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TECNOLGICO DE ESTUDIOS

SUPERIORES DE ECATEPEC
DIVISIN DE INGENIERA QUMICA Y BIOQUMICA

MICROBIOLOGA
PRACTICA No. 5
CUENTA DE COLONIAS POR LAS TCNICAS DE
VACIADO EN PLACA E INOCULACIN EN
SUPERFICIE

EQUIPO 3:

DELGADO MEZA MARICRUZ

NEZ GARCA BENJAMN ARMANDO

RAMOS GONZLEZ MARA DEL ROCO


RODRGUEZ PINEDA MARA ALEJANDRA

YEZ VARELA JUAN ANTONIO


PROFESORA:

YANIN GABRIELA SANDOVAL GMEZ

GRUPO: 3551

Laboratorio de microbiologa Prctica No. 5


Cuenta de colonias por las tcnicas de vaciado en placa

PRCTICA No. 5
Cuenta de colonias por las tcnicas de vaciado en placa e inoculacin.
OBJETIVO:
El alumno aislar bacterias aerobias por las tcnicas de vaciado en placa e inoculacin en
superficie.
MARCO TERICO:
El crecimiento de las poblaciones microbianas puede medirse de diferentes maneras.
Alguno mtodos determinan el nmero de clulas y otros la masa total de la poblacin,
que a menudo es directamente proporcional al nmero de clulas. La magnitud de la
poblacin normalmente se registra como el nmero de clulas que hay en un mililitro de
lquido o en un gramo de material slido. Como las poblaciones bacterianas suelen ser
muy grandes la mayora de los mtodos de cuantificacin se basan en mediciones directas
o indirectas de muestras muy pequeas; despus se determina mediante clculos el
tamao de la poblacin total. Supongamos, por ejemplo, que una millonsima parte de un
mililitro (10-6 mL) de leche agria contiene 70 clulas bacterianas. Entonces debe haber 70
veces 1 milln de clulas, o sea 70 millones de clulas por mililitro.
Sin embargo, este mtodo resulta poco prctico para medir una millonsima parte de un
mililitro de lquido o de un gramo de alimento. Por consiguiente, el procedimiento se
efecta indirectamente en una serie de diluciones. Por ejemplo, si aadimos 99 mililitros
de agua, cada mililitro de esta dilucin tendr una centsima parte de las bacterias que
tena cada mililitro de la muestra inicial. Si mediante una serie de diluciones de este tipo
se puede estimar con facilidad el nmero de bacterias en la muestra original. Para
encontrar las poblaciones microbianas en alimentos slidos (como en una hamburguesa)
se realiza un homogenizado en una licuadora de alimentos con una parte de alimento y
nueve partes de agua. Despus pueden tomarse muestras de esta preparacin diluida al
10% y realizar ms diluciones o efectuar recuentos celulares.
Recuentos en placa
El mtodo utilizado con ms frecuencia para la medicin de poblaciones bacterianas es el
recuento en placa. Una ventaja importante de esta tcnica es que mide el nmero de
clulas viables. Una desventaja es que se requiere bastante tiempo, por lo general 24
horas o ms. Para que se formen colonias visibles. Esto puede plantear un grave problema

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en algunas aplicaciones, como por ejemplo el control de calidad de la leche, cuando no es


