,4541
C60 60 1,6436

Gráfico 1.1: Concentración de glucosa (μg/ml) vs absorbancia

Concentración de glucosa vs Absorbancia

2
1.
8
1.
Absorbancia

6
1.
4 y = 0.0242x + 0.3862
1. R² = 0.8129
2
1
0.
8
0 1 2 3 4 5 6 7
0.
0 0 0 0 0
Concentración de glucosa (μg/ml) 0 0
6
0.
4
0.
2 Ecuación obtenida  y = 0.0242x + 0.3862
0
2. Observando la absorbancia obtenida a partir de las muestras cuyo contenido es una
mezcla de glucosa, agua destilada y BCA.

Figura 2.1: Viales obtenidos luego de enfriarse.

(Imagen referencial)
Tabla 2.2: Absorbancia de los viales
Muestras Absorbancia Tiempo (minutos)
Blanco 0 -
m0 0 -
m05 0,2944 5
m10 0,4482 10
m20 0,8494 20
m30 1,0999 30
 Gráfico 2.1: Tiempo (minutos) vs absorbancia obtenida:

Tiempo (min.) vs
1. Absorbancia
2

1 y = 0.0331x + 0 .1355
R² = 0.990 4
Absorbancia

0.
8

0.
6

0.
4
0 5 1 1 2 2 3 3
0. 0 5 0 5 0 5
Tiempo
2
(min)
0
3. Observando la concentración de glucosa (μg/ml) obtenida después de reemplazar la
absorbancia en la fórmula hallada en el inciso “Gráfico 1.1” y la linealidad de la
actividad amilasa en el tiempo.

Tabla 3.1: Concentración de glucosa (μg/ml) obtenida, absorbancia y tiempo (min.).

Muestras Absorbancia Concentración de Tiempo
glucosa obtenida (minutos)
(μg/ml)
Blanco 0 - -
m0 0 - -
m05 0,2944 (Rango de error – No 5
se puede calcular)
m10 0,4482 2,5619 10
m20 0,8494 19,1404 20
m30 1,0999 29,4917 30

Tabla 3.2: Tiempo (minutos) vs concentración de glucosa (M) obtenida.

Muestras Concentración de glucosa Tiempo (minutos)
obtenida (M)
Blanco 0 -
m0 0 -
m5 (Rango de error – No se puede 5
calcular)
m10 0,1423 x 10-4 10
m20 1,0634 x 10-4 20
m30 1,6384 x 10-4 30
Gráfico 3.1: Tiempo (minutos) vs concentración de glucosa (M) obtenida.

Tiempo (min) vs Concentración

de glucosa (M)

Concentración de glucosa (M)

0.0001
8
0.0001
6
0.0001
4
0.0001 y = 7E-06x - 5E-05
2
R² = 0.9825
0.0001
0.0000
8
0.0000 0 5 1 1 2 2 3 3
6 0 5
Tiempo 0 5 0 5
0.0000 (minutos)
4
0.0000
2
En este experimento, primero se cuantificó la concentración de glucosa mediante el
0
uso de un espectrofotómetro para hallar la absorbancia. Se procedió a medir las
absorbancias de los viales 0, C10, C20, C40 y C60 en un espectrofotómetro a 555nm,
el contenido de los viales era agua destilada, glucosa y BCA, esta data se registra en
la tabla 1.1. Posteriormente y tras utilizar el software Excel y relacionar los datos
mediante un ajuste lineal, se obtuvo la ecuación que relacionaba la absorbancia con la
concentración de glucosa, y = 0.0242x + 0.3862, donde “y” era la absorbancia y “x”,
la concentración de glucosa. Esta ecuación fue útil para calcular la concentración de
glucosa en la segunda parte del experimento de las muestras m10, m20 y m30, tal y
como se evidencia en las tablas 3.1 y 3.2, mediante el despeje de la variable
concentración y el reemplazo de los valores de las absorbancias alcanzadas, que se
evidencian en la tabla 2.2, a una longitud de onda de 555 nm.

