Carrera: INGENIERÍA DE ALIMENTOS

Materia: MICROBIOLOGÍA DE ALIMENTOS I - INA 034 I / 2022

TÉCNICAS DE EVALUACIÓN DE POBLACIONES MICROBIANAS

OBJETIVOS

• Adquirir conocimientos básicos teóricos y prácticos de la siembra y aislamiento de bacterias y

hongos (levaduras y mohos).

• Estimar el número de microorganismos presentes en una muestra mediante algunos métodos de

rutina en el Laboratorio de Microbiología de Alimentos.

En la naturaleza los microorganismos se encuentran en comunidades más o menos complejas. Son

diversos los procedimientos existentes para el estudio de los mismos que dependerán del tipo de
microorganismo y del período de tiempo de conservación que se requiera. Para ello existen técnicas de
siembra, conservación y mantenimiento de los cultivos microbianos.

Una técnica esencial en Microbiología es la de obtención de cultivos puros, a partir de los cuales
podemos realizar estudios sobre las propiedades de los microorganismos.

Un cultivo puro es aquel que contiene una sola clase de microorganismo. Para poder obtenerlo es
necesario concurrir a las técnicas conocidas como aislamiento.

SIEMBRA Y AISLAMIENTO

La técnica más usada en el Laboratorio de Microbiología de Alimentos es probablemente la

transferencia de microorganismos de un ambiente a otro con el propósito de cultivarlos. Una vez que el
medio de cultivo está debidamente preparado se procede a inocular la muestra deseada.

Siembra: Sembrar o inocular es introducir artificialmente una porción de la muestra (inóculo) en un

medio de cultivo adecuado con el fin de iniciar un cultivo microbiano y se lleva acabo de diferentes
metodologías de acuerdo al fin que se persiga. Luego de sembrado, el medio de cultivo se incuba a una
temperatura adecuada para el crecimiento.

Dependiendo del estado físico del medio de cultivo (líquido o sólido) la siembra se puede realizar con:
asa, punta, varilla de vidrio en ángulo, pipeta estéril.

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Aislamiento: El aislamiento de microorganismos consiste en obtener un solo tipo de los mismos a
partir de una población mixta. En la naturaleza, los microorganismos se encuentran asociados, por lo
que se recurre a la técnica de aislamiento para separarlos. Estas técnicas nos conducen a la obtención de
un cultivo puro o axénico, que es aquel que contiene una sola especie microbiana. Los cultivos puros
son útiles para identificar y estudiar las características de un microorganismo dado.

Se pueden realizar aislamientos por métodos generales y por métodos especiales.

Métodos generales de aislamiento

Estos métodos utilizan medios de cultivos sólidos en caja de Petri.

Cuando el microorganismo que se desea aislar e identificar se encuentra en baja proporción en la

muestra, o interesa un solo tipo de microorganismo, se realiza un procedimiento previo, llamado
enriquecimiento, que involucra una primera etapa de aumento del número de microorganismos del tipo
deseado en relación al resto de la población. Luego se aísla por el método de estrías o por dilución en la
superficie de medio sólido y se identifica.

Cualquiera sea el método empleado, si se realiza correctamente, podrán obtenerse colonias aisladas.
Estas pueden pertenecer a distintas especies bacterianas, las que generalmente se diferencian
macroscópicamente.

En general cada colonia se considera formada a partir de una célula bacteriana, aunque esto no es del
todo cierto pues puede darse el caso de que dos o más células den origen a una colonia. Si todas
pertenecen a una misma especie, la colonia resultante será pura. Caso contrario, la finalidad del trabajo
no se habrá cumplido, no lográndose el aislamiento.

Para comprobar la pureza de la colonia aislada se puede realizar una coloración de Gram. Para ello se
pica la colonia y se la identifica con una marca en el fondo de la caja con un número identificatorio. Se
hace el extendido con una porción de la colonia y si todas las células observadas coinciden
morfológicamente, se repica el resto de la colonia en un tubo con agar en estría para obtener un cultivo
puro.

