PREVENTION OF APOPTOSIS BY

BCL-2: RELEASE OF CYTOCHROME

C FROM MITOCHONDRIA BLOCKED
SCIENCE 275, 1129 (1997)

Prevencin de apoptosis por Bcl-2: bloqueo de la

liberacin de citocromo c de la mitocondria

Jie Yang, Xuesong Liu, Kapil Bhalla , Caryn Naekyung Kim, Ana
Maria Ibrado , Jiyang Cai, Tsung -I Peng, Dean P. Jones, Xiaodong
Wang

Trinidad Robles Yoali

Zuzel

ANTECEDENTES

Caenorhabditis
elegans
Identificacin de 2 genes: ced-9
y ced-3 -> apoptosis
En mamiferos ced-9 eequivale a
Bcl-2 -> previene la entrada de
apoptosis
Ced-3 codifica para una proteasa
de la familia de las caspasas 1 ->
requerida para la apoptosis
en mamiferos la proteina CPP32
(caspasa3) comparte secuencias
similares y sustratos especificos
con ced-3

La unin de Bcl-2 which

seems to work upstream of
CPP32 activa los pre-eventos
de CPP32 en respuesta a la
estauroforina y otros agentes
que causan apoptosis.

Los mecanismos regulados

por Bcl-2 son
desconocidos.

*En ensayos en citosol, induciendo

la activacin de CPP32 y
fragmentacin del DNA despues de
la incubacin con deoxyadenosina
trifosfato (dATP). Se observa que en
el fraccionamiento del citosol; el
citocromo c esta relacionado en la
apoptosis y es requerido para la
activacin de CPP32 y la
fragmentacin del DNA.
** aumento en marcadores de
citocromo c en citosol - > celulas
inducidas a apoptosis por la
estaurosporina ..a broad-range
protein kinase inhibitos that induces
apoptosis
in a variety of cell types

El citocromo c es codificado por un gen nuclear y trasladado

por ribosomas citosolicos llamados apopcitocromo c este es
traslocado subsecuentemente dentro de la mitocondria
donde se une covalentemente formando el holocitocrom c
upon apoptosis suggsts that mtocondria quiz participe en
apoptosis en relacion con el citocromo c. esto hace
referencia a bcl-2 encargada del bloqueo de la liberacin de
cotocromo c de la membrana mitocondrial

Se encontro que las clulas sometidas a apoptosis tienen

elevacin en la concentracin de citocromo c en el citosol y una
disminucin en las mitocondrias. Pero que la sobreexppresion de
Bcl-2 impide la salida de citocromo c y por lo tanto de la
iniciacin de la apoptosis. Por lo que es importante evaluar el
papel de Bcl-2 en la prevencion de la apoptosis al bloquear la
liberacin de Cc de la mitocondria

FASE EXPERIMENTAL

*HL-60
fue transfectado un
vector retroviral que contiene un
gen de resistencia a neomicina
(neo cells)
*transfectadas con un vector que
contiene cDNA humano que
codifica Bcl-2 (Bcl-2 cells)
*
Controles
drogas
anticancerigenas
usadas
clinicamente
como
Ara-C,
etoposide,
mitoxantrone
*Se
separo el citosol
y las
hydrochloride
mitocondria
de dos lineas
celulares centrifugando,
Y se confirmo la sobr-expresion
de Bcl-2 por analisis de la
proteina por inmunoblot ( usando
anticurpos para
Bcl-2)
*Tratamiento:
1M
staurosporine
por varios periodos de tiempo.

*Para el control se utilizaron

celulas neo con estaurosporina
, resultando la activacion de
CPP32 en citosol, indicado por
la ecsicin de PARPT
*Mientras que PARP no se
detecto por ecsicin de Bcl-2
en citosol.
*Se analiz entonces el
citocromo c en las
mitocondrias y citosol
mediante analisis de
inmunoblot
*Sin tratamiento (estauporina)
la mayor parte del citocromo c
fue detectado en mitocondria
en ambas lineas celulares.

El citocromo c en celulas neo

aumento significativamente
despus de la 1 hora pero
sigui aumentando durante
las prximas3 hrs. La
cantidad de citocromo c en
las mitocondrias mostro una
correspondiente disminucin
y citocromo c se volvio casi
indetectable despus de las 4
hrs.
En contraste hubo cambios
minimos ya se en citosol o
mitocondria
en clulas que
La despolarizacin
sobreexpresaban
Bcl-2.
de la membrana
mitocondrial es un
evento temprano
de la aoptosis, y
que lo impide la
sobreexpresion de
Bcl-2.

Para checar si la liberacion de

citocromo c era consecuencia de
la despolarizacin de las
mitocondrias, se analizaron
muestras co estauroporina en
diferentes tiempos se midio el
potencial de membrana mediante
la tincion con rodamina 123,
emitido por un fluoroforo cationico
captado por un lser confocal de
microscopa de barriddo.
En las celulas neo con
tratamiento durante 2 y 4 hrs.
No mostro perdida del potencial
de la membrana mitocondrial,
pero la mayoria del citocromo c
mitocondrial habia sido liberado
por 2 hrs d tratamiento y era
indetectable 4 hrs despues, por
lo que el potencial de mebrana
de celulas neo se perdi despues
de 12 hrs de tratamiento.
Las celulas mostraron un cambio

