UNIVERSIDAD NACIONAL DE SAN AGUSTÍN DE AREQUIPA

ESCUELA PROFESIONAL DE INGENIERIA QUIMICA

INGENIERÍA DE BIOPROCESOS

PRACTICA 3

RECUENTO MICROBIOLÓGICO DE COLIFORMES EN ALIMENTOS, NUMERO MAS

PROBABLE (NMP) Y DETECCION EN MEDIOS DE CULTIVO

OBJETIVOS:
1. Familiarizarse con técnicas para la preparación de las muestras de alimentos para el
conteo microbiológico.
2. Implementar técnica de diluciones seriadas.
3. Efectuar y evaluar un recuento bacteriano a una muestra de alimentos.
4. Familiarizarse con diferentes medios de cultivo comúnmente empleados en
microbiología de alimentos.
5. Familiarizarse con técnicas para la preparación de medios de cultivo.
6. Practicar diferentes técnicas de siembra bacteriana.
7. Practicar técnicas de aislamiento de colonias.

MARCO TEÓRICO

Introducción

En términos habituales el crecimiento se refiere como el aumento ordenado en la cantidad de

constituyentes celulares. Esto depende de la capacidad de la célula para formar nuevo
protoplasma a partir de los nutrientes disponibles.

En la mayoría de las bacterias, el crecimiento implica incremento en la masa celular, en el

número de ribosomas, duplicación del cromosoma bacteriano, síntesis de nueva pared
celular, separación de los dos cromosomas, formación de un septo y división celular. El
proceso asexual de reproducción es llamado fisión binaria.

Las células bacterianas se presentan en un cultivo en forma individual o en asociaciones

débiles de pocos individuos, pudiendo ser dispersadas en forma homogénea en el medio
líquido de cultivo.

En el caso de los hongos, organismos eucarióticos, se pueden distinguir morfológicamente,

sin significación taxonómica, a las levaduras y a los mohos. Las levaduras se desarrollan en
células individuales, fácilmente dispersables, que se reproducen habitualmente por gemación
en condiciones de pleno crecimiento. En este caso, se genera una célula hija y permanece
viable la célula progenitora: después de un determinado número de yemaciones la célula
pierde viabilidad.

Dada la diversidad de características que presentan los diferentes cultivos, en las que influyen
también sus propiedades y composición del medio de cultivo, se han desarrollado una
variedad de métodos físicos y químicos para cuantificar las variaciones en el tiempo de una
población de microorganismos.

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En resumen, el crecimiento microbiano se define como el incremento en la cantidad de
células de una población y se puede expresar de dos formas, en términos de la concentración
celular (número de células por unidad de volumen de cultivo) y en términos de la densidad
celular (peso seco de las células por unidad de volumen de cultivo).

Métodos para la medición de número de células (densidad poblacional)

Conteo microscópico directo: este es posible usando portaobjetos especiales conocidos como
cámaras de recuento. Las células muertas se pueden distinguir de las vivas si se utiliza
tinción.

Cámaras de recuento electrónico: Cuentan número y miden la distribución de tamaños de

las células. Para células del tamaño de bacteria, el medio de suspensión debe ser muy limpio.

Recuento indirecto de células viables, también llamado recuento en placa. La ventaja de esta
técnica es su sensibilidad. Las desventajas son que: sólo las células vivas originan colonias
que son contables; las agrupaciones o cadenas de células desarrollan una colonia simple; sólo
se desarrollan colonias de aquellos organismos para los que las condiciones de cultivo
resultan apropiadas.

En microbiología de alimentos es necesario conocer la concentración de microorganismos

viables, por lo que se utilizan principalmente 2 métodos de conteo celular: Recuento
Microbiológico en Placa y Número Más Probable (NMP). Con estos métodos lo que se busca
es determinar el número de células presentes en la muestra capaces de dividirse. La división
se evidencia por la formación de colonias (Recuento en Placa) o por la turbidez del medio de
cultivo (NMP).

Recuento Microbiológico en Placa

El recuento en placa es un tipo de recuento indirecto, ya que se evidencia la presencia de una

célula por su crecimiento. Métodos de recuento directos son aquellos en que se contabilizan
las células microbianas por medio de un microscopio, aquí es necesario utilizar tinciones para
identificar las células viables.

El supuesto en este procedimiento es que cada célula viable puede crecer y dividirse para
formar una colonia, por lo que a cada célula viable que crece se le denomina unidad
formadora de colonia (UFC). Así, el número de UFC refleja el número de células viables.

Hay al menos 2 formas de realizar el recuento en placa: por siembra en superficie y por
siembra en inmersión.

Siembra en superficie (Fig.1)

En el método de siembra en superficie, un volumen (usualmente 0,1 ml o menos) de una

dilución apropiada de la muestra, se esparce asépticamente con un rastrillo por la superficie
del medio de cultivo sólido (medio agar) y seco contenido en una placa de cultivo. La placa
se incuba a la temperatura adecuada hasta que las colonias sean visibles, luego se contabilizan
las colonias.

