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HEMATOLOGIA

Volumen 9 - N 1, 2005

Automatizacin en hematologa
Nilda E. Fink
Ctedra de Hematologa, Departamento de Ciencias Biolgicas,
Facultad de Ciencias Exactas, Universidad Nacional de La Plata.
47 y 115, 1990 La Plata, Argentina. E-mail: fink@biol.unlp.edu.ar

Fecha de recepcin: 1/3/05

Fecha de aceptacin: 20/4/05

RESUMEN
Gran parte de la prctica del laboratorio hematolgico
se relaciona con observaciones que incluyen la identificacin de tipos de clulas y la interpretacin de la composicin de las poblaciones celulares sanguneas. Esta revisin describe la metodologa empleada en los instrumentos automatizados para el estudio hematolgico convencional, incluyendo la medicin de Hb, recuento de
glbulos rojos e ndices eritrocitarios, el recuento de
plaquetas, el recuento total y diferencial de glbulos
blancos y reticulocitos. Se describen las diversas tecnologas utilizadas para realizar las mediciones, ejemplificando su uso en los contadores hematolgicos automatizados modernos disponibles comercialmente.
Palabras claves: Automatizacin, Hematologa, Sistemas analticos, Tecnologa

Muchas de las mediciones en el campo de la

Hematologa conciernen a variables continuas. Algunos ejemplos de este tipo de variables son la medicin de concentraciones de hemoglobina (Hb) en la
sangre y el hierro, as como su capacidad total de
unin en suero. Por otra parte, gran parte de la prctica de la Hematologa se relaciona con observaciones que incluyen la identificacin de tipos de clulas
y la interpretacin de la composicin de las poblaciones celulares sanguneas1. Los temas centrales que se
abordarn a continuacin se centrarn principalmente
sobre estas determinaciones discontinuas.
En relacin con el recuento de clulas sanguneas,
los mtodos manuales son la base de algunos mtodos de referencia en el laboratorio hematolgico, a los
que an es necesario recurrir cuando hay discrepancia con los mtodos automatizados. Suelen tambin
ser mtodos de rutina en laboratorios pequeos de
algunos pases, pero dada la enorme cantidad de informacin disponible sobre los mismos2, en este trabajo slo nos referiremos a los mtodos automatizados.

REVISIN

HEMATOLOGIA, Vol. 9 N 1: 4-16

Enero-Abril, 2005

FUNDAMENTOS TECNOLGICOS Y SISTEMAS

ANALTICOS EN EL RECUENTO AUTOMATIZADO
DE CLULAS SANGUNEAS
A continuacin trataremos sobre la metodologa
empleada en los instrumentos automatizados para el
estudio hematolgico convencional, incluyendo el
recuento de plaquetas y el recuento diferencial de
glbulos blancos. El recuento de reticulocitos tambin
ser considerado porque en la actualidad puede realizarse tanto en contadores automatizados que incluyen el recuento en forma directa, o mediante un procedimiento especial previo en otros tipos de contadores (semiautomatizados).
En primer lugar, se describirn las diversas tecnologas utilizadas para realizar las mediciones,
ejemplificando su uso en los contadores hematolgicos automatizados disponibles comercialmente. Alguno de estos ejemplos han sido tomados de
los fabricantes que abarcan los principales segmentos del mercado de laboratorio clnico, dato obtenido a partir de la estadstica de los participantes en
programas de evaluacin externa de calidad (PEEC).
Los fabricantes por lo general ofrecen un amplio
rango de instrumentos, pero las descripciones sern
limitadas, por razones de espacio, a los modelos
ms difundidos (Tabla 1).
La mayora de estos instrumentos son totalmente
automatizados, es decir las mediciones se realizan a
partir de sangre entera sin necesidad de que el operador la diluya en forma manual. En efecto, con el fin
de garantizar un manejo seguro, la mayora de los
instrumentos cuenta con dispositivos que atraviesan
la tapa del tubo de colecta de sangre, de modo que
el operador no tiene que quitarla. Tambin es comn
que los instrumentos mezclen las muestras de sangre antes de que las mismas sean includas en el anlisis. Un esquema que resume las distintas etapas de
estos sistemas se presenta en la Fig. 13.

