PRÁCTICA No.

1

“DETERMINACION Y CURVA DE CRECIMIENTO DE MICROOGANISMOS (E. COLI Y LEVADURA CANDIDA)”.
EQUIPO No 1.
• • • • GUZMÁN LÓPEZ AMAYRAN CONCEPCIÓN. HERNÁNDEZ GUZMÁN MARIO. JIMÉNEZ PINTO DIANA CAROLINA. MENDOZA SANTIAGO DAYANA CAROLINA.

ING. BIOQUÍMICA.

5to. SEMESTRE.

CATEDRÁTICA: QBP. AURA FLORES PÉREZ.

TUXTLA GUTIÉRREZ, CHIAPAS. NOVIEMBRE DE 2009.

CUANTIFICAR EL CRECIMIENTO DE LA LEVADURA CANDIDA MEDIANTE DIFERENCIAS DE MASA.“DETERMINACIÓN DE CRECIMIENTO DE MICROORGANISMOS” OBJETIVO GENERAL: CUANTIFICAR EL CRECIMIENTO DE LA BACTERIA ESCHERICHIA COLI Y DE LA LEVADURA CANDIDA. . CUANTIFICAR EL CRECIMIENTO DE LA BACTERIA E. CUANTIFICAR EL CRECIMIENTO DE LA LEVADURA CANDIDA (COLONIAS) INOCULADO EN CALDO NUTRITIVO MEDIANTE LECTURAS DE TURBIDIMETRIA (NEFELOMETRICO KLETTS) CADA 12 HORAS DURANTE 96 HORAS. OBJETIVO ESPECIFICO: CUANTIFICAR EL CRECIMIENTO DE LA BACTERIA E. COLI EMPLEANDO LA TECNICA DE VACIADO EN CAJAS PETRI CON AGAR NUTRITIVO (72 HORAS DESPUES DE SU INOCULACION) MEDIANTE EL RECUENTO DE UFC.CUANTIFICAR EL NUMERO DE CELULAS DE LA LEVADURA CANDIDA POR UN RECUENTO DIRECTO (CON DILUCIONES) EMPLEANDO LA CAMARA DE NEUBAUER. . COLI (UFC) EN CALDO NUTRITIVO MEDIANTE LECTURAS DE TURBIDIMETRIA (NEFELOMETRICO KLETT) CADA 2 HORAS DURANTE 24 HORAS.

Las levaduras en general son células esféricas a elípticas cuyo diámetro varía de 3-15µm.D.A) MEDIO DE PATATA.5. glucosa. agar (O.A) Extracto de levadura. Generalmente las bacterias se reproducen por fisión binaria. Existen varios métodos para medir el crecimiento microbiano: Métodos indirectos: son aquellos que utilizan parámetros distintos del nº de células.5 a 3 mm.INTRODUCCION Cuando un microorganismo es colocado en un medio nutricionalmente completo aumenta de tamaño y con el tiempo se reproduce para formar nuevos individuos dando como resultado una población de células vegetativas no diferenciadas. Si bien unas pocas levaduras se reproducen por fisión binaria la mayoría se reproduce por brotación o blastoconidios. coli para ser usada en laboratorio sin riesgos patogénicos. estructura y función. glucosa y agar Medio de jugo de uva (para enología) o medio mosto de cerveza ( para cervecería) Estos medios se hacen selectivos frente a numerosas bacterias por la acidificación a pH 4-3.M. pero que pueden relacionarse de forma directa con éste (masa celular.).. móvil por flagelos perítricos (que rodean su cuerpo). no forma esporas. etc. Además. Es una bacteria utilizada frecuentemente en experimentos de genética y biotecnología molecular porque es ampliamente conocida su organización.B.y su prueba de IMVIC es ++--. Agar McConkey. se han modificado E.Agar E.G. De manera habitual se forman múltiples brotes y pseudohifas en medios deficientes de sustratos fácilmente metabolizables.Ello es posible porque durante el crecimiento de un cultivo hay un aumento ordenado de todos los constituyentes celulares y así la velocidad de crecimiento de la población puede estimarse por la velocidad del incremento de cualquiera de estos parámetros. actividad metabólica. Las especies del género Cándida producen levaduras elipsoides o esféricas con brotes que miden alrededor de 3 a 6 µm. es capaz de fermentar la glucosa y la lactosa . Los medios para el recuento de levaduras son: • • • • • Medio sabouraud Oxiteclicina. etc. se puede inocular en Agar y caldo nutritivo(por poseer todo tipo de nutrientes son excelentes para su uso). Entre los métodos indirectos se encuentran: . GLUCOSA AGAR (P. La Escherichia coli es una bacteria gram (-) que se encuentra generalmente en los intestinos animales y en aguas negras. Después de la proliferación en un medio con agar durante 1-3 días las levaduras producen colonias pálidas y opacas y en general alcanzan un diámetro de 0. es anaeróbico facultativo.