A veces la igualdad morfológica en la coloración de Gram resulta engañosa por existir bacterias de
diferentes especies (pero iguales morfológicamente) presentes dentro de la colonia seleccionada pero
en muy bajo número debido a su imposibilidad de desarrollar. Por consiguiente es necesario realizar
siempre aislamiento para observar la uniformidad de las colonias.

Métodos especiales de aislamiento

• Métodos derivados de las propiedades de las bacterias

• Métodos biofísicos: Se basan en el empleo de condiciones físicas determinadas que afectan a

ciertos microorganismos y no a otros.

• Métodos biológicos: Estos métodos utilizan la propiedad que tienen ciertos animales de
laboratorio de ser receptivos a algunos microorganismos.

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Entendemos por crecimiento microbiano al aumento del número de células en una población a lo
largo del tiempo.

También puede medirse en función del aumento de la masa bacteriana (biomasa).

Se llama tasa de crecimiento al cambio en el número de células o de masa bacteriana por unidad de
tiempo.

Existen diversos métodos para evaluar el tamaño de la población bacteriana presente en una muestra
determinada. Algunos de ellos son directos y otros indirectos, como veremos más adelante.

DIVERSOS MODOS DE REPRODUCCIÓN MICROBIANA

El aumento de la población microbiana durante el crecimiento es consecuencia de la reproducción, que

puede ser distinta para diversos tipos de microorganismos. Por otra parte la reproducción puede ser
sexuada, lo que es muy poco frecuente (generalmente asexuada).

Las bacteria y levaduras, organismos unicelulares (procariotas y eucariotas respectivamente) se

reproducen por fisión, pero las dos células bacterianas resultantes de la célula original, son idénticas
entre sí. En cambio de la reproducción de las levaduras resulta una célula hija y una célula madre, lo
que origina una gran disparidad en la edad de las células en el cultivo.

Puede suceder, para ciertas especies de levaduras y en ciertas condiciones, que las células resultantes
estén unidas formando filamentos llamados seudomicelio.

Un micelio verdadero es formado por los mohos y las bacterias filamentosas, microorganismos
particularmente importantes por los numerosos antibióticos que son capaces de sintetizar. Su
reproducción se realiza por alargamiento y ramificación de los filamentos.

El crecimiento microbiano no es acompañado de un aumento del número de células, pero sí de un

aumento de la biomasa microbiana. Las técnicas de evaluación de la población a emplearse para
microorganismos unicelulares y filamentosos serán necesariamente distintas.

REVISIÓN DE ALGUNAS TÉCNICAS DE EVALUACIÓN DE POBLACIONES

MICROBIANAS

La medida del crecimiento y muerte de los microorganismos en el laboratorio requiere técnicas

especiales. Algunas técnicas son medidas indirectas. Estas miden una propiedad -la turbidez, el peso
seco, o una actividad metabólica- de la masa de células de una población. Otras técnicas son directas.
Las medidas directas incluyen los recuentos directos al microscopio o recuento electrónico, el
recuento en placa, o el cálculo del Número Más Probable (NMP). (A veces la filtración es una
etapa preliminar en las medidas directas.)

El recuento directo al microscopio o el recuento electrónico proporcionan un recuento de todas las

células, tanto las vivas como las muertas. Un recuento de viables mide sólo las células vivas de una
población, es decir, aquellas capaces de reproducirse (viable significa “que puede vivir”).

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Los recuentos en placa y el NMP son recuentos de viables. Cuando se usa la filtración, se obtiene un
recuento de viables. Cada una de estas técnicas tiene sus ventajas y sus inconvenientes.

Métodos Indirectos:

Turbidez

Debido a que todas las células de un cultivo axénico (cultivo puro, cultivo no contaminado) son
aproximadamente del mismo tamaño, su número es proporcional a su peso. En otras palabras, dos
células pesan el doble que una célula, cuatro células pesan el doble que dos, y así sucesivamente. De
esta manera, podemos estimar el tamaño de una población microbiana a partir de su peso total.

Generalmente, los microbiólogos no recogen de manera laboriosa las células y las pesan. En su lugar,
utilizan un instrumento óptico denominado espectrofotómetro (Figura 1).