AUTOMATIZACIN EN HEMATOLOGA

TABLA 1
Algunas caractersticas de autoanalizadotes hematolgicos modernos*
Tipo

Fabricante

Instrumento

Recuento diferencial
de leucocitos de
2-3 regiones

Abbott
ABX
Bayer
BD Bio-sciences
Beckman-Coulter
Roche

De alto volumen

Abbott
ABX
Bayer
Beckman-Coulter

Sysmex

Ao de
aparicin en US

Instalados al
2000 en US

Cell-Dyn 1200
Cell-Dyn 1700 y 1700CS
Micros 60
ADVIA 60
QBS Star
Coulter Ac-T series
Coulter Ac-T diff y diff 2
Coulter Onyx/Onyx AL
KX21
K-4500

1999
1995
1998
1999
1999
1996
1999
1994
1999
1995

110
2800
81
50
Nd
500
800
1300
100
nd

Cell-Dyn 3200
Cell-Dyn 3700
Cell-Dyn 4000
Pentra 60c+
Pentra 120 Retic
ADVIA 120
Coulter GEN-S
Coulter HmX
Coulter STKS
Coulter MAXM
Sysmex SF3000-Alpha 3000
Sysmex SF3000-Alpha
Sysmex SE9500/SE
Sysmex SE9500 Alpha 2
Sysmex SE9500R/SE
Sysmex XE2180/XL

1997
1999
1997
2000
1999
1998
1996
1999
1989
1991
1996
1997
1994
nd
1997
2000

>700
>300
>350
0
18
500
>1100
>100
>2600
>2100
100
nd
350
nd
350
nd

* College of American Pathology (13, 15)

Fig. 1: Diagrama funcional simplificado de un sistema multiparamtrico de recuentos celulares.

Los contadores de sangre automatizados, como

cualquier otro instrumental de laboratorio, deben ser
manejados de manera apropiada. Esto requiere que
sean totalmente calibrados y que el desempeo sea
monitoreado tanto por el control de calidad interno
como por los PEEC. Por ltimo, debido a que el mercado evoluciona muy rpido, es necesario entender
cmo se evalan los nuevos instrumentos o, al me-

nos, entender crticamente las evaluaciones emprendidas por otros usuarios. Este aspecto no ser tratado en esta revisin, pero el lector puede remitirse MA
Fernndez Alberti y col4.
El desarrollo automatizado del recuento y la medicin del tamao de las clulas sanguneas parte de
tcnicas de recuento simple, que fueron descriptas en
la segunda mitad del siglo XIX y que fueron usadas

HEMATOLOGIA

Volumen 9 - N 1, 2005

TABLA 2
Recuento de clulas sanguneas en los primeros instrumentos
Caractersticas

Apertura-impedancia

Dispersin de luz

Descripcin del prototipo

Ingreso de las clulas a la zona
sensora
Definicin de la zona sensora

Coulter, 1956
Pasaje a travs de un orificio estrecho

Crosland-Taylor, 1953
Pasaje por una corriente estrecha por
flujo hidrodinmico
Haz de luz que atraviesa la corriente
de clulas
Cambios en la salida de un fotmetro,
contados electrnicamente