Es el método más habitual para la determinación de células viables se basa en contar el número de colonias UFC. aunque lleva tiempo. Θ Determinación del DNA Θ Determinación de una actividad metabólica según el tipo de microorganismo: consumo de oxígeno (en aerobios). Esta técnica de recuento por diluciones seriadas nos permite conocer el número de microorganismos viables en una determinada muestra. liberación de CO2 u otro producto de fermentación.Θ Determinación del peso seco (bacterias y levaduras). Una aplicación directa de turbidimetría es la realización de una curva patrón en la que se relaciona la medida de la absorbancia con el número de células viables del cultivo. El espectrofotómetro es un aparato que hace pasar la luz a través de una suspensión celular y detecta la luz no dispersada. Frecuentemente las muestras naturales tienen un numero muy elevado de microorganismos (bacterias). Θ Medida de la turbidez del cultivo (bacterias y levaduras). por lo que se requiere diluirlas de forma seriadas que posteriormente se siembra en placas con el medio de cultivo adecuados. Se basa en la capacidad de las células y partículas en general de absorber y/o dispersar la luz que incide sobre ellas. incorporación en la célula de algún material radiactivo. Θ Determinación del nitrógeno celular. La viabilidad en microbiología se define como la capacidad del microorganismo para dividirse y dar lugar a una descendencia. como para evaluar los efectos antimicrobianos en bacterias. Medir el contenido proteico del cultivo. aumento de la concentración de alguna enzima constitutiva. Simultáneamente a las medidas de absorbancia se realizan recuentos en placa (bacterias). La inoculación de la placa con la muestra que contiene los microorganismos pueden realizarse: a) directamente sobre el medio ya solidificado en la placa (método de extensión sobre placa). b) mezclándolo previamente con el medio fundido y temperado. etc. El método más habitual para la determinación de células viables se basa en contar el número de colonias UFC. es útil como referencia en el trabajo de aislamiento y purificación de otros métodos. Este método. para verterlo después sobre la caja petri vacía (método en vertido en placa o siembra en profundidad). La turbidez es proporcional al número de células y puede medirse utilizando un espectrofotómetro. es el método mas difundido para la estimación de la biomasa total en suspensión. . Se trata de medir la masa celular presente en un cultivo y estimar el nº de células proporcional a ésta. Las técnicas turbidimétricas son totalmente útiles para determinar tanto la masa de células durante el desarrollo. Un cultivo celular aparece turbio porque las células dispersan la luz que atraviesa la suspensión.

Durante este periodo la masa ye l volumen de las células aumentan por el mismo factor y de tal manera que la composición promedio de las células y las concentraciones relativas de los metabolitos se mantienen constantes. Θ Contadores electrónicos. agotamiento de nutrientes. de la actividad metabólica y de la susceptibilidad a los agentes químicos y físicos. La curva de crecimiento bacteriano se puede dividir en cuatro fases: fase de latencia. Este método tiene el inconveniente de que no diferencia entre células viables y no viables. Las células mueren a una velocidad mayor a la que se originan debido al agotamiento total de la nutriente y/o excesiva acumulación de sustancias tóxicas. Las células son suspendidas en un fluido conductor que pasa Lentamente a través de una abertura fina por la que pasa una corriente eléctrica permiten medir la distribución de tamaños y el número de células en las suspensiones bacterianas pero son muy costosos. fase del crecimiento exponencial. Θ Fase de latencia: durante esta fase hay un aumento de los componentes macromoleculares. la representación grafica de los datos dará una curva de crecimiento característico. lo que produce una disminución de la velocidad de crecimiento. A veces la muerte va acompañada de lisis celular y esto disminuye la absorbancia del cultivo. Θ Fase estacionaria: en esta fase hay productos de desecho. . cámaras de Petroff-Hauser. Θ Fase de crecimiento exponencial: en esta fase las células se encuentran es un estado equilibrado . Entre ellos: Θ Recuento directo del nº de células al microscopio (levaduras). fase estacionaria y fase de declinación. Se utilizan portas especialmente diseñados para el recuento celular y son denominados cámaras de recuento en donde un volumen conocido de muestra es depositado en un portaobjetos especial para cuenta (hemacitómetros. Cuando en un medio adecuado se inocula con bacterias o levaduras y se toman muestras pequeñas a intervalos regulares. la variación del pH y otros factores que ejercen un efecto nocivo sobre el cultivo. Es poco preciso.Métodos directos: son aquellos en los que se cuenta el nº total de células en un volumen conocido y así se estima el nº total en la población. Θ Fase de muerte celular. Neubauer o de Helber) estas consisten de portaobjetos excavados y cuadriculados que facilitan el recuento por unidad de superficie y de volumen.