Luz Luz no
incidente dispensada

Filtro o Prisma Muestra con Fotocélula (mide Registrador

células la luz no dispensada)

Figura 1 Descripción de un Espectrofotómetro para la medida del crecimiento

Un espectrofotómetro mide la cantidad de luz que transmite una solución o un cultivo líquido de
células microbianas. Cuanta mayor masa de células tenga un cultivo, mayor será su turbidez, se
transmitirá menos luz y la lectura en el espectrofotómetro será mayor.

Puesto que un espectrofotómetro mide con exactitud lo que vemos cuando examinamos visualmente un
cultivo líquido, no es muy sensible con respecto al número de células bacterianas. Para que el líquido
se vea turbio, el cultivo líquido debe contener alrededor de 10 millones de células bacterianas de un
tamaño intermedio por mililitro y, por lo tanto, un espectrofotómetro no es útil para detectar una
pequeña contaminación, es decir, la presencia de un pequeño número de células microbianas no
deseadas. Al igual que para la mayoría de los cultivos bacterianos, el espectrofotómetro también puede
emplearse para cultivos de levaduras.

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Generalmente, el espectrofotómetro se utiliza para estimar masa de un cultivo relativamente denso, y
poder así registrar crecimiento de una población microbiana (Figura 2). Para medir la masa o el
número de células con un espectrofotómetro, necesario, en primer lugar, preparar una curva patrón, o
gráfica en la que se relacionan las medidas del espectrofotómetro con la masa celular de un
determinado cultivo.

Figura 2 El espectrofotómetro. (a) El espectrofotómetro mide la turbidez, es decir, la cantidad de luz

que transmite un cultivo, expresada en unidades de absorbancia. La célula bacteriana dispersa la luz, de
manera que no es detectada por el detector sensible a la luz. La curva patrón relaciona la absorbancia
con el número de células bacterianas por mililitro. Una vez que se obtiene, esta curva puede usarse para
convertir cualquier medida de absorbancia en número de células. Por ejemplo, a partir de esta curva,
una lectura de 1,6 unidades de absorbancia significa que el cultivo contiene 100 millones (10 8) de
células por mililitro.

Generalmente los distintos tipos de bacterias producen una turbidez diferente Posteriormente, se puede
determinar a partir de la gráfica la masa celular que se corresponde con cualquier lectura en el
espectrofotómetro. Las curvas patrón también pueden obtenerse para relacionar las lecturas en el
espectrofotómetro con el número células de un cultivo.

Peso seco

El número de células de un cultivo se puede medir dividiendo el peso seco del cultivo por el peso seco
de una célula individual. El peso seco de las células de un cultivo se determina separándolas del medio,
desecándolas y pesándolas. Para obtener una medida precisa, se requieren alrededor de 25 mililitros de
un cultivo relativamente denso. Las células se separan mediante filtración o mediante centrifugación.

Una centrífuga es un instrumento que hace girar unos recipientes denominados tubos de centrífuga a
una velocidad elevada, generando una fuerza centrífuga que hace que las partículas pequeñas, incluidas
las células microbianas, se van al fondo del tubo.

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Luego, se lavan las células, se resuspenden en agua destilada y se filtran o centrifugan de nuevo.
Después del segundo lavado, las células se desecan en un horno a 105 ºC durante unas 24 horas y
luego se enfrían en un desecador, para evitar que capten la humedad del aire.

Un desecador es una cámara que se mantiene con una humedad muy baja, bien químicamente o
mecánicamente, y que se utiliza para desecar los materiales o para mantenerlos desecados. Finalmente,
se pesan las células.

La medida del peso seco es tediosa y requiere un cierto tiempo; además, la muestra debe contener más
de unos 10 millones de células, No obstante, tiene ciertas aplicaciones. Por ejemplo, debe utilizarse
para construir la curva patrón que relaciona las medidas en el espectrofotómetro con las de la masa
celular.

Actividad metabólica

La actividad metabólica puede utilizarse, mediante varios procedimientos, para medir indirectamente la
cantidad de células microbianas. La tasa de formación de productos metabólicos, tales como gases o
ácidos, que produce un cultivo, refleja la masa de células presente en el mismo, Asimismo, la tasa de
utilización de un substrato, como el oxígeno o la glucosa, refleja la masa celular.