Impulsos usados para contar las

clulas que atraviesan la zona
sensora

Medicin de impedancia a travs del

orificio
Cambios en la impedancia contados
electrnicamente

durante mucho tiempo. Estas eran muy inexactas y,

hasta la dcada de 1950, se haban hecho pocos avances tecnolgicos5.
Se hicieron intentos iniciales y complejos para
automatizar el recuento de clulas en cmaras cuentaglbulos, pero an con tcnicas que fueron perfeccionadas, todava era difcil automatizar la dilucin
de la sangre y la carga de la cmara. Tambin resultaba imposible contar las clulas con exactitud mediante los mtodos de estudio de las propiedades
elctricas u pticas de las clulas en suspensin.
Para permitir que el recuento celular fuera automatizado, tuvieron que disearse mtodos de dilucin de la sangre e ingresar cantidades relativamente pequeas de clulas dentro y fuera de una zona
conocida como zona sensora. As, las clulas podan
ser contadas con exactitud a medida que pasaban a
travs de esa zona sensible, siempre y cuando la misma fuera lo suficientemente pequea como para hacer factible el recuento2, 6.
Los primeros contadores hematolgicos fueron
semiautomatizados; esto era as porque la preparacin de una dilucin adecuada era una operacin
manual y el instrumento entonces, aspiraba la dilucin ya preparada. Sin embargo, a fines de la dcada
del 60 se dispuso de instrumentos totalmente automatizados, que aspiraban muestras de sangre entera
y llevaban a cabo los pasos necesarios para diluir y
aislar las clulas a ser contadas. Nos ocuparemos en
el presente trabajo slo de los instrumentos totalmente automatizados. Los instrumentos semiautomatizados, si bien se fabrican todava, se utilizan casi
con exclusividad en laboratorios pequeos porque la
preparacin de diluciones manuales a partir de una
gran cantidad de muestras sanguneas, demanda
mucho tiempo adems de ser poco precisa.
Los primeros contadores fueron descriptos por
Coulter7 y Crosland-Taylor8, quienes adoptaron diferentes enfoques para limitar el volumen en la zona
sensora y realizar el recuento (Tabla 2).

Fig. 2: Contadores de apertura-impedancia. La impedancia se mide entre un electrodo negativo dentro del tubo con orificio y el electrodo positivo en la dilucin de las clulas de la sangre. El rea delimitada por
lnea de puntos muestra la zona sensora por donde pasan las clulas. :
resistividad del electrolito, m: resistividad del electrolito modificada por
la partcula.

En el instrumento descripto por Coulter7, las clulas son conducidas a travs de un estrecho orificio,
detectndose los cambios de impedancia (Fig. 2).
La impedancia es efectivamente medida en la
zona sensora situada entre los electrodos colocados
a ambos lados del orificio. As, las clulas funcionan
como aislantes frente a los diluyentes salinos, de
modo que la impedancia aumenta transitoriamente
a medida que las clulas pasan a travs de la zona
sensora. Los cambios de impedancia transitorios producen impulsos elctricos que pueden ser contados.
Estos instrumentos han sido llamados contadores de
apertura-impedancia.
El instrumento descripto por Crosland-Taylor8
se basaba en hacer que las clulas pasen a travs
de un delgado haz de luz. La zona sensora estaba
restringida parcialmente por la estrechez del haz
de luz y por el pasaje de clulas en una corriente
de lquido muy delgada. A medida que las clulas
pasan a travs de la zona sensora, interceptan el
haz de luz que se dispersa, pudiendo ser colecta-

AUTOMATIZACIN EN HEMATOLOGA

Fig. 3: Contadores por dispersin de luz. La luz de la fuente lser se dirige hacia un foco y luego se dispersa. Una barrera impide la llegada de
luz al fotodetector. Cuando una clula entra en el foco, dispersa la luz,
que as pasa por fuera de la barrera, e impacta en el detector.

