1.

introducción

Cada vez más son los esfuerzos que se están realizando para explorar el uso de células
inmunitarias, incluidas las células natural killer (NK) y las células T, para la próxima generación
de inmunoterapias. Se han iniciado ensayos clínicos que utilizan células T, que dirigen los
sistemas inmunitarios adquiridos, y se han demostrado efectos notables contra el linfoma y la
leucemia. En esta estrategia, sin embargo, las células T supervivientes a largo plazo podrían
lisar las células normales además de las células tumorales, y la producción anormal de
citocinas podría causar eventos adversos, que pueden suspender el tratamiento. Además,
debido a la citotoxicidad restringida del complejo principal de la histocompatibilidad de clase I
(MHC de clase I), no se espera que las terapias con células T tengan un efecto fuerte contra las
células tumorales cuando las células cancerosas han regulado negativamente o eliminado el
MHC. Por lo que como las células NK tienen una vida útil más corta y están libres de restricción
de MHC en sus actividades, pueden considerarse una alternativa prometedora. Además, su
actividad independiente del MHC puede ser una posibilidad como un recurso para las terapias
de células inmunes alogénicas de próxima generación. Las células NK son células inmunes
innatas que muestran potencial citotóxico contra las células tumorales vía del ligando-Fas y
Secreción de perforina / granzima sin estimulación previa específica de antígeno o
citotoxicidad restringida del complejo de histocompatibilidad principal clase I (MHC Clase I). La
línea de células tumorales K562, IL-15(interleucina) y un anticuerpo antitumoral, dasatinib, han
demostrado su eficacia y se están utilizando para apoyar la expansión autóloga de las células
NK. Sin embargo, la actividad citotóxica de las células NK a menudo se pierde durante el cultivo
ex vivo. Además, en situaciones clínicas particularmente graves, difícilmente es factible
preparar reservas de células autólogas debido a la dificultad de recolectar células NK de origen
del paciente. Teniendo en cuenta tales casos, se debe considerar la expansión de células NK
alogénicas, incluidas las especificadas a partir de células madre pluripotentes humanas (hPSC)
genéticamente emparejadas o modificadas. De hecho, estudios anteriores han informado de
células NK derivadas de hPSC que presentan receptores específicos de NK. Gracias a estos
resultados sugirieron el potencial de las células NK derivadas de hPSC como un nuevo recurso
para las terapias contra el cáncer basadas en células NK. No obstante, quedan varios
problemas que superar, como el uso de líneas celulares derivadas de tumores. Aquí, se
desarrolla un método para inducir NK células de hPSC en condiciones completamente libres de
alo-estroma o suero. Cabe destacar la importancia que estas células NK derivadas de hPSC
mostraron fenotipos equivalentes a los especificados en presencia de términos séricos de
morfología, marcadores de superficie y citotoxicidad antileucémica. También tendieron a
extender la vida útil de un modelo de trasplante de línea celular de leucemia in vivo. Los
resultados sugirieron que estas células deberían considerarse para futuras terapias basadas en
células NK y modelos de enfermedades.

Resultados

3.1. Inducción de células progenitoras hematopoyéticas a partir de células madre

pluripotentes humanas

La diferenciación dirigida de las células hematopoyéticas de las hPSC utilizadas en este estudio
siguió básicamente procesos de desarrollo in vivo. Debido a que estas células durante la
embriogénesis surgen del mesodermo de la placa lateral, se utiliza el protocolo para inducir
HPC a través de los progenitores mesodérmicos de la placa lateral de las hPSC con algunas
modificaciones (Fig. 1A). En el paso inicial, el inhibidor de GSK-3(glucógeno sintasa quinasa),
CHIR-99021(inhibidor de antes), y un inhibidor de ALK5, SB431542, se añaden secuencialmente
para facilitar la diferenciación mesodérmica dependiente de citocinas mediante la mejora de la
señalización, la b-catenina y la inhibición de la señalización de TGF-b, respectivamente.
Después de iniciar la diferenciación, la morfología de las colonias de PSC cambió
dinámicamente (Fig. 1A). Acompañando este efecto, la mayoría de las se comprometieron con
las células progenitoras mesodérmicas KDR en el día 2 (Fig. 1B y Fig. 1A suplementaria),
seguidas de las células progenitoras hemoangiogénicas KDR CD34 el día 4 (Figura 1C y Figura
1B complementaria). A partir de entonces, el medio se reemplazó por el que contenía citocinas
hematopoyéticas. El día 12 de la diferenciación, emergió una población de CD34 CD43 CD45
HPC (Fig. 1D y Fig. 1C complementaria). Es importante destacar que las células también
expresaron un marcador de linaje linfoide común, IL-7r(interleucina) (figura 1E y figura
complementaria 1D). Las células clasificadas mostraron un aspecto pequeño y redondo, que es
típico de los linajes linfoides (Figura 1F). En resumen, las HPC derivadas de hPSC que expresan
un marcador linfoide podrían obtener una diferenciación escalonada.