Por otra parte, podemos notar como la concentración de glucosa obtenida (μg/ml) no
se puede calcular para los 5 minutos, pues debido a la ecuación obtenida a partir de la
curva de calibración, al reemplazar el valor de la absorbancia en “Y”, el “X”
(concentración) es negativo. Ello se debe a, probablemente, una serie de errores
cometidos al momento de realizar la experiencia, pues este experimento es semi-
cuantitativo. Sin embargo, sí se puede apreciar debido a la imagen referencial en la
figura 2.1, por el color que el vial posee, que este sí tiene cierta concentración de
 glucosa, ello bajo el principio comentado en la introducción donde el almidón al
degradarse en glucosa, y al reaccionar con el BCA, forma un complejo con Cu+, y la
solución cambia de color (verde) a uno morado, lo que permite verificar
cualitativamente lo estipulado.

Como podemos observar a partir del gráfico 2.1, la absorbancia aumenta conforme
aumenta el tiempo y ello, al igual que el gráfico 3.1, permite comprobar la linealidad
de la actividad enzimática de la amilasa salival respecto al tiempo. Pues se aprecia
que cuanto mayor sea el tiempo que la amilasa salival reaccione con el almidón, la
enzima degradará más el polisacárido para así descomponerlo en glucosa y, por lo
tanto, la concentración de esta aumentará en la solución conforme avanza el tiempo,
ello se observa cuando se mezcla la solución con el BCA y el azúcar reductor
interactúa con este, provocando que el color morado se vuelve cada vez más intenso
después de 5, 10,20 y 30 minutos según se observa en la figura 2.1.

5. Conclusiones:

En la primera parte del laboratorio, se estableció una relación entre

absorbancia y concentración de glucosa mediante una curva de calibración,
donde se obtuvo una ecuación lineal que involucraba a la absorbancia y a la
concentración de glucosa. Mientras que en la segunda parte se mezcló amilasa
y almidón en un tubo de centrifuga, provocando que esta enzima degrade el
polisacárido, produciendo glucosa. Donde, y reemplazando los valores de
absorbancia, obtenidos a partir de someter las muestras a un
espectrofotómetro, en la curva de calibración, se evidenció que conforme
avanza el tiempo, se tendrá más cantidad de glucosa pues la amilasa y el
almidón habrán interactuado más. Ello muestra que efectivamente existe una
relación lineal de la actividad enzimática de la α-amilasa salival respecto al
tiempo.

Esta práctica de laboratorio fue satisfactoria, permitió la interacción del

estudiante con nuevos materiales como la micropipeta y profundizó el tema de
la degradación del almildón mediante la enzima α-amilasa salival. A pesar de
 ciertas dificultades referidas a la obtención de la curva de calibración en la
primera parte de la experiencia, pues la absorbancia de la muestra m05 no
pudo ser calculada de manera adecuada. Sin embargo, al final, se pudo obtener
una conclusión de manear cualitativa. Es así que se puede decir que el
resultado del laboratorio fue óptimo.

6. Bibliografía:
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https://www.academia.edu/33822517/Determination_of_Reducing_Sugars_with_3_
Methyl_2_benzothiazolinonehydrazone?auto=citations&from=cover_page

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https://www.uco.es/organiza/departamentos/bioquimica-biol
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Luotola, J., Sunnari, A., Kololuoma, T. y Keränen, M(2014). Recuperado el 10 de

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Pérez, P. y Montaño L. M. SALIVA Y ENZIMA ALFA AMILASA: ESENCIALES

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https://www.sabermas.umich.mx/archivo/articulos/235-numero-27/421-saliva-y-
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Zakowski, J. J. y Bruns, D. E. (1985). Recuperado el 10 de julio de 2022.

Biochemistry of human Alpha amylase isoenzymes. Critical Reviews in Clinical
Laboratory Sciences, 21(4), 283-322.
https://www.tandfonline.com/doi/abs/10.3109/10408368509165786?journalCode=ila
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Verde, J. et al. (2013). Recuperado el 10 de julio de 2022. Manual de prácticas de

laboratorio química analítica. Ciudad de Mexico.
http://publicacionescbs.izt.uam.mx/DOCS/analitica.pd