da por un sistema ptico adecuado y medida por

un fotmetro (Fig. 3).
Los aumentos transitorios en la luz dispersada
crean impulsos desde el fotmetro, que luego pueden
ser contados electrnicamente, por ello estos sistemas
son llamados contadores de dispersin de luz.
Los impulsos contados en los primeros instrumentos de apertura-impedancia y de dispersin de luz
tambin se utilizaron para determinar el tamao celular, dado que el tamao del impulso es aproximadamente proporcional al tamao de la clula. Por lo
tanto, el tamao del impulso puede usarse para discriminar entre la clula de inters y otras clulas, restos o ruido electrnico. Este proceso lleva a la definicin de un umbral (Fig. 4).
Adems de las diferentes tecnologas de deteccin,
haba importantes diferencias en cmo las clulas ingresan a la zona sensible en los dos tipos de instrumentos. Debido a que la geometra tiene que ser perfecta, en los sistemas de dispersin de luz, las clulas tienen que estar en una corriente muy estrecha
que interacte perfectamente con el haz de luz. Esa
corriente se logra por una tcnica donde se emplea
un flujo laminar envolvente.
El flujo del lquido se ajusta a travs de un capilar delgado para crear un efecto de enfoque hidrodinmico que fuerza a la suspensin celular a permanecer en la corriente estrecha a medida que pasa por
el centro de la zona sensible.
Aunque este sistema fue descripto originalmente
para sistemas de dispersin de luz, tambin se puede aplicar a los sistemas de apertura-impedancia y
tiene particular valor al potenciar la capacidad de los
sistemas de apertura-impedancia para medir el tamao celular, as como para mejorar el recuento celular.

Fig. 4: Diagrama de volmenes en el recuento de plaquetas. Sirve para

discriminar plaquetas pequeas de ruido (A), plaquetas grandes de glbulos rojos pequeos (B). C representa el rea bajo la curva usada para
la estimacin terica del nmero de plaquetas.

Las mejoras en la capacidad de medir el tamao tambin significa que es ms fcil discriminar entre diferentes tipos de clulas, por ejemplo las plaquetas
grandes pueden ser discriminadas ms fcilmente de
los eritrocitos pequeos.
En la prctica, para hacer el recuento celular tanto los sistemas de apertura-impedancia como los de
dispersin de luz son adecuados para contar eritrocitos, plaquetas o leucocitos totales. Sin embargo, es
necesario tener en cuenta cules son los requerimientos bsicos para un recuento exacto de cualquier tipo
de clula5:
-

La sangre entera debe ser homogeneizada, medida y diluida con exactitud.

Debe pasarse un volumen conocido de esa dilucin a travs de la zona sensora.
Las clulas de inters deben contarse una vez y
slo una vez y ninguna otra clula, resto celular
o ruido electrnico debe contribuir al recuento.

El primer requisito es fcil de alcanzar, procurando que la sangre est bien mezclada antes del anlisis. En la actualidad, la mayora de los instrumentos
hacen esto en forma automtica y luego hacen las
diluciones con exactitud, generalmente por medio de
sistemas basados en jeringas calibradas.
El segundo requerimiento es ms difcil de lograr
en un instrumento automatizado. La mayora de los
fabricantes han elegido medir los recuentos por unidad de tiempo en lugar de la unidad de volumen de
dilucin. Por lo tanto, tales sistemas tienen que ser
calibrados para convertir los recuentos por unidad de
tiempo a recuentos por unidad de volumen.
El tercer requerimiento es de dificultad intermedia. Puede parecer excesivo afirmar que las clulas
deben ser contadas una vez, pero el problema es que

HEMATOLOGIA

Volumen 9 - N 1, 2005

flujo laminar, las clulas podran recircular dentro del

orificio.
Esas clulas recirculantes pueden hacer una contribucin mnima al recuento an cuando ellas tienden a producir impulsos ms pequeos que las clulas que pasan a travs del orificio. Sin embargo, los
eritrocitos que recirculan en esta forma causan seales en el rango de plaquetas y dificultan los recuentos de plaquetas, a menos que haya sistemas de flujo de barrido ubicados en la parte posterior del orificio que prevengan la recirculacin
Fig. 5. Relacin entre el recuento celular y la concentracin de clulas.
A concentraciones altas comienza a producirse un plateau como consecuencia del fenmeno de coincidencia.