Coli tiene un ciclo de vida de 15-20 minutos por que en una población joven el número de bacterias muertas es mínimo. El medio de caldo de maltosa Sabouraud esta especificado para el desarrollo de levaduras. Dependiendo de la fuente de carbono y de la facilidad con que la asimilen crecerán más o menos rápidamente (por ejemplo. Las células crecerán más lentamente en un medio mínimo (MM) que en un medio rico (MR) con todos los nutrientes. Las condiciones de incubación. de color crema y opacas. . la agitación. mohos y bacterias así como la investigación en las pruebas de esterilidad. En contraste. El microorganismo en sí. que se pase un cultivo crecido en MM+Glc a MM+Gal o de MR a MM+Glc.5.Por ejemplo el crecimiento de las bacterias sobre un medio de cultivo liquido es claramente exponencial. En este medio de crecimiento de mohos se parece a esferas de algodón más o menos grande. a aproximadamente 1 a 2 mm de diámetro. La composición del medio de cultivo. Para el aislamiento se usa con más frecuencia el medio de ensayo o de conservación de Sabouraud y el medio de Pensilvania. Después de varios días en un medio con agar es posible observar hifas que penetran en el agar. comúnmente en un medio de pH 5. Se modifican y adoptan la forma de capas membranosas mientras que el crecimiento de levaduras o bacterias se manifiesta por turbidez homogénea que se reconoce por investigación microscópica. los hongos se desarrollan mejor a la temperatura de la habitación (20 a 25ºC) o a 37ºC. El crecimiento de un microorganismo depende de varios factores como: 1. La temperatura de incubación. etc. En la mayor parte de los medios de especies del género Cándida no pueden identificarse sobre la base del aspecto de sus colonias. La procedencia y características del inóculo. pero este ritmo se mantiene solo por un corto periodo. En general. se refiere al crecimiento de poblaciones. en condiciones óptimas E. las bacterias se reproducen por fisión binaria a un ritmo máximo promedio de cada 20 min. La curva de crecimiento variará dependiendo de que se parta de un cultivo estacionario o de uno en crecimiento exponencial. la homogenización y aire reacción del medio de cultivo se realizara en forma manual cada doce horas por 7 días. a 25ºC. 3. La mayoría de los hongos son aerobios. Este viene dado como consecuencia del crecimiento de cada célula individual y su división celular. crecen mejor con glucosa (Glc) como fuente de carbono que con galactosa (Gal). 2. es decir. El proceso de crecimiento del microorganismo (levadura) se desarrollara en condiciones asépticas y a temperatura ambiente. la concentración de CO2 en la atmósfera de cultivo.MARCO TEORICO El crecimiento microbiano se define como un incremento en el nº de células.5 a 6. Por ejemplo para las bacterias patógenas el óptimo de crecimiento se consigue a los 37ºC y para las levaduras y otros hogos. En 24 – 48 horas producen colonias sobreelevadas. Así por ejemplo. 4. son factores importantes.