posible mantener un lote determinado tanto tiempo.
El recuento en placa se basa en la suposicin de que cada bacteria crece y se divide para
producir una sola colonia. Esto no siempre es cierto porque las bacterias con frecuencia
crecen unidas en cadenas o como grumos. Por consiguiente, a menudo una colonia no se
produce como resultado de una nica bacteria sino de segmentos cortos de una cadena o
de un agregado bacteriano. Para reflejar esta realidad los recuentos en placa suelen
informarse como unidades formadoras de colonias (UFC).
Cuando se realiza el recuento en placa es importante que crezca slo un nmero limitado
de colonias en la placa. Cuando hay demasiadas colonias algunas clulas se encuentran
apiadas y ni pueden desarrollarse; esta situacin es causa de inexactitudes en el
recuento. La convencin de la Food and Drug Administration de los Estados Unidos ha
sealado que se cuenten solo las placas con 25 a 250 colonias, si bien muchos
microbilogos prefieren placas con 30 a 300 colonias. Para asegurar que algunos
recuentos estn dentro de estos lmites el inculo original se diluye varias veces en un
proceso denominado dilucin seriada.
Fuentes de error en el recuento en placa
El nmero de colonias que se obtiene en una determinacin de viables no slo depende
del tamao del inculo si no tambin de lo adecuado que sea el medio de cultivo y de las
condiciones de incubacin, as como la duracin de la incubacin. Las clulas depositadas
en la placa no se desarrollarn todas en colonias a la misma velocidad y se se emplea un
corto tiempo de incubacin, se obtendrn menos colonias de las posibles. Adems, el
tamao de las colonias vara y si se desarrollan colonias muy pequeas pueden pasar
desapercibidas en el recuento. Es habitual establecer las condiciones de incubacin
(medio, temperatura y tiempo) que permitan obtener el mayor nmero de colonias para
un determinado organismo y usar luego estas mismas condiciones. La determinacin de
viables puede estar sujeta a grandes errores y, si se desean recuentos precisos, han de
hacerse con cuidado y hacer las placas de las diluciones por duplicado. Hay que advertir
que una agrupacin de dos o ms clulas slo producir una colonia, de modo que el
recuento de viables ser errneamente menor. El recuento se expresa a menudo como
unidades formadoras de colonias obtenidas, ms que como nmero de clulas viables (ya
que una unidad formadora de colonias pudo originarse a partir de una o ms clulas
iniciales).
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Pese a estas dificultades, el recuento de viables suministra una buena informacin sobre
el nmero de clulas viables y este procedimiento se usa ampliamente. En la
alimentacin, industria lctea, medicina y microbiologa acutica, el recuento de viables se
emplea rutinariamente. El mtodo tiene la ventaja de una elevada sensibilidad: se pueden
contar muestras con pocas clulas, lo que permite una deteccin muy sensible de la
contaminacin microbiana de productos o materiales. Adems, el uso de medios
selectivos y de ciertas condiciones de cultivo permite contar mediante la determinacin
de viables, tipos celulares particulares en una poblacin mixta de microorganismos.
La gran anomala del recuento en placa
Aunque es una tcnica muy sensible, el recuento en placa puede ser irrealizable cuando se
trata del recuento de muestras naturales suele dar un nmero mucho mayor de
organismos que los que se obtiene en cultivo en placas de cualquier tupo de medio.
Algunos microbilogos se refieren a este hecho como la gran anomala del recuento en
placa. Por qu los recuentos directos al microscopio? Esto se debe a una combinacin
de factores, como el hecho de que los mtodos microscpicos cuentan clulas muertas,
mientras que los mtodos de viables no; y al hecho de que diferentes organismos, incluso
en una muestra muy pequea, pueden tener requerimientos nutricionales y de cultivo
muy diversos. Por tanto, aunque los recuentos en placa especficos con medios altamente
selectivos, como en el anlisis microbiano de aguas residuales o de alimentos, puede dar
resultados fiables, los recuentos del nmero total de clulas de los mismos habitad
pueden ser, y habitualmente son, subestimados en varios rdenes de magnitud.
El gnero Lactobacillus.
Caracteres morfolgicos:
En gnero Lactobacillus (lactis-leche; bacillus pequeos bacilos), se caracteriza por
presentar clulas en forma de bacilos largos y extendidos, aunque con frecuencia pueden
observarse bacilos cortos o coco-bacilos coryneformes; lo cual hace que se puedan
confundir con gnero aislados habitualmente de materiales clnicos. Estos bacilos se
presentan comnmente formando cadenas y en general son no mtiles. Son Gram
positivos y slo las clulas muertas pueden dar resultados variables a la tincin de Gram.
Adems, no esporulan y algunas cepas presentan cuerpos bipolares que probablemente
contentan polifosfato.

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Caracteres culturales y de las colonias:


Las colonias de Lactobacillus en medios slidos son pequeas (2-5 mm), convexas, suaves,
con mrgenes enteros, opacas y sin pigmentos. Slo en algunos casos se presenta
coloracin amarillenta o rojiza.
Algunas especies forman colonias rugosas; generalmente no presentan actividad
proteoltica ni lipoltica que pueda apreciarse mediante halos claros formados en medios
slidos que contengan protenas o grasas.
Normalmente no reducen los nitratos, pero esta reaccin puede ocurrir en algunos casos
cuando el pH est por encimo de 6.0. Los lactobacilos no lican la gelatina ni digieren la
casena.
Tampoco producen indol ni cido sulfhdrico (H2S). La produccin de pigmentos es rara y
cuando ocurre, stos pueden ser de color amarillo o naranja hacia un tono ferroso o
rojizo.
Los lactobacilos no desarrollan olores tpicos al crecer en medios comunes, pero
contribuyen a modificar el sabor de alimentos fermentados, produciendo compuestos
voltiles como diacetilo y sus derivados y hasta H2S y aminas en el queso.
Especies de Lactobacillus.
Se divide el gnero Lactobacillus en 44 especies, que se ubican en tres grupos. Adems
algunas de estas especies se subdividen en varias subespecies; tales son los casos de:
Lactobacillus delbrueckii (con tres subespeceies: bulgaricus, lactis, delbrueckii).
Lactobacillus salivarius (con dos subespecies: salivarius y salicinus).
Lactobacillus casei (con cuatro subespecies: casei, pseudoplatarum, rhamnosus y
tolerans).
Lactobacillus coryniformis (con dos subespecies: coryniformis y torquens).
Nutricin y condiciones de crecimiento.
Los lactobacilos presentan particularidades para cada especia respecto a los
requerimientos nutricionales complejos para los aminocidos, pptidos, derivados de
cidos nuclicos, vitaminas, sales, cidos grasos o steres de cidos grasos y carbohidratos
fermentables.
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Requieren no slo carbohidratos como fuentes de carbono y energa, sino tambin:


aminocidos, vitaminas y nucletidos. Generalmente estos requerimientos variados
suelen suplirse cuando el medio de cultivo de los lactobacilos contiene carbohidratos
fermentables, peptona, extracto de carne y extracto de levadura, aunque una
suplementacin con jugo de tomate, manganeso, acetato y steres del cido oleico,
especialmente Tween 80, resulta estimuladora y hasta esencial para muchas especies. Por
eso, estos compuestos se incluyen en el medio MRS.
METODOLOGA:
Preparacin del material:
Preparar agua peptonada suficiente para siete tubos (16/150 con tapn de rosca)
que contendrn 9 ml cada uno, y 90 ml para un frasco con tapa de rosca azul.
Preparar 300 ml de medio MRS para posteriormente vaciar en siete placas de Petri.
**Medio MRS: Para aislamiento, cultivo y enumeracin de Lactobacilos y otras bacterias
acido lcticas de alimentos y otros materiales.
Mtodo de la secuencia de diluciones:
1. Homogenizar la muestra agitndola vigorosamente.
2. Transferir 10 ml de muestra a un frasco con 90 ml de agua peptonada. Agitar para
homogenizar.
3. Transferir a un tubo con 9 ml de agua peptonada, 1 ml de la solucin hecha de la
muestra para as lograr una disolucin 10-1.
4. De la disolucin 10-1 tomar 1 ml y llevar a un segundo tubo con 9 ml de agua
peptonada y as lograr una disolucin de 10-2.
5. Realizar sucesivamente los mismos pasos como se muestra en le figura hasta lograr
una disolucin de 10-7.

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Tcnica de vaciado en placa (Mtodo A):


1. En condiciones aspticas, tomar 1 ml de la disolucin 10-1 y vaciar sobre una caja
Petri (sin agar).
2. Verter 15 ml de agar fundido y girar suavemente para mezclar. [Fig. (a)]
3. Repetir el mismo procedimiento con cada una de las siete diluciones hechas e
incubar durante 2 a 5 das a 30 C.
Tcnica de expansin en placa (Mtodo B):
1. En condiciones aspticas, verter el agar en la caja Petri y esperar a que solidifique.
2. Tomar 0.1 ml de la disolucin 10-1 e inocular sobre el agar.
3. Introducir en alcohol una varilla de vidrio y flamearla, dejarla enfriar en un
extremo de la caja.
4. Extender el inoculo en toda la superficie de la placa pasando la varilla repetidas
veces. Flamear la varilla para cada disolucin. [Figura (b)]

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5. Repetir el mismo procedimiento con cada una de las siete diluciones hechas e
incubar durante 2 a 5 das a 30 C.

Conteo de colonias:
1. Seleccionar solo las cajas que tengan entre 30 y 300 colonias.
2. Multiplicar la cuenta por la inversa del factor de dilucin y el resultado ser en
UFC/ml.