3.2. La especificación del linaje celular NK CD56 de las HPC derivadas de hPSC dependiente de
IL-15 pero independiente de IL-3.

A continuación, intentamos especificar las HPC en el linaje de células NK. Para evaluar y
comparar la eficiencia de la diferenciación entre diferentes condiciones con precisión,
recolectando HPC flotantes el día 12 y transfiriendo a nuevas placas de cultivo que contienen
diferentes medios basales.

Debido a que estudios previos informaron la diferenciación dirigida de las células NK de las
HPC por SCF, ligando Flt, IL-3, IL-7 e IL-15, inicialmente utilizamos el mismo conjunto de
citocinas (Fig. 2A complementaria). Como resultado, las HPC derivadas de hPSC dieron lugar a
una población prematura del marcador de células NK CD56-positivo el día 29 de la
diferenciación en ambas condiciones basales, dependiendo de la IL-15 (Figuras
complementarias 2B y 2C). Sin embargo, la pureza de esas poblaciones era pobre y el análisis
morfológico reveló un mayor número de células de tipo mieloide, como macrófagos y
neutrófilos, que células linfoides (Fig. Suplementaria 2D). Teniendo en cuenta estos resultados,
dado que se sabe que la IL-3 promueve la diferenciación con sesgo mieloide, se comparó la
especificación de las células NK entre las condiciones con y sin IL-3 (Fig. 3A suplementaria). Los
datos de FACS en el día 29 mostraron una proporción significativamente mayor de células
positivas para CD56 en ausencia de IL-3 independientemente del medio basal (11,30 ± 2,03%
con IL-3 frente a 87,27 ± 4,52% sin IL-3 en DMS, y 66,63 ± 9,58 % frente a 87,40 ± 0,61% en ST,
Figuras complementarias 3B y 3C). Por lo tanto, nuestro cultivo definido sin suero que contiene
sólo SCF, Flt3L, IL-7 e IL-15 fue capaz de introducir selectivamente el linaje de células NK de
HPC derivadas de hPSC.

3.3. Las células NK derivadas de hPSC inducidas en condiciones definidas expresan receptores
de células NK funcionales

Debido a que las funciones de las células NK dependen de múltiples receptores de células NK,
se continua el proceso de diferenciación con células NK más maduras (Fig. 2A) observando sus
expresiones de marcadores de superficie. Por lo que se observó un receptor de células NK
activador (NKR) independiente de MHC, CD161, en una parte de la población CD56 el día 24
(Fig. 2B, fila superior) seguido de otro receptor de cito-toxicidad independiente de MHC,
NKp44 (Fig. 2B, dos filas del medio), y el receptor similar a la immunoglobuline-like receptor
(KIR) (Fig. 2B, fila inferior) Finalmente, en el día 48 de la diferenciación, detectamos otros NKR,
como CD94, CD159 (NKR inhibidor), NKG2D y NKp46 (activador de NKR), y encontraron un
aumento de la expresión de CD161 (Fig. 3A). Respecto a la expresión de las subfamilias KIR,
mientras que KIR2 DL1 / S1 / S3 / S5 y KIR3 DL1 fueron negativas, la expresión de KIR2 DL2 /
DL3 fue positiva, aunque la intensidad fue menor que en las células NK de sangre periférica
(PB). La observación microscópica mostró la morfología típica de las células NK: forma de riñón
y gránulos azurófilos citoplasmáticos (Fig. 3B). Es notable que esos patrones se observaron de
manera similar en ambas condiciones de los medios basales y comparables con las células NK
derivadas de las células CD34 de sangre del cordón umbilical.