sobre determinadas áreas y en estas inocular por la técnica de estría masiva.METODOLOGIA CURVA DE CRECIMIENTO BACTERIANO (E. previamente esterilizado. Coli) 1. Matraz 3: Blanco. Hacer lecturas en el turbidímetro Klett cada 2 horas. Poner en agitación el matraz una vez inoculado a 110 revoluciones /minuto. Cada dos horas tomar las lecturas de densidad óptica (Klett). 3. . servirá de referencia para verificar el crecimiento (turbidez) de la bacteria comparándolo con éste..Preparación del medio de cultivo.. agitar y posteriormente hacer diluciones 1:9 para inocular en cajas petri. Para comprobar el efecto antimicrobiano de un producto comercial y estudiando el crecimiento de la bacteria. Matraz 2: Inocular 2 ml de muestra a un matraz con 50 ml de caldo nutritivo estéril. 2. hacer las diluciones y la inoculación en cajas para estudiar su crecimiento. Colocando en dos cajas petri una pequeña proporción de solución del jabón preparada con agua.. Caldo nutritivo (150 ml. 3 matraces nefelométricos con 50 ml) y agar nutritivo para la técnica de vaciado en cajas (por duplicado).Toma de muestra de una cepa pura cultivada en el cepario del laboratorio de microbiología del ITTG. Utilizamos el jabón “Escudo”. con la técnica de vaciado por duplicado.Inoculación Matraz 1: Colocar 2 ml de la muestra (cepa pura) en un matraz nefelométrico que contiene 50 ml de caldo nutritivo.

LEVADURA 1. P2= peso del papel con la muestra (levadura) P2 – p1= peso neto total de levadura. inocular en un matraz nefelométrico con caldo estéril. …………………………………………………………………………………………………. Posteriormente filtrar el contenido del matraz con ayuda de una bomba de vacío.. 2. agitar y leer su contenido de células en la cámara de Neubauer. someter a agitación (110 rpm) durante 12 horas... Esterilizar. P1 = peso del papel filtro a peso constante.Preparación del medio de cultivo: Caldo YM para el cultivo de la levadura Cándida. posteriormente leer su densidad óptica en el equipo Klett.Inoculación: Tomar 2 ml de muestra. para determinar su biomasa. En un segundo matraz inocular 2 ml de muestra en 50 ml de caldo YM. el papel filtro debe estar a peso constante. Preparar matraces con 50 ml de caldo YM.Filtración: Para determinar su biomasa: diferencia de pesos. Repetir este paso cada 12 horas durante 4 días. .

coli y turbidimetría en el equipo Klett . coli Se realizaron 6 lecturas. en el Klett y ………conteo en placa. cada 2 horas.5 68 x 106 13:00 55 25 x 106 15:00 102 557 x 106 17:00 185 1155 x 106 19:00 209 1314 x 106 21:00 202 2200 x 106 Tabla 1: datos obtenidos de las lecturas cada dos horas de los matraces. Conteo en placa de UFC de e. en las cuales se midieron dos datos. Graficando lo datos. De lectura (Hora) 0 1 2 3 4 5 6 Hora Lectura en el Klett UFC’s / ml 09:00 11:00 2.Grafica 1: que muestra el crecimiento microbiano. para demostrar el crecimiento bacteriano se obtiene la siguiente curva normal de crecimiento: Curva de crecimiento E. coli 250 200 Unidad Klett 150 100 50 0 0 2 4 6 8 10 12 14 tiempo (c/ dos horas) ……. La siguiente tabla muestra los datos obtenidos: No. por los datos de turbidimetría (Klett) y las lecturas cada 2 horas.RESULTADOS E. lectura en el Klett y las UFC’s (conteo en placa).

900 465 1:100 4 Miércoles 11/11 08:40 140.900 485 1:100 (Miércoles Noche) 5 20:40 208. cada 12 horas durante 4 días. coli Levadura (Cándida) Se realizaron 6 lecturas.Imagen 1: conteo en placa---------------------------------------------Imagen 2: equipo Klett (turbidez. lectura) Crecimiento de e.500 >1000 1:100 --------------------Tabla 2: Datos obtenidos en la lecturas del Klett y conteo en placa . Fecha Lectura UFC’s Klett Dilución 1 Lunes 09/11 08:00 5777.5 260 1:10 2 Martes 10/11 10:30 56. midiendo dos tres datos: a) Turbidimetría (Klett) b) Conteo de microorganismo (cámara de Neubauer) c) Biomasa (diferencias de peso en papel filtro) Los datos obtenidos se muestran a continuación: No.500 >1000 1:100 6 Jueves 12/11 08:40 214. coli en caja petri: -------------Imagen 3: agar nutritivo inoculado con e.500 405 1:100 (martes noche) 3 20:40 66.