Finalmente, la tasa de reducción de determinados colorantes, es otra forma de estimar la masa

microbiana. Por ejemplo, el azul de metileno se vuelve incoloro cuando es reducido por los
componentes de la cadena de transporte de electrones de los microorganismos. Consecuentemente, en
ausencia de oxígeno, que oxida el azul de metileno, la tasa de decoloración de este compuesto mide la
masa microbiana.

La tasa de reducción del colorante es una medida muy indirecta y, por lo tanto, no es una medida
precisa de la masa microbiana. Sin embargo, la técnica puede utilizarse con materiales complejos,
como el suelo o la leche, sin necesidad de usar instrumentos.

Métodos Directos:

Recuento del total de células

El número de células en una población microbiana se puede medir contándolas bajo el microscopio,
método que se llama recuento directo al microscopio. El recuento directo puede hacerse visualmente,
utilizando un microscopio y un portaobjetos especial denominado cámara de recuento. Existen
muchos tipos de cámaras de recuento, pero la cámara de Petroff-Hauser, llamada así en honor de los
que la desarrollaron, tal vez sea la más utilizada en los laboratorios de microbiología.

Todas las cámaras de recuento poseen una profundidad conocida y tienen marcados unos cuadrados de
dimensiones también conocidas. De esta manera, cada cuadrado que observamos al microscopio
representa un volumen determinado de líquido; por ejemplo, un microlitro (0,001 μl). Se puede calcular
cuántas células están presentes en 1 mililitro o en cualquier otro volumen del cultivo, contando las
células de varios cuadrados y haciendo la media. Puesto que las células vivas y las muertas tienen un
aspecto parecido, observadas al microscopio, el recuento directo es un recuento total de células.

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La cámara de recuento de Petroff-Hauser, consiste en un portaobjetos especial con una graduación en
superficie y unas medidas muy concretas (Figura 3):

• Excavación con 0,02 mm de profundidad.

• Área de 1 mm2, dividida en un retículo de 25 cuadrados grandes.
• Cada cuadrado grande está subdividido a su vez en 4 x 4 = 16 cuadrados pequeños.
• O sea, la muestra se distribuye en 16 x 25 = 400 celdillas (cuadrados pequeños).

Una de las mayores ventajas del recuento microscópico es brindar información adicional sobre el
tamaño y la morfología de los objetos contados.

Figura 3 La cámara de recuento de Petroff-Hauser se usa, junto a un microscopio, para realizar un

recuento directo de células. Consta de un portaobjetos que tiene unos pocillos superficiales (0,02 mm
de profundidad). En el fondo del portaobjetos hay grabada una rejilla de 1 mm2, dividida en 25
cuadrados grandes, cada uno de los cuales está dividido en 16 cuadrados más pequeños. De esta
manera, el volumen total de la rejilla es de 0,02 mm 3.

La muestra, una vez dispensada entre el portaobjetos y cubreobjetos, se deja reposar sobre la
plataforma del microscopio durante unos minutos, y se cuenta el número de células en varias celdillas
(normalmente en 16, equivalentes a uno de los cuadrados grandes). Se anota el número n de células
observadas en esas 16 celdillas. Entonces, la concentración celular es fácil de establecer:

n x 25 x 50 x 1000 = concentración en células/ml

El recuento directo al microscopio es tedioso, pero es una forma rápida de estimar la cantidad de
células microbianas. Sin embargo tiene algunas limitaciones:

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 • No se distinguen las células muertas de las células vivas.
• Las células pequeñas son difíciles de ver bajo el microscopio y, posiblemente, se omiten algunas
células.
• La precisión es difícil de lograr.
• Se requiere un microscopio con contraste de fases cuando no se ha teñido la muestra.
• En bacterias móviles, hay que inmovilizarlas previamente, con una mezcla de alcohol y agua.
• Sólo sirve para suspensiones relativamente concentradas (> 10 x 10 6 células/ml). Por debajo de
este valor el número de células vistas en el campo del microscopio es muy pequeño o ninguna
célula.