MTODOLOGA EMPLEADA EN LAS

DETERMINACIONES DE UN ESTUDIO
SANGUNEO BSICO (HEMOGRAMA)
Concentracin de Hb

en el recuento pueden subestimarse si van a travs

de la zona sensora, casi al mismo tiempo, que otra
clula. Este problema, que se denomina coincidencia
(Fig. 5), surge del tiempo muerto en la electrnica
del instrumento y por lo general puede ser corregido con un algoritmo matemtico adecuado, construido dentro del microprocesador del contador
hematolgico.
Decir que las clulas deben contarse slo una vez
parece igualmente excesivo, pero el problema es que
en los contadores de apertura-impedancia simple sin

Es l mtodo ms uniforme en todos los instrumentos y presenta dos opciones de uso comn (Tabla 3).
La primera es convertir la hemoglobina en
cianmetahemoglobina (HiCN) y luego medir la
absorbancia alrededor de 540 nm. En la prctica, sin
embargo, el tiempo del ciclo de los instrumentos disponibles en el mercado es tan corto que puede impedir que la conversin total se produzca por completo y que los derivados intermedios sean medidos.
La conversin a HiCN requiere el uso de un reactivo

TABLA 3
Fundamento de varias determinaciones hematolgicas en autoanalizadores de uso frecuente.
Instrumentos
Analito

Abbott

Bayer

Beckman
Coulter

Sysmex

Hemoglobina:
- Mtodo automatizado

HiCN

HiCN con Hb
celular directa
Absorcin a 546 nm
Citometra de flujo

HiCN

LSS-meta-Hb

Absorcin a 525 nm
Impedancia

Absorcin a 555 nm
Corriente directa

Peroxidasa y
densidad nuclear
1-99,9

Tecnologa VCS de
Coulter 3-D
0-99,99

Corriente directa y
frecuencia de radio
0-99,9

Optico
impedancia

Umbral fijo de

Impedancia

Indices ptico y
refractario que
permiten la
discriminacin
0,005-3000

Exactitud de
umbrales fijos en
la deteccin por
parmetro nico
0-999

Umbrales no fijos
que permiten la
discriminacin

- Mtodo de deteccin
Leucocitos totales
Leucocitos: diferencial
Leucocitos: linealidad
(109/L)
Plaquetas

Absorcin a 546 nm
Dispersin ptica/
fluorescencia
Dispersin ptica/
fluoresencia
0-250

Recuento inmunoplaquetario de ptica/

impedancia
Plaquetas: discriminacin
Recuento inmunocon eventos no plaquetarios plaquetario de ptica/
impedancia

Plaquetas: linealidad (109/L) 0-2000

0-999

AUTOMATIZACIN EN HEMATOLOGA

tipo Drabkin, que contiene cianuro de potasio y

ferrocianuro de potasio, por lo tanto el efluente residual del instrumento puede no cumplir con los
estndares ambientales en algunos pases. Los mtodos alternativos -libres de cianuro- para la medicin
de la Hb, que usan laurilsulfato de sodio (LSS), han
sido introducidos en algunos instrumentos. Los resultados parecen compararse bien con los mtodos de
HiCN9. Estos mtodos no cianamidas, adems de ser
ms seguros, son tambin promisorios en cuanto a
futuras mejoras en la calibracin y validacin de nuevas mediciones de Hb. El mtodo de LSS introducido por Sysmex, parece ser de iguales caractersticas
a las del mtodo de referencia y es un avance significativo para bajar la turbidez y permitir un rpido
anlisis automatizado10.
Eritrocitos
Por lo general, el recuento de eritrocitos se realiza sobre diluciones de sangre entera con un umbral
adecuado para discriminar entre grandes plaquetas
y pequeos eritrocitos (Fig. 4). Muchos sistemas no
tienen un umbral superior para discriminar grandes
eritrocitos de pequeos leucocitos, pero los nmeros
relativos de los dos tipos de clulas indican que esto
no suele ser un problema.
Indices eritrocitarios
Aunque todos los contadores hematolgicos automatizados miden el volumen corpuscular medio
(VCM), hay otros factores importantes que afectan las
mediciones, segn sean hechas por los instrumentos
de apertura-impedancia o por los de dispersin de
luz. Debido a que ninguna tecnologa es perfecta,
varios fabricantes han intentado resolver los problemas, pero lo han hecho, con frecuencia, en diferente
forma.
La dificultad fundamental, que ya ha sido mencionada, es que el impulso producido por cualquier
clula es slo una aproximacin proporcional al volumen de la clula. Los impulsos aberrantes, que no
representan verdaderamente el tamao de la clula,
pueden ocurrir en cualquier contador, pero con frecuencia estos impulsos tienen una caracterstica inusual que les permite ser identificados por circuitos
electrnicos adecuados y procesados de modo que no
afecten la magnitud del impulso promedio que se
utiliza como medicin de VCM. En los contadores de
apertura-impedancia sin flujo laminar, hay una necesidad adicional de tratar los impulsos, ya que en tales instrumentos las clulas que pasan cerca del borde del orificio deben ser ignoradas porque producen
impulsos ms grandes que las clulas que pasan en

