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Recuento y Cuantificacion de Microorganismos

Recuento y Cuantificacion de Microorganismos

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,

AISLAMIENTO Y CUANTIFICACION

DE MICROORGANISMOS

AISLAMIENTO

Consiste en separar los microorganismos de interes de una comunidad microbiana ,el aislamiento es importante por que se obtienen cultivos para estudios detallados y controlados de laboratorio y para su aplicacion en biotecnologia y en microbiologia ambiental e industrial.

leOMO SE LOGRA?

El aislamiento se logra por medio de cultivo selectivo para el organismo que se desea aislar, e inhibir el crecimiento de otros microorganismos no deseados pero sin afectar a la especie 0 grupo que se desea aislar.

MEDIO DE CULTIVO

CLASIFICACION

EJEMPLO DE MoO AISLADOS

EMB SELECTIVOY Escherichia coli
DIFERENCIAL Klebsiella pneumoniae
Enterococcus faecalis
SAL YMANITOL SELECTIVOY Staphylococcus auerus
DIFEENCIAL Escheriachea coli
Klebsiella pneumoniae
S-110 SELECTIVO Staphylococcus aureus
MAC CONKEY SELECTIVOY Shigella flexneri
DIFERENCIAL Proteus mirabilis
Eo Coli
CHAPMAN SELECTIVO So aureus leOMO LOGRO UN AISLAMIENTO?

·:·Separando los microorganismos fisicamente mediante diluciones 0 por agotamiento (estria) .

• :. Utilizando medios de cultivo selectivos para inhibir los m.o no deseados.

-1

CUANTIFICACION

Es un metodo muy utilizado en diferentes areas como por ejemplo:

.:. Industria alimenticia (leches, jugos, nectares) .:. Hospitalaria (procesos pato16gicos infecciosos)

,

METODOS DE CUANTIFICACION

Existen metodos que permiten establecer el numero de microorganismos 0 en una muestra dada.

Hay metodos que cuantifican el numero de celulas, y existen otros que cuantifican la masa total de la poblaci6n.

ENTOEN PLA DE MEMBRANA

• •

rrucroorgarusmos y que

posteriormente se coloca sobre una placa.

Fundamento

• Paso de la muestra a traves de una membrana porosa que retiene los

Requiere bastante tiempo (24 horas 0 mas)

Las bacterias crecen en unidad, en cadenas 0 como grumos

RECUENTO EN PLACA POR FILTRO

DE MEMBRANA

Ventajas

Desventajas

Mide el no. De celulas viables

RECUENTO EN PLACA

Fundamento:

• Se basa en la suposicion de que cada bacteria 0 agrupacion de colonia crece y se divide para formar una sola colonia.

• Dispersion de la muestra

• Forrnacion de colonias

VACADO EN PLACA?

• EI metodo mas usual para realizar el conteo de celulas viables se basa en contar el numero de celulas de una muestra que es capaz de formar colonias al sembrarlo en un medio adecuado.

• Metodo de extension en placa.

• Metodo de vertido en placa (0 diluciones).

Desventajas

RECUENTO EN PLACA

Ventajas

Mide el no. De celulas viables

Microorganismos sensibles al calor pueden resultar dafiados por el agar fundido

Requiere bastante tiempo (24 horas 0 mas)

Las bacterias crecen unidad, en cadenas 0 como grumos.

SIEMBRA POR VERTIDO DE PLACA

Ventajas

Mide el no. De celulas viables

Microorganismos sensibles al calor pueden resultar dafiadosporelagarfundido

Desventajas

Requiere bastante tiempo (24 horas 0 mas)

Las bacterias crecen unidad, en cadenas 0 como grumos.

En medios diferenciales las colonias que se forman debajo de la superficie no son adecuadas (solo las de la superficie)

FACTORES QUE AFECTAN EL VACIADO EN PLACA

• Tipo de muestra y microorganismos presentes en ella.

• Procesamiento de la muestra.

• Temperatura del medio de cultivo.

• Tipo de diluyentes.

• Es importante que haya un numero determinado de colonias en la placa (30-300).

RECUENTO EN PLACA POR EXTENSION SU PERFICIAL

FUNDAMENTO

• Se basa en la extension de la muestra, agregada can un asa calibrada sabre una placa seca.

RECUENTO EN PLACA POR

EXTENSION SUPERFICIAL

Ventajas

Desventajas

rapido

No diluciones

Poco exacta

Carencia de uniformidad en la extension

tiempo

Muy poca muestra

Evita el contacto de las celulas con el agar fundido

DILUCIONES SERIADAS

FUNDAMENTO:

VENTAJAS • Es facil,

DESVENTAJAS

• Afecta el no hacer bien las diluciones.

• No homogenizar bien la

muestra.

• No contar correctamente.

• Cuenta los viables mesofilos.

• No cuenta anaerobios.

• Cuantifica muestras solidas y trabajar mas.

• No cuantifica bacterias exigentes nutricionalmente.

FUNDAMENTO:

VENTAJAS

• Su rapidez.

• No ocupas material de laboratorio.

• Se utiliza poca muestra.

• No hay restricci6n de unidades formadoras de colonias.

• El tiempo.

MILES-MISRA

Num, De bacterias (ml.) = NxF V

FUNDAMENTO:

DESVENTAJAS

• No es facil,

• Hay restriccion,

• El tiempo.