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RESULTADOS:
Tcnica de vaciado en placa):
Figura 1

Figura 2

Figura 3

Figura 4

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Cuenta de colonias por las tcnicas de vaciado en placa

Se debe inocular el MRS agar con el material o muestra original (homogeneizada)


utilizando la tcnica de vaciado en placa. La incubacin debe ser de 3 das a 35C o hasta 5
das a 30 (DE MAN, ROGOSA & Sharpe, 1960) para presentar crecimiento de colonias que
facilite su conteo (Fig.4). El tiempo de incubacin, en esta ocasin, fue de 7 das a 30C
por lo que el conteo de colonias no fue posible dado el crecimiento excesivo de stas (Fig.
1, Fig. 2, Fig. 3), y as, cada caja que presentaba crecimiento fue etiquetada como
incontable.
El tiempo de muestreo ptimo debera ser aquel lo suficientemente largo para captar
material en cantidad detectable y lo suficientemente corto para evitar la sobrecarga del
soporte de captacin, es decir, al dejar incubar las muestras ms tiempo del que se deba,
el microorganismo continu con su crecimiento, lo cual provoc que el resultado del
conteo de colonias fuese incontable.
La densidad de las colonias crecidas en el medio de cultivo afect a la fiabilidad del
resultado. Demasiadas colonias incontables son difciles de examinar.
Tcnica de expansin en placa:
El tiempo de incubacin fue demasiado largo para poder obtener un nmero de colonias
que se encuentren en el rango entre 30 y 300, las cuales se consideran como viables para
efectuar un clculo para el nmero de unidades formadoras de colonias. Por lo tanto se
obtuvo un crecimiento en todas las placas por arriba de 300 colonias as que no se
tomaron para un clculo de UFC. Adems de que tambin se encontr en las placas con
contaminacin por hongos.

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CONCLUSIN:
El manejo de este tipo de tcnicas es de suma importancia por su manejo tan frecuente en
diversas reas que dependen de la microbiologa. La experiencia mas valiosa obtenida fue
la realizacin de la tcnica, aun que por circunstancias extra no se lograron obtener los
resultados deseados.

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CUESTIONARIO:
1. Explicar las ventajas y desventajas de la tcnica de vaciado en placa.
VENTAJAS

DESVENTAJAS

- Es til en muestras que se


sospechan con un bajo nmero de
UFC por que se utiliza 1 ml.

- Microorganismos sensibles al calor


se daan por el agar fundido.
- Las colonias de bacterias crecen
debajo de la superficie y no son
adecuadas para el conteo.

2. Explicar las ventajas y desventajas de la tcnica por incubacin en superficie


VENTAJAS

DESVENTAJAS

-Es til en muestras que se


sospechan con un alto nmero de
UFC por que se utiliza 0.1ml.

-Carencia en la uniformidad de la
extensin

-Los microorganismos no se daan


por el agar fundido.

3. Discuta en base al nmero de colonias que encontraron en cada una de las cajas, si
estuvo bien desarrollada la tcnica.
Por que el tiempo de incubacin fue muy largo, el nmero de colonias obtenidas rebasa el
rango que se encuentra entre 30 y 300 para realizar el conteo. As que ese fue un
impedimento para el clculo de UFC.
4. Se desea conocer el nmero de bacterias por gramo de una muestra de pimienta
molida, por lo que realiza siguiente serie de diluciones decimales de 10 -1 a 10-8,
siembra 0.1 ml en cajas por tcnica de inoculacin en superficie y obtiene los
siguientes resultados.

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DILUCIN

CUENTA MICROBIANA

10-1

Incontable

10-2

Incontable

10-3

Incontable

10-4

Incontable

10-5

325

10-6

30

10-7

10-8

Sin crecimiento

10-9

Sin crecimiento

10-10

Sin crecimiento

Qu dilucin utilizar para conocer el nmero de clulas por gramo de pimienta y por
que?
Se utiliza la 10-6 ya que es la nica que tiene un nmero de colonias que cae dentro del
rango (30 300).
Cul es el nmero de bacterias por gramo de pimienta? Indique los clculos a realizar y
sus resultados.

30 10
Nmero de colonias
reportadas en la placa

6 1

30 10 6 UFC

Inversa de la
dilucin de la placa

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Se reporta como Unidades


Formadoras de Colonias o
Celulas/gr de pimienta

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BIBLIOGRAFA:

Madigan, M.T., Martinko y J. Parker. Brock: Biologia de los microorganismos.


Madrid, Espaa: 10 edicin. Pearson. Paginas: 145 148.

ROGOSA, M., a. SHARPE, M.E.: An approach to the classification of the lactobacilli.


J. Appl. Bact., 22; 329-340 (1959).
Luz Mara Samaniego Fernndez; Maryla Sosa del Castillo., Lactobacillus spp.:
Importantes promotores de actividad probitica, antimicrobiana y
bioconservadora., Centro de Estudios Biotecnolgicos. Facultad de Agronoma.
Universidad de Matanzas Camilo Cienfuegos. Matanzas, Cuba.

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