A continuación tenemos un ejemplo del procedimiento de recuento directo al microscopio utilizando la

cámara de cuenta de Petroff-Hausser (Figura 4):

Rebordes que soportan el cubreobjetos

Aquí se adiciona la muestra; se debe tener Observación al microscopio: se cuentan

cuidado de no permitir que se desborde; el
espacio entre el cubreobjetos y la lámina es
0,02 mm (1/50 mm). La retícula completa
tiene 25 cuadrados grandes, un área total
de 1 mm2 y un volumen total de 0,02 mm3.
todas las células del cuadrado grande: 12
células (en la práctica se cuentan varios
cuadrados y se saca el promedio del
resultado).

Figura 4 Procedimiento de recuento directo al microscopio utilizando la cámara de cuenta de

Petroff-Hausser.

Para calcular la cantidad de células por mililitro de muestra:

12 células x 25 cuadrados grandes = número de células en 0,02 mm 3

12 células x 25 cuadrados grandes x 50 = número de células en 1 mm 3
12 células x 25 cuadrados grandes x 50 x 1000 = número de células en 1 ml (cm3)

Por lo tanto la cantidad de células por mililitro es:

12 x 25 x 50 x 1000 = 1.5 x 10 7 células/ml

Si se cuentan las células de un cuadrado pequeño, el número se multiplica por un factor de 16:
(16 x 25 x 50 x 1000 = 20 000 000)

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Recuento electrónico

Los contadores electrónicos permiten realizar recuentos de bacterias, levaduras no filamentosas y

protozoarios, pero no de hongos y microorganismos filamentosos o miceliares. Estos instrumentos
constan básicamente de dos compartimientos comunicados a través de un pequeño conducto.

En ambos compartimientos hay electrodos que miden la resistencia eléctrica del sistema, y como el
orificio del conducto es muy pequeño y su resistencia es muy alta, la resistencia eléctrica de cada
compartimiento es independiente.

El principio de funcionamiento de estos instrumentos es el que se explica a continuación. Un volumen

fijo de una suspensión bacteriana es forzado a pasar desde un compartimiento al otro a través del
pequeño conducto, en un muy breve intervalo de tiempo. Cuando un microorganismo pasa al nuevo
compartimiento, la resistencia de éste se incrementa debido a que la conductividad de la célula es
menor que la del medio. Estos cambios en la resistencia son convertidos en pulsos o voltaje y contados.
Este tipo de recuento presenta algunos inconvenientes.

Ciertas bacterias muy pequeñas producen cambios en la resistencia que son comparables al “ruido”
generado por la turbulencia que se desarrolla al pasar el fluido por el orificio. No pueden medirse
células que formen filamentos o agregados o soluciones muy concentradas de microorganismos, debido
a que el pasaje de más de una célula en un breve período de tiempo va a ser tomado como una célula
más grande. Es común la obstrucción del orificio por microorganismos muy grandes.

Recuento en placa

Para realizar un recuento en placa se utilizan los métodos de extensión o de vertido en placa,
empleados para cultivar los microorganismos. La técnica consiste en diluir de manera seriada,
generalmente diez veces por cada dilución, una muestra del cultivo y luego sembrar una pequeña
cantidad de cada dilución en una placa o bien mezclarla con el medio a sobrefusión. A continuación, la
placa debe ser incubada en las condiciones adecuadas. Una vez que se han formado colonias visibles,
generalmente después de un día, se seleccionan para el recuento de colonias las placas en las que éstas
están bien separadas.

Las placas que tienen entre 30 y 300 colonias ofrecen una buena relación entre la rapidez del recuento y
la precisión en el resultado obtenido. El número de colonias de una placa, junto con la dilución de la
muestra que se inoculó en ella, nos permite calcular la concentración de células presente en la muestra
original (Figura 5). El recuento en placa es un recuento de viables, Se basa en el principio de que una
única célula viable originará una colonia visible, cuando se siembre en una placa de agar.

La ventaja del método de recuento en placa es su gran sensibilidad. Si se utiliza un medio y unas
condiciones de incubación adecuadas, puede detectarse incluso una única célula viva. Además, el
recuento en placa no requiere un equipo complicado. Un inconveniente es que el recuento en placa es
lento y tedioso y no es muy preciso, porque la precisión depende del recuento de un número elevado de
colonias. La precisión aumenta con el número de colonias que se recuentan, ya que disminuye el error
debido al muestreo.