3.4. Células NK derivadas de hPSC muestran actividad antileucémica in vitro e in vivo

A continuación, se evaluó la función de nuestras células NK derivadas de hPSC. Cuando las

células NK derivadas de hPSC se clasificaron por expresión de CD56 y se cultivaron
conjuntamente una línea celular leucémica, K562, impulsados con Cr, mostraron actividades
destructoras dependientes del número de células e independientes de las condiciones o cepas
del medio basal (Fig. 3C). Aunque este resultado indicó una función relativamente más débil en
comparación con las células de sangre periférica NK primarias, demostró la reproducibilidad de
nuestro procedimiento de inducción. Finalmente, validamos la citotoxicidad in vivo de células
NK derivadas de hPSC contra células leucémicas. Para este experimento, se inyectaron células
K562 que expresan luciferasa en el espacio subcutáneo de ratones inmunodeficientes con o sin
células NK (Fig. 4A). En presencia de células NK derivadas de hPSC, el crecimiento tumoral
tendió a suprimirse (Fig. 4B). De acuerdo con esta observación, la intensidad de luminiscencia
disminuyó significativamente en presencia de células NK derivadas de hPSC (Fig. 4C, D y 4E), y
la vida útil de los ratones se prolongó (Fig. 4F). En conclusión, el efecto supresor de tumores de
las células NK derivadas de hPSC preparadas en condiciones químicamente definidas mostró
un efecto citotóxico contra las células leucémicas diana in vivo.

4. Discusión

Las células NK derivadas de hPSC mostraron una morfología y expresiones de marcadores

superficiales similares a las de las células de sangre superficial NK y ejercieron una
citotoxicidad in vitro contra la línea celular leucémica K562. También realizaron respuestas
citotóxicas y suprimieron el crecimiento tumoral en vivo sin IL-2 o IL-15 exógenas en números
de células diez veces menores que los reportados previamente. Por lo tanto, este protocolo
puede ser una plataforma prometedora para inmunoterapias y modelos de enfermedad para
trastornos asociados a células NK, como síndrome hemofagocítico e inmunodeficiencia.
Aunque mostramos la posibilidad de células NK derivadas de hPSC para inmunoterapia, se
necesitan modificaciones adicionales para una mayor función y número de células. De hecho,
estudios previos informaron el uso de células IL-21-K562 unidas artificialmente a la membrana
como células presentadoras de antígeno (APC) para expandir las células NK derivadas de hPSC.
Sin embargo, este método puede no ser adecuado para la aplicación clínica, debido al riesgo
de contaminación por las células K562. Desde este punto de vista, deben aplicarse otras
citocinas o APC derivadas de hPSC, como macrófagos y células dendríticas. En particular, se ha
informado que las CD estimulan las células NK produciendo varias de las citocinas estimulantes
de las células NK descritas anteriormente o mediante intercomunicación a través de los
receptores de células NK. Casualmente, encontramos que nuestras células NK expresan NKp46
y NKG2D, lo que sugiere que las CD son una alternativa factible. Los cuerpos humanos tienen
múltiples variantes del gen KIR, y las células NK expresan estas variantes en varios niveles y
combinaciones. Se ha informado también que esto es el responsable de la amplia variación en
la actividad fisiológica de las células NK. En particular, cada vez más pruebas han descubierto
que la concesión de licencias de células NK, en el proceso de estimular las células NK
inmaduras a través de KIR inhibitorios y NKR inhibitorios (CD94), desempeña un papel
importante para mejorar las auto-respuestas perdidas de las células NK contra las células
diana. Consistentemente, el hecho de que las células NK en el cultivo descrito en este estudio
expresen CD94 fuertemente pero pocas o ninguna subfamilia inhibitoria KIR podría explicar su
función citotóxica relativamente más débil en comparación con las células PB NK. Por lo tanto,
más modificaciones del cultivo o manipulaciones genéticas podrían mejorar el potencial
terapéutico de las células NK derivadas de hPSC.