Conteo bacteriano

El conteo bacteriano señala la magnitud de la población total bacteriana, en ese sentido se puede determinar por
muchas técnicas que se basan en algunos de los siguientes tipos de medida: cuenta celular (directamente al microscopio
o mediante un contador electrónico de partículas o indirectamente con la cuenta de colonias), masa celular (en forma
directa pesando el contenido celular del nitrógeno o indirectamente por turbidimetría, proporcional al número de células)
y actividad celular (indirectamente relacionando el grado de actividad bioquímica al tamaño de la población
bacteriana).Existen muchos medios diferenciales, en la practica rutinaria se usan los siguientes:
Tipos de conteo bacteriano

 Conteo en caja de petri: Método más usado para contar bacterias. Un caldo de
cultivo con microorganismos es diluido y posteriormente muestras del mismo son distribuidas en la caja de petri
contenedora de agar. Es de suponerse que cada célula se dividirá en sus múltiples alrededores para producir colonias
separadas en el agar. Cada célula es llamada unidad formadora de colonias (UFC). Después de la incubación, el número
de colonias se reflejará en el número de células UFC originalmente presentes. Es importante considerar un número
limitado de colonias pues de no ser así, éstas pueden sobrepoblarse y dificultar el conteo de las mismas (rango sugerido
de acuerdo a FDA 25-250 colonias). El conteo se facilita utilizando un contador de colonias.
Este método es deseable porque arroja el total de células viables (sólo células vivas); en contraste con el conteo
microscópico y el conteo de peso seco. Una desventaja se encuentra en el tiempo que requiere para producir las
colonias, ya que se necesitan como mínimo 24 horas o más. Por otra parte, no es 100% fiable porque regularme las
colonias crecen unidas en cadenas o en grupos.

 Conteo por filtración: Es realizado cuando la cantidad de bacterias es muy pequeña, como en casos de
lagos y arroyos relativamente puros. En esta técnica se necesitan al menos 100 ml. de agua que atraviesen una
membrana delgada de un filtro, con poros tan pequeños que no permitan el paso de bacterias, de esta forma éstas son
retenidas en la superficie del filtro. Posteriormente el filtro es transferido a una caja de petri que cuenta con un caldo
nutritivo, en la cual las colonias surgen de las bacterias en la superficie del filtro. Las colonias bacterianas formadas por
este método son distintivas cuando se ocupan un medio diferencial.
Este método es aplicado frecuentemente en la detección y enumeración de bacterias coliformes, las cuales son
indicadores de contaminación fecal en la comida o en el agua.

 Método del número más probable (NMP): Es una técnica de estimación estadística basada en el
hecho que a mayor número de bacterias en una muestra, mayor será la dilución necesitada para reducir la densidad
hasta el punto en que ninguna bacteria se le permita crecer en la serie de tubos de dilución. Muestras microbianas son
añadidas a tubos con caldos de lactosa y la presencia o ausencia de gas formado en la fermentación y da un estimado
de número de células.
Este método es más útil cuando las bacterias que están siendo contados no crecerán en medios sólidos, como en el
caso de Chemoautotrof phic nitrifying bacteria. También es útil cuando el crecimiento de la bacteria es en un medio
líquido diferencial, usado para identificar microbios, como en bacterias coliformes. El NMP es la única afirmación en la
cual existe 95% de probabilidad que la población bacteriana sea de rango correcto, siendo el número estadístico más
probable.