el centro del orificio. Afortunadamente, esas clulas

tienen un tiempo de pasaje ms largo a travs del
orificio, debido a que el flujo es ms lento en el borde. Los impulsos que ellas producen son por lo tanto tan largos que deben y pueden ser procesados. Dos
clulas que atraviesan juntas tambin producen un
pulso sobredimensionado, pero de igual modo es tan
largo, que puede ser procesado.
En relacin a los eritrocitos, el aspecto ms serio,
de correccin ms dificultosa, es que el VCM tiende
a ser subestimado cuando la concentracin de Hb
corpuscular media (CHCM) real, medida manualmente, es reducida. Los fabricantes han adoptado
diferentes tcnicas para obviar el problema. Estas han
servido para reducir la magnitud del efecto aunque
en ninguna instancia ha sido eliminado totalmente.
Debido a que los ndices eritrocitarios se relacionan
entre s de acuerdo con lo siguiente:
CHCM =

HCM
VCM

Puede observarse que un VCM subestimado causar una CHCM sobrestimada. Por esto, con los modernos contadores sanguneos, rara vez se observa que
la CHCM descienda marcadamente en la deficiencia
de hierro severa, como sucede cuando las mediciones
de Hb y hematocrito son hechas en forma manual y
la CHCM se calcula usando la frmula:
CHCM =

Hemoglobina
Hematocrito centrifugado

Con los sistemas de apertura-impedancia hay una

explicacin simple para la subestimacin del VCM,
cuando la CHCM es baja y est relacionado con el
hecho de que la CHCM determina la viscosidad interna del eritrocito y, como consecuencia, a su forma,
cuando pasa a travs del orificio del contador. Las
fuerzas de corte del fluido en el orificio son tales que
el eritrocito adopta una forma de cigarro, pero cuando la viscosidad interna se reduce, la forma del eritrocito se vuelve similar a un cigarro ms largo y
delgado y crea un impulso ms pequeo de lo que
debiera (subestimacin del volumen). Esto es conocido como el efecto del factor forma5.
A excepcin de los equipos de Bayer, todos los
dems calculan los ndices en funcin de la medicin
del tamao celular de las clulas por apertura-impedancia luego de diluirlas en un medio isotnico. Con
el fin de minimizar estos efectos, hay sistemas de dispersin de luz en los que se trata el eritrocito para
que tome la forma esfrica y las clulas son fijadas
antes de su entrada a la zona sensora. Tal es el caso

10
de los equipos de Bayer que llevan a la esfericidad
las clulas con un volumen constante y luego miden
el volumen celular a partir de la lectura mediante un
sistema de dispersin de luz, donde la misma incide
con dos ngulos diferentes. Despus, proceden a
transformar esas seales mediante un algoritmo especial basado en la dispersin ptica de partculas
esfricas dielctricas10.
En estos casos suele aplicarse la teora de Mie que
relaciona la dispersin de luz con el volumen y el
ndice de refraccin interno11. El uso prctico de la
teora de Mie proviene de observar la dispersin de
luz en cada clula individual, con un ngulo pequeo (2-3) y uno grande (5-15). La dispersin con un
ngulo pequeo est afectada primariamente por el
volumen y la dispersin con un ngulo grande, por
el ndice de refraccin interno, aunque cada uno est
afectado por ambos. Sin embargo, si ambos ngulos
de dispersin son ploteados uno contra el otro, la
posicin de cualquier impulso puede ser derivada
para medir el volumen y la concentracin de Hb de
la clula. Promediando las mediciones sobre muchas
clulas, se pueden derivar los valores medios que
equivalen al VCM y la CHCM5.
Como mencionamos antes, los cambios de forma
de los eritrocios deformados anormalmente en los
analizadores por apertura-impedancia, afectan la estimacin del VCM, la CHCM y el hematocrito. La
introduccin de la focalizacin hidrodinmica en los
equipos de apertura-impedancia, tales como el
Sysmex SE9500, parece reducir el efecto del cambio
de forma y de deformabilidad. En ese sentido, los
equipos de Beckman Coulter, particularmente para
CHCM, parecen estar afectados por no poseer esa
adaptacin10.
Reticulocitos
Los recuentos de reticulocitos teidos con varios
colorantes pueden realizarse en un instrumento automatizado, diseado para ese propsito, tal como el
Sysmex R3000, o en un citmetro de flujo convencional. Recientemente otros contadores hematolgicos
han incorporado una opcin de recuento de reticulocitos, en los que stos deben ser coloreados de
modo independiente y luego son introducidos dentro del contador para su anlisis.
En el caso de mediciones hechas con colorantes
fluorescentes, de acuerdo con la intensidad de fluorescencia, los reticulocitos se pueden dividir en tres
sectores que representan estadios diferentes de maduracin. El estadio ms joven, muy fluorescente, es
un indicador temprano de recuperacin, que aparece antes de un recuento de reticulocitos total elevado. Un alto recuento de elementos muy fluorescentes

HEMATOLOGIA

Volumen 9 - N 1, 2005

es un indicador de recuperacin medular despus de,

por ejemplo, un transplante de mdula sea (TMO)
o de la administracin de eritropoyetina exgena.
Actualmente, se pueden hacer los recuentos sin
necesidad de coloracin manual, ya que estn totalmente automatizados. Sysmex fue el primero en introducir un colorante fluorescente (Automune-O)
detectado por citometra de flujo, en tanto que otros
como Beckman Coulter usan el nuevo azul de
metileno. Este ltimo mtodo es menos preciso porque es ms dificultoso estandarizar la coloracin y
porque los cuerpos de Howell-Jolly pueden interferir. Bayer usa la oxazina-750 en el canal de luz lser
de helio-nen y esta determinacin se integra con las
determinaciones del ancho de la distribucin del volumen eritrocitario (RDW) y el contenido de Hb, con
lo cual se obtienen los ndices celulares reticulocitarios. Estos parmetros de inmadurez reticulocitaria, que actualmente tienen un uso limitado, pueden ser usados para estimar la reduccin de la vida
media eritrocitaria y mejorar el tratamiento de una
variedad de anemias, en la recuperacin posquimioterapia y en el TMO.
Plaquetas
Estas clulas pueden contarse sobre la misma dilucin de sangre entera usada para el recuento de
eritrocitos. Hay, por lo general, un umbral superior
para eliminar pequeos eritrocitos y un umbral inferior para discriminar del ruido electrnico y los restos celulares (Fig. 4).
Estos umbrales simples son adecuados, siempre
y cuando el instrumento tenga flujo laminar, y vale
tanto si se usa apertura-impedancia como dispersin
de luz para su deteccin. Sin embargo, si no se usa
flujo laminar opcional