. se graficaron dos datos. Graficando dicho dato vs las lecturas hechas. la lectura en el Klett y el conteo en la cámara de Neubauer.Para obtener la grafica que muestre el crecimiento de la levadura. por vacio).Grafica 2: Conteo de microorganismos en Neubauer vs tiempos de lecturas. Tabla 3: Muestra los pesos de los papeles filtro a peso constante y con muestra biológica (levadura filtrada. Crecimiento de la levadura 250000 200000 Conteo Neubauer 150000 100000 50000 0 0 20 40 Tiempo (c/ 12 horas) ……. 60 80 Conteos en cámara de Neubauer:--------------------------------Conteo en placa: Imagen 4: Conteo en cámara de Neubauer---------------Imagen 5: conteo en placa de levaduras CALCULO DE LA BIOMASA DE LA LEVADURA (DIFERENCIA DE PESOS) P2-P1 = PESO NETO TOTAL DE LEVADURA. P1= Peso del papel filtro a peso constante P2=Peso del papel filtro con muestra. . obteniendo la diferencia de ambos se tiene la biomasa.

15 0.23 0.25 0.25 0.3 0.2 0.48 0.1 0.33 Graficando “Horas de lectura vs Biomasa”.30 0.Peso constante.25 0. pesando incluso gramos de organismo.18 0. Se muestra un grafica normal de crecimiento de microorganismo.16 Peso con muestra 0 0.31 0. Papel filtro 0 0.49 Horas de lectura 0 12 24 36 48 60 Biomasa (peso de levadura) 0 0.3 0.18 0.23 0.54 0.34 0.16 0. .18 0. se obtiene la siguiente grafica CURVA BIOMÁSICA 0.35 GRAMOS DE LEVADURA 0. La levadura (hongos).05 0 0 0 10 20 30 40 50 60 70 0. la levadura creció de una manera impresionante. en general son los microorganismos que pueden pesarse.31 0.33 TIEMPO (HORAS) ----------Grafica 3: muestra los gramos de levadura vs los tiempos de lectura hechos. que conforme las horas de agitación pasaban. ------Dicha grafica muestra.48 0.

El resultado total del conteo de UFC/ml se realizo a las 48 después de las inoculaciones hechas y no a las 24 horas que era lo correcto. Las últimas dos lecturas En equipo Klett se obtuvo un resultado aproximado debido a que el rango de lectura del equipo no fue suficiente para el conteo de las levaduras. Otro factor importante que provoco un desajuste en los resultados en la segunda lectura de UFC/ml fue provocado por la contaminación de una caja inoculada. esto ocurrió por una mala esterilización del área de trabajo. dando como resultado un crecimiento no muy óptimo. Los datos en el cálculo de la biomasa. .DISCUSION DE RESULTADOS La cepa utilizada de E. Otro factor prescindible en los resultados de la misma lectura fue el calentamiento excesivo de la pipeta con la que se inoculo causando la muerte de las bacterias y dando un resultado muy pequeño. no fueron correctos. así como los datos de los pesos de los papeles filtro. Coli para la inoculación fue una reserva que llevaba días.

ya que no hubo inhibición de ningún tipo. .CONCLUSIÓN Según los resultados obtenidos en la tabla de E. demostrando así que el crecimiento bacteriano fue casi ideal y continuo. nos muestra una curva normal de crecimiento. cual función fue pésima. se estudio el efecto de dicho producto. las colonias fueron notorias en el medio inoculado. Comprobando así la mala función de este. El crecimiento bacteriano fue de mayor rapidez en comparación del crecimiento de la levadura. Las UFC crecieron alrededor del agente. En el caso de la inoculación utilizando un producto comercial antimicrobiano (jabón “Escudo”). coli. pero su biomasa fue mayor en esta última.

Editorial Medica panamericana. Bacterias y levaduras . 8ª ed. Zucca. Editorial Acribia S. . Arthur.V. Dicit . Microbiología alimentaria. Zinsser.com/search/label/Divulgaci%C3%B3n%20cient%C3%ADfica Microbiología.F..blogspot.jueves 16 de octubre de 2008 http://dicitblog.A. Bryan h. Bourgeois. Argentina 1994. México D.Bibliografía Bacteriología principios y practicas. editorial continental S. 1983. 20ª ed. Mescle.a. de C.

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