 Determinación directa por microscopio: Las células se pueden contar como un frote teñido colocando
en la preparación un volumen conocida de la suspensión de células sobre un área conocida del portaobjetos. Después
de haber fijado y teñido el frote, es posible contar con un microscopio las bacterias.
Como no es práctico recorrer toda el área, se cuenta el número de células en unos cuantos campos microscópicos
seleccionados al azar. Si el diámetro del campo microscópico se mide con micrómetro objetivo, se puede calcular
fácilmente el área, entonces el número de campos en 1 cm2 se multiplicará por el promedio del número de células por
campo y después por 100 (si se vierte .01 ml) el resultado será igual al número de células por mililitro. Este método es
susceptible a muchas críticas debido a su falta de uniformidad al momento de hacer el frote.
 Método de turbiedad: Para algunos experimentos, es necesario estimar turbiedad, ya que es una forma
práctica de monitorear el crecimiento bacteriano. Como una bacteria se multiplica en un medio líquido, éste se torna
turbio o de aspecto nublado por las células.
El instrumento usado para medir la turbiedad es un espectrofotómetro (colorímetro). En el espectrofotómetro, un haz de
luz es transmitido a través de la suspensión bacteriana a un detector sensible a la luz. Mientras incremente el número de
bacterias, menor será la luz captada por el detector. Este cambio en la luz se registrará en la escala del instrumento
como el porcentaje de transmisión. También se registra una expresión logarítmica llamada absorbancia (algunas veces
nombrada densidad óptica), un valor derivado del porcentaje de transmisión que puede ser reportado. Más de un millón
de células por milímetro deben estar presentes para que la primera señal de turbiedad sea visible. Aproximadamente de
10 millones a 100 millones de células por mililitro son necesitadas para hacer una suspensión suficientemente turbia para
leer en el espectrofotómetro. La turbiedad no es útil para medir contaminación en líquidos por la pequeña cantidad
relativa de bacterias.

 Determinación del peso seco en las células: Es el método más directo para las mediciones
cuantitativas de la masa celular y probablemente el más fácilmente realizable y reproducible, aunque se debe aplicar
sólo en suspensiones celulares muy densas y las células deben ser lavadas muy bien para removerles todo material
extra.
Se utiliza para bacterias filamentosas y mohos. En este proceso, el fungus es removido del medio de crecimiento, filtrado
para remover material extraño, drenado en un secador y después es pesado.

Métodos de recuento.
Los métodos para el seguimiento de la evoluci´pon de un cultivo microbiano pueden clasificarse
en directos e indirectos. Los métodos directos se basan en la medida de la evolución del número de células vivas
(técnicas de plaqueo) o del número de partículas (técnicas microscópicas y de contadores de partícuas). Ls métodos
indirectos se basan en la medida de algún parámetro del cultivo que nos permite deducir información sobre la evolución
del número de microorganismos. La elección de un método de seguimiento del cultivo en concreto depende de las
características del cultivo y del proceso.
Entre los métodos principales de recuento de microrganismos podemos destacar:
1.- Las técnicas de recuento microscópico de células sin fijar usando microscopía de contraste de fae. Para ello se
cuenta el número de partículas en un volumen determinado usando una célula de Petroff-Hauser o de Neubauer
(portaobjetos modificado en e que una rejilla nos permite conocer el volumen que estamos observando). El
procedimiento es rápido y sencillo; pero no permite distinguir células vivas inmóviles de células muertas.
2.- Contaje de partículas utilizando sistemas automáticos del tipo Coulter Counter. La operación de estos sistemas es
sencilla (método de empleo) y permite rápidamente determinar el número de patículas presentes en una suspesión y la
distribución de sus tamaños. El problema es que no distingue entree células vivas y muertas ni entre células y agregados
de material insoluble presente en la suspensión del cultivo.
3.- Técnicas de recuento en placa, basadas en colocar en un medio de cultuivo adecuado un volumen determinado de
muestra. Cada una de las células aisladas dará lugar, después de la incubación correspondiente, a una colonia de forma
que el número de estas nos permitirá estimar el número de células presentes en la muestra plaqueada (sembrada). El
sistema es fácil de utilizar en el caso de células aisladas (no sirve en el caso de hongos filamentosos, por ejemplo).
Puede realizarse sembrando en superficie (extendiendo un volumen dado de muestra sobre el medio de cultivo sólido) o
en profundidad (mezclando un volumen dado de muestra con el medio de cultivo antes que solidifique). Esta última
opción permite realizar el recuendto de microorganismos microaerófilos que no crecen bien en la superficie de las placas
de cultivo. Para que el sistema de recuento en placa tenga validez estadística, es necesario contar entre 30 y 300
colonias con objeto de disminuir el error de la medida.
4. Técnicas turbidométricas basadas en la medida de la turbidez de los medios de cultivo en los que crecen
microorganismos unicelulares. La turbidez es proporcional a la masa de las partículas en suspensión (células) y su
medida nos permite estimarla. Para ello se utiliza un equipo similar al que se emplea en la medida de la absorbancia de
luz por disoluciones coloreadas (colorímetro, por ejemplo). Las medidas se hacen a una longitud de onda adecuada
(normalmente en el entorno de 550 nm) y los valores se suelen denominar valores de densidad óptica. La limitación de
este sistema, por otra parte muy sencillo, es que no distingue células vivas de muerta y que normalmente no es capaz de
detectar densidades celulares menores a 10.000 células por mililitro.
5.- Medida de peso seco. El sistema consiste en la filtración del cultivo a través de una membrana que retenga las
células y su posterior desecación hasta peso constant. El sistema, obviamente, no disferencia células vivas de muertas y
su sensibilidad es limitada.
6.- Medida del ATP. Es una medida relativamente sencilla basada en la emisióin de luz por la luciferasa de luciérnaga
(Photimus pyralis) en presencia de O2 y de ATP. De esta forma se puede medir la concentración de ATP en un volumen
dado de cultivo. Esta medida es interesante porque la concentración de ATP decae rápidamente en las células muertas,
de forma que esa medida indirecta detecta únicamenta las células vivas.