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Figura 5 Un recuento en placa es una medida directa y proporciona un recuento de viables. En primer
lugar, la muestra se diluye seriadamente, transfiriendo 1 ml de la muestra a 9 ml de medio estéril y se
mezclan adecuadamente. Este proceso se repite basta obtener una dilución apropiada en este ejemplo,
1:100000 (10-5). Posteriormente se añade 0,1 ml a una placa de agar nutritivo, bien extendiéndolo en la
superficie de la misma (método de extensión en placa) o mezclándolo con el medio (método de vertido en
placa). Las placas se incuban y se recuentan las colonias que se desarrollan. Debido a razones estadísticas,
las placas deben contener entre 30 y 300 colonias. En este ejemplo, la placa tiene 225 colonias.

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Dicho error es la imprecisión que resulta inevitable, con independencia de lo cuidadosamente que se
hagan las disoluciones y las inoculaciones, porque las muestras no son siempre representativas de la
población total en conjunto. Algunas muestras de un cultivo contendrán más células que otras, pero
en el 95 por ciento de los casos, el número real de células viables no difiere del número determinado
en más del doble de la raíz cuadrada del número de colonias recontadas.

Número Más Probable (NMP)

El método del Número Más Probable (NMP), al igual que el método de recuento en placa, nos
proporciona un recuento de viables. Se basa en el principio de que una única célula viva puede
desarrollarse y producir un cultivo turbio.

El Número Más Probable (NMP) requiere la realización una serie de diluciones seriadas al décimo
de la muestra de cultivo, en un medio líquido adecuado para el crecimiento de dicho organismo
(Figura 6). Posteriormente, se incuban las muestras de dichos tubos problema.

Una vez que ha pasado suficiente tiempo como para que crezca el microorganismo, se examinan los
tubos. Aquellos tubos que fueron inoculados con una o más células microbianas a partir de la
muestra, se pondrán turbios, mientras que los tubos que no recibieron ninguna célula permanecerán
transparentes. A medida que se aumenta el factor de dilución, se alcanzará un punto en el cual
algunos tubos contendrán tan sólo un organismo y otros, ninguno.

Al determinar la probabilidad de que los tubos no recibieran ninguna célula, se puede determinar el
Número Más Probable de microorganismos presentes en la muestra original, utilizando para ello una
tabla estadística. La Tabla 2 muestra una tabla del Número Más Probable (NMP).

La precisión del Número Más Probable aumenta con el número de tubos que se usan, aunque cinco
tubos por dilución se consideran como una relación apropiada entre la precisión y la economía.

El método del NMP se utiliza para contar microorganismos que son difíciles de cultivar en medio
sólido. También se usa para determinar el número de células de un cultivo mixto que pueden crecer
en un medio líquido determinado.

Por ejemplo, puede emplearse para determinar la contaminación del agua potable, determinando el
número de bacterias que pueden crecer en un medio que contiene lactosa. Estas bacterias
probablemente sean Escherichia coli provenientes de aguas residuales contaminadas, y la presencia
de Escherichia coli en el agua potable es una prueba presuntiva de contaminación.

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 Cálculo: factor de dilución (primero usado) x NMP (de la Tabla 2) = número de células/ml de muestra
1000 x 11,0 = 11,000 células/ml

Figura 6 El método del Número Más Probable (NMP) proporciona un recuento de viables. Al aumentar el
factor de dilución, se alcanza un punto en el que algunos tubos contienen sólo un organismo y los otros,
ninguno. A partir del número, determinado por los tubos que presentan turbidez en tres diluciones sucesivas
(en este caso 5, 3, 1), puede determinarse el Número Más Probable de células estadísticamente (11,0) en la
primera de las tres diluciones, mediante unas tablas del Número Más Probable (Tabla 2). Este valor,
multiplicado por el factor de dilución nos proporciona el número de células viables de la muestra.