Esta observacion confirma lo anterior,

concluyendo que la sobreexpresion de Bcl-2
protege a las clulas de la prdida de su
potencial de membrana , sin embargo la
liberacion de citroromo c precede a la perdida
del potencial de membrana mitocondrial.
Para aprobar si la liberacion de citocromo c en el citosol se limita a
aoptosis inducida por estauporina, hemos aprobado otro reactivvo qu
induce a apoptosis,etoposido, un agente anticancrgeno ampliamente
utilizado, este estabiliza los complejos covalentes entre la
topoisomeraza II y el ADN genmico resultado de la fragmentacin de
este.
Bcl-2 inhibe la apoptosis inducida por el etoposido.
El tratamiento de celulas neo con etoposido a concentraciones usadas
clinicamente, resulto en la ativacion de caspasas despues de aprox.
3hrs por la divisin de PARP y la fragmentacin de ADN.
Las clulas Bcl-2 no mostraron activacin de CPP32 o la
fragmentacin.
En el analisis de inmunoblot de proteinas de citosol a partir de celulas
neo con tratamiento etoposido, mostr un aumento significativo de
citocromo c tan temprano como 1hr persistiendo durante 4 hrs.

En estos experimento se
observo que citocromo c esta
estrechamente relacionado
con la despolarizacin de la
membrana mitocondrial en la
apoptosis, asi como la
actiacin de caspasas y la
fragmentacin del DNA y que
la sobreexpresion de Bcl-2
previene estos eventos
relacionados con la liberacin
de citocromo c haia el citosol.
En celulas que sobreexpresan
Bcl-2 se incubados en buffer
hipotonico, y se cultivaron
celulas neo y las anteriores se
determino la concentracion de
la roteina y se confirmo por
oligomiycin-snsitive
mitocondrial adenosine
trohosphatassa activity.
Se incub en buffer 150mM
sucrose a 30C 1h. Se obtuvo la
mitocondria por centrifugacin
y se detecto la presencia de Cc

La reduccion de
la concentracion
de sucrose de
250mM en
mitocondrias
separadas e
incubadas al
analizarlas dio
como resultado
Cc de
mitocondria en
celulas neo pero
lo que
se
enPor
celulas
Bcl-2
nodemostro que
las celulas con
sobreexpresin
de Bc-2
reteinan al Cc
que las clulas
neo

La fraccin S-100 de citosol de celulas HeLa en un buffer

hipotonico libre de sucrose contenia Cc asociado a la
mitocondria durante la homogenizacin, esta seccin fue
inmunodepletada con un Ab monoclonal para Cc y se observ
que estas pierden la capacidad de iniciar apoptosis en adicin
de dATP y al measured por cleavage de CP32 y la actividad
apoptotica fue restablecida en adicion de Cc purificado. Lo que
indica ue que la inmunodelesion y la reconstruccin del
sistema esta directamente relacionado desde las mitocondrias
al hizo
citosol
en la apoptosis
y que lade
sobreexpresion
de Bcl-2
Se
lo mismo
en mitocondrias
celulas neo separando
estos
procesos
lainhibe
fraccion
35S
(CPP32) en presencia de dATP y se obsero
que la activacion de Cc es dependiente de CPP32, como se
jizo? Se anclo un Ab monoclonal que muestra especificidad
por Cc en activacion con CPP32

activating CPP32. Cytochrome c is translated by cytosolic

ribosomes as apocytochrome c, and it is assembled in the
mitochondria into holocytochrome c (15). We investigated which
forms support apoptosis. We prepared apocytochrome
c from bovine cytochrome c (24) and found that holocytochrome c,
but not apocytochrome c, reconstituted the CPP32 activation
activity with the S-100
(-cyt. c) fraction (Fig. 4). This result is consistent with the idea that
the release of
cytochrome c from mitochondria, not the block of importation of
cytochrome c, may
lead to apoptosis. Taken together, these data support a model in
which Bcl-2, located
on the outer membrane of mitochondria, prevents the initiation of
the cellular apoptotic
program by preventing the release of cytochrome c from
mitochondria. The mechanism by which cytochrome c is released
from mitochondria remains to be determined. However, the release
of cytochrome c from mitochondria seems to represent a pathway
of apoptosis distinct in several ways from the one reported b
Kroemer and co-workers who showed that a 50-kD protein,

presence of a submicromolar concentration of CPP32-specific

tetrapeptide inhibitor (25). On the other hand, the 50-kD factor, once
released from mitochondria upon depolarization,
functions without cytosol and is insensitive to the CPP32 inhibitor (13).
Despite these differences, it is possible that these two pathways may
work together to induce complete apoptosis, in which case Bcl-2 must
block both pathways. Other factors that work together with cytochrome
c to activate CPP32 and subsequent DNA fragmentation appear to be of
cytosolic origin and present in similar amounts in the cytosol from both
neo and Bcl-2 cells (26). The molecular identity of these factors remains
to be determined. The mechanism by which Bcl-2 blocks the release of
protein from mitochondria and the regulation of this process are topics
of future study. Especially in the case of cytochrome c, the release
appears to be independent of any noticeable structural changes in the
mitochondria. The recent determination of the nuclear magnetic
resonance and crystal structure of Bcl-xL (27), and the demonstration of
phosphorylation of Bcl-2 and its pro-apoptotic family member BAD (28),
may also shed some light on the function and regulation of this family of
proteins. The arrangement of the a helices in Bcl-xL is reminiscent of
the membrane translocation domain of bacterial toxins, in particular,
diphtheria toxin and colicins. Inasmuch as the diphtheria toxin
translocation domain is thought to form a membrane pore (27), the Bcl2 family of proteins