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 Fig 1. Técnica de siembra en superficie

Siembra en inmersión (Fig. 2)

En esta técnica, un volumen conocido (entre 1-0,1 ml) de una dilución apropiada de muestra
es pipeteada dentro de una placa Petri estéril, que contiene un medio sólido (agar)
previamente autoclavado a una temperatura entre 45-50°C se vierte sobre la muestra
mezclándolas suavemente. Este método tiene la ventaja de poder utilizar un mayor volumen
de muestra ya que una mayor superficie de agar puede ser utilizado por las bacterias. Una
desventaja es que los microorganismos deben ser capaces de soportar brevemente la
temperatura inicial del agar y además que es necesario tener precaución en el conteo de
colonias ya que pueden crecer entre medio del agar, lo que dificultar su visualización.

Fig 2. Técnica de siembra en inmersión

El recuento en placa, además de entregar el número total de células viables en una muestra,
es de utilidad para la identificación posterior de los microorganismos presentes. Ya que cada
colonia es formada a partir de una única célula, tomando una muestra de la colonia es posible
identificar la bacteria por biología molecular, y antes de eso incluso se pueden identificar
diferentes organismos por el fenotipo de su colonia. Las colonias se pueden diferenciar en
color, forma, tamaño y textura (Fig. 3).

Diluciones seriadas (Fig. 4)

En ambos tipos de recuento en placa, es importante que la cantidad de UFC no sea ni muy
grande ni muy pequeña. Esto debido a que si la placa tiene una concentración muy grande de
bacterias puede ser que algunas no formen colonias, y que algunas colonias puedan fundirse
con otras colonias, lo que llevaría a un conteo erróneo de células. Si la cantidad de UFC es
muy pequeña la significancia estadística es muy baja. Por lo tanto, para minimizar estos
errores se contabilizan únicamente placas que tengan entre 25 y 250 colonias (según Instituto
de Salud Pública, ISP).

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 Fig. 3. Características morfológicas de colonias microbianas

Para obtener un número apropiado de colonias casi siempre es necesario diluir la muestra.
Además, como no se puede conocer el número de células viables con anterioridad al ensayo,
es usualmente necesario realizar más de una dilución. Se usa normalmente diluir la muestra
10 veces. Por ejemplo, con un volumen de muestra de 1 ml más 9 ml de disolvente, de esta
forma conseguimos una dilución de 10-1. Si queremos conseguir una dilución de 10 -2
podemos tomar 1 ml de muestra más 9 ml de disolvente, sin embargo, una forma más simple
es realizar una dilución seriada, es decir, conseguir una dilución 10 -2 tomando 1 ml de la
dilución 10-1 y agregarle 9 ml de disolvente.

Número Más Probable (NMP)

Otro método utilizado para la cuantificación de microorganismos en alimentos es el NMP, el

cual sigue el mismo principio del recuento en placa, asume que toda célula viable se dividirá
produciendo un crecimiento del cultivo, en este caso, ese crecimiento se evidencia por medio
de la turbidez.

Esta técnica se basa en diluciones seriadas también, y mediante la inoculación de estas

diluciones en triplicado o con 5 réplicas, se evalúa la presencia o ausencia de un fenotipo. En
este laboratorio nos centraremos en el crecimiento bacteriano (turbidez en un tubo), y
fermentación de lactosa (producción de gas). De acuerdo al número de replicados positivos
para cada cualidad, mediante un test estadístico se puede obtener una estimación cuantitativa
de la carga microbiológica del alimento.

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 Fig. 4. Diluciones seriadas

Ejemplo: Se hacen diluciones seriadas de una muestra de leche cruda, y se usan para inocular
tubos con caldo lactosado con campanas de Durham. Todos los inóculos de cada dilución se
incuban a la temperatura adecuada y se compara el resultado, tubos sin crecimiento y tubos
con crecimiento (medidos por la presencia de turbidez), además de la formación de gas, con
una tabla estadística. Si hay turbidez en los 3 tubos inoculados con la misma dilución, esa
dilución será representada por el número 3, si 2 tubos de 3 presentan turbidez, esa dilución
será representada por el número 2, si hay un solo tubo con turbidez, por el número 1, y si no
hay tubos turbios, será representada por el 0. En el ejemplo mostrado en la figura 5, las
diluciones son identificadas como sigue:

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10-2: 3; 10-3: 3; 10-4: 2; 10-5: 0; y 10-6: 0

Fig. 5. Ejemplo de tubos de la misma dilución después de la incubación.

Las diluciones tabuladas son de 0.1 a 0.001, sin embargo, para una mayor precisión, se
recomienda tomar en cuenta las diluciones de 0.01 a 0.0001 y multiplicar el resultado por 10.

Esta técnica es más adecuada para muestras en las que se espera una menor concentración de
microorganismos comparada con el recuento en placa, ya que la turbidez debe de ser generada
por sólo una célula en cada tubo.