Técnica mesófilos en placa

En este grupo se incluyen todas las bacterias, mohos y levaduras capaces de desarrollarse a 30º C en las condiciones
establecidas. En este recuento se estima la micro flora total sin especificar tipos de microorganismos. Refleja la calidad
sanitaria de un alimento, las condiciones de manipulación, las condiciones higiénicas de la materia prima. Un recuento
bajo de aerobios mesófilos no implica o no asegura la ausencia de patógenos o sus toxinas, de la misma manera un
recuento elevado no significa presencia de flora patógena. Ahora bien, salvo en alimentos obtenidos por fermentación,
no son recomendables recuentos elevados. Un recuento elevado puede significar:-Excesiva contaminación de la materia
prima-Deficiente manipulación durante el proceso de elaboración-La posibilidad de que existan patógenos, pues estos
son mesófilos-La inmediata alteración del producto. El recuento de mesófilos nos indica las condiciones de salubridad de
algunos alimentos.

Técnica cuenta coliformes en placa

La denominación genérica coliformes designa a un grupo de especies bacterianas que tienen ciertas características
bioquímicas en común e importancia relevante como indicadores de contaminación del agua y los alimentos.
La bacteria principal del grupo, la Escherichia coli, ("bacteria del intestino).
En la higiene de alimentos los coliformes no se consideran indicadores de contaminación fecal sino solamente
indicadores de calidad.
El grupo de los microorganismos coliformes es el más ampliamente utilizado en la microbiología de los alimentos como
indicador de prácticas higiénicas inadecuadas.