RECUENTO ELECTRONICO

• CONTADORES ELECTRONICOS

Un volumen fijo de una suspension bacteriana es forzada a pasar desde un compartimiento al otro a traves del pequefio conducto, en un muy breve intervalo de tiempo. Cuando un microorganismo pasa al nuevo compartmuento, la resistencia de este se incrementa debido a que la conductividad de la celula es menor que la del medio. Estos cambios en la resistencia son convertidos en pulsos 0 voltaje y contados

RECUENTO ELECTRONICO

• Es posible contar y medir varios miles de particulas por segundo, independientemente de su forma, color y densidad.

• Ciertas bacterias muy pequefias producen cambios en la resistencia que son comparables al "ruido" generado por la turbulencia que se desarrolla al pasar el fluido por el orificio.

RECUENTO MICROSCOPICO

• RECUENTO EN CAMARA DE PETROFF-HAUSER Un volumen conocido de muestra es depositado en un portaobjetos especial para cuenta, esta consiste de un portaobjetos excavado y cuadriculados que facilitan el recuento por unidad de superficie y de volumen.

()_()05 om

RECUENTO MICROSCOPICO

• Este tipo de recuento se utiliza para determinar la cantidad total de microorganismos de una muestra.

Es un metodo que resulta ser bastante exacto debido a que tiene una dimension que facilita el conteo de los microorganismos por cuadrante.

Cuadrado 1.00 x 10-2
total 2.00 x 10-5 5.00 X 104
Cuadrado 4.00 x 10-4
grande 8.00 x 10-7 1.25 x 106
Cuadrado 2.50 x 10-5
- II 5.00 x 10-8 2.00 X 107
pequeno CUANTIFICACION

Bacterias coriaaa: • ---

Mmero total de microorganismos diluc i6n

ml Numero de cuadrado: contado: • Volumen del cuadraao

CAMARA PETROFF HAUSER

• Ventajas:

• Es un metodo que se realiza facilmente.

• Su procedimiento es rapido,

• Si se realiza adecuadamente es muy exacto.

• Desventajas:

• No es posible diferenciar microorganismos vivos de microorganismos muertos

CUANTI FICACION

• r/Dilucion: Inversa de la dilucion utilizada para llenar la camara de recuento.

• Numero de cuadrados contados: Cantidad de cuadrados de la camara que se utilizaron para contar un el numero de bacterias.

• Volumen del cuadrado: Volumen de cada cuadrado de la camara, Depende del tipo de cuadrado en donde se realize el recuento. Por ejemplo, cada cuadrado pequefio tiene un volumen de 5 x 10-8 ml (50 11m x 50 11m x 20 11m = 5 x 104 11m3 = 5 x 10-8 ml)

,

METODa DE BREED

FUNDAMENTO:

• Es un metodo directo para cuantificar celulas totales en el cual un volumen conocido de la muestra diluida se extiende uniformemente sobre la superficie de un portaobjetos normal.

• Observando al microscopio el campo de observaci6n contando los microorganismos en diversos campos microsc6picos.

• Se obtiene el valor medio de celulas por campo que se logra

multiplicando el numero de campos microsc6picos

comprendidos en la preparaci6n.

• Ello da el nurnero de microorganismos existentes en el volumen conocido que a su vez al multiplicarse por 100 indica el total de microorganismos /rnl 0 g de muestra original.

VENTAJAS

• Es un metoda rapido

• Es un metodo economico

DESVENTAJAS

• Es imposible diferenciar a las celulas vivas de las muertas.

• Cuando se tienen muestras que contienen poblaciones pequefias, el margen de error es grande.

• EI metodo no suele ser adecuado para suspensiones con baja densidad celular.

• Las pequefias celulas son dificiles de ver.

,

APLICACION

• Utilizada para contar bacterias de la leche.

• Es usado para diagnostico de mastitis bovina (diagnostico subclinico).

, , ,

METODO DEL NUMERO MAS PROBABLE

(NMP)

FUNDAMENTO:

• Es un metodo estadistico que se fundamenta en la teoria de la probabilidad.

• En el se preparan multiples series de diluciones decrecientes, con cada dilucion se inoculan varios tubos que contienen el medio de cultivo adecuado.

APLICACION ES

• Este metodo se utiliza para contar microorganismos dificiles de cultivar en medio solido, 0 para determinar el numero de celulas que pueden crecer en un medio liquido determinado, como el analisis para determinar la contarninacion del agua potable.

-- LOMETRIA (TURBIDEZ)

FUNDAMENTO.

En una suspension microbiana, la cantidad de m.o esta directamente relacionada con la turbiedad 0 densidad optica de la misma, e inversamente relacionada con la cantidad de luz que pasa por la misma. A mayor turbidez mayor numero de bacterias.

/

ESCALA MCFARLAND

Es una curva estandar construida con una suspension testigo de concentracion celular conocida. Se hasa en la mezcla de concentraciones crecientes de BaC12 con concentraciones decrecientes de acido sulfurico obteniendose un precipitado de Sulfato de hario en cantidades diferentes.

VENTAJAS

·:·Rapido

.:. Poca muestra

·:·Sensible

DESVENTAJAS

.:. No debe tener materia organica en

. ,

suspensIon .

• :. No debe tener color .

• :. Es total .

• :. La curva no esta hecha a base de bacterias si no de sales.

ibliografia

Vullo. Microbiologia en la practica, Editorial atlante. Buenos Aires Argentina. 2000. pag 61-73

Dauget. Tecnicas en bacteriologia. Editorial Jims. Barcelona Espana. 1977. page 82-86.

Alejandro Camacho; Ruth Alvarez. Manual de microbiologia

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