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 Tabla 2 Tablas del Número Más Probable (NMP)

Número de tubos con turbidez Número de tubos con turbidez

inoculados a partir de tres NMP inoculados a partir de tres NMP
diluciones sucesivas diluciones sucesivas
0 1 0 0,18 5 0 0 2,3
1 0 0 0,20 5 0 1 3,1
1 1 0 0,40 5 1 0 3,3
2 0 0 0,45 5 1 1 4,6
2 0 1 0,68 5 2 0 4,9
2 1 0 0,68 5 2 1 7,0
2 2 0 0,93 5 2 2 9,5
3 0 0 0,78 5 3 0 7,9
3 0 1 1,1 5 3 1 11,0
3 1 0 1,1 5 3 2 14,0
3 2 0 1,4 5 4 0 13,0
4 0 0 1,3 5 4 1 17,0
4 0 1 1,7 5 4 2 22,0
4 1 0 1,7 5 4 3 28,0
4 1 1 2,1 5 5 0 24,0
4 2 0 2,2 5 5 1 35,0
4 2 1 2,6 5 5 2 54,0
4 3 0 2,7 5 5 3 92,0
5 5 4 160,0

Filtración

Los métodos que dependen de la formación de colonias (recuento en placa) o del desarrollo de turbidez
(número más probable) pueden detectar una única célula microbiana viable, pero debido a razones
prácticas, sólo se utiliza alrededor de un mililitro de la muestra corno inóculo para la placa o para el
tubo. Por lo tanto, no se detectan las poblaciones con menos de una célula por mililitro.

Supongamos que queremos determinar las bacterias que existen en una piscina. La muestra debe
concentrarse antes de proceder al recuento. La concentración de los microorganismos de las muestras
se hace, generalmente, mediante filtración.

Para ello, se hace pasar un volumen conocido de líquido o de aire a través de un filtro de membrana,
haciendo vació. Los poros del filtro son lo suficientemente pequeños como para que no puedan pasar
las células microbianas. Posteriormente se coloca el filtro en un medio sólido adecuado y se incuba. El
número de colonias que se desarrollan es el número de células microbianas viables en el volumen de
fluido que se filtró.

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Generalmente, los resultados se expresan como organismos presentes por litro (Figura 7).

Figura 7 Filtración.

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RECUENTOS POR EL SISTEMA DEL BANCO DE DILUCIONES

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Los diversos métodos de determinación del número de microorganismos se resumen en la Tabla 3.

Tabla 3 Métodos de determinación del número de microorganismos

Microorganismos para Tipo de

Método Usos / Limitaciones
los que se utiliza recuento

Indirecto
Determina la turbidez con un espectrofotómetro;
La mayoría de las rápido y reproducible; la suspensión debe
Turbidez Total
bacterias y levaduras contener más de unos l0 millones de células
por ml; se requiere una curva patrón.
Cualquier Tedioso y requiere un cierto tiempo, pero
Peso seco Total
microorganismo preciso y reproducible.
Requiere un cierto tiempo y puede ser
Actividad Cualquier
Viables impreciso; puede utilizarse con materiales
metabólica microorganismo viable
complejos.

Directo
Cualquier Muy útil para el recuento de un tipo de células
Recuento
microorganismo Total de una mezcla; requiere un cierto tiempo; no es
microscópico
unicelular adecuado para cultivos diluidos.
Cualquier Muy útil para el recuento de células de un
Recuento
microorganismo Total cultivo axénico (cultivo puro) rápido y preciso;
electrónico
unicelular no debe estar presente material extraño.
Muy sensible - puede detectar incluso una
Cualquier
Recuento en célula; lento y tedioso; para evitar el error
microorganismo Viables
placa debido al muestreo, se debe recontar un gran
unicelular viable
número de colonias.
Utilizado para microorganismos que son
Número más Cualquier difíciles de cultivar en medio sólido y para
Viables
probable microorganismo viable determinar contaminación por Escherichia coli
en aguas; requiere un cierto tiempo.
Se concentra una muestra, de manera que se
Cualquier puede recontar un pequeño número de células a
Filtración Viables
microorganismo viable partir de grandes volúmenes de un líquido o de
un gas.

• Nota.- Bibliografía consultada y descargada: “Varias fuentes de la Internet”.

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