METODOLOGIA
Colocar en cajas Petri por duplicado 1 ml de la muestra líquida directa o de la dilución primaria, utilizando para tal
propósito una pipeta estéril.
1.- Repetir el procedimiento tantas veces como diluciones decimales se requiera sembrar, utilizando una pipeta estéril
diferente para cada dilución.
2.- Vertir de 15 a 20 ml del medio RVBA fundido y mantenido a 45 ± 1,0°C en baño de agua. En el caso de utilizar cajas
de Petri de plástico se vierte de 10 a 15 ml del medio. El tiempo transcurrido entre la preparación de la dilución primaria y
el momento en que se vierte el medio de cultivo, no debe exceder de 20 minutos.
3.- Mezclar cuidadosamente el inóculo con el medio con seis movimientos de derecha a izquierda, seis movimientos en
el sentido de las manecillas del reloj, seis movimientos en el sentido contrario al de las manecillas del reloj y seis de atrás
para adelante, sobre una superficie lisa y nivelada. Permitir que la mezcla solidifique dejando las cajas Petri reposar
sobre una superficie horizontal fría.
4.- Preparar una caja control con 15 ml de medio para verificar la esterilidad.
5.- Después de que está el medio completamente solidificado en la caja, verter aproximadamente 4 ml del medio RVBA a
45 ± 1,0°C en la superficie del medio inoculado. Dejar que solidifique.
6.- Invertir las placas y colocarlas en la incubadora a 35°C, durante 24/48 ± 2 horas.
7.- Después del periodo especificado para la incubación, contar las colonias con el contador de colonias.
8.- Seleccionar las placas que contengan entre 15 y 150 colonias. Las colonias típicas son de color rojo oscuro,
generalmente se encuentran rodeadas de un halo de precipitación debido a las sales biliares, el cual es de color rojo
claro o rosa, la morfología colonial es semejante a lentes biconvexos con un diámetro de 0,5 a 2,0 mm.

Número más probable

El método del Número más probable (NMP) (Most probable number - MPN - en inglés), también conocido como el
método de los ceros de Poisson, es una forma de obtener datos cuantitativos en concentraciones de elementos discretos
a partir de datos de incidencia positiva/negativa. Es una estrategia eficiente para estimar densidades de población que se
emplea cuando una evaluación cuantitativa de elementos individuales no es factible.
Descripción
El método se basa en determinar la presencia o ausencia (positivo o negativo) de atributos específicos de
microorganismos en copias obtenidas por diluciones consecutivas a partir de muestras de suelo u otros ambientes. Se
basa en el principio de que una única célula viva puede desarrollarse y producir un cultivo turbio. El método requiere la
realización de una serie de diluciones en serie de la muestra de cultivo, en un medio líquido adecuado para el
crecimiento de dicho organismo de un volumen diez veces mayor. Luego, se incuban las muestras de esos tubos y,
pasado un tiempo, se examinan los tubos. Aquellos tubos que recibieron una o más células microbianas procedentes de
la muestra, se pondrán turbios, mientras que los tubos que no recibieron ninguna célula permanecerán transparentes.
Al aumentar el factor de dilución, se alcanza un punto en el que algunos tubos contendrán tan sólo un microorganismo y
otros tubos no contendrán ninguno. Al calcular la probabilidad de que los tubos no hayan recibido ninguna célula, se
puede estimar el número más probable de microorganismos presentes en la muestra original, a partir de una tabla
estadística.1
La precisión del método del número más probable aumenta con el número de tubos que se usan; cinco tubos por dilución
se consideran como una relación adecuada entre precisión y economía.
Una condición del método es la necesidad de poder reconocer un atributo específico de la población en el medio de
crecimiento que se emplee. La estimación de la densidad poblacional se obtiene del patrón de ocurrencia de ese atributo
en sucesivas diluciones en serie y el empleo del cálculo probabilístico.2
Hay muchas entidades discretas que son fáciles de detectar pero difíciles de contar. Una aplicación es el de cualquier
clase de reacción de amplificación o reacción de catálisis que impide una cuantificación fácil, pero permite que su
presencia sea detectada de modo muy sensible. Algunos ejemplos comunes
son: crecimiento de microoganismos, acción enzimática, o catálisisquímica. El método del NMP supone tomar la
disolución original o muestra y subdividirla en un factor (frecuentemente 10 veces,o 2 veces) y evaluar la
presencia/ausencia en múltiples subdivisiones.
El grado de dilución para el cual comienza a aparecer la ausencia indica que los elementos se han diluido tanto que hay
muchas submuestras en las que no aparece. Un juego de repeticiones para cualquier concentración dada permite una
resolución más fina, para usar el número de muestras positivas y negativas que estiman la concentración original dentro
del apropiado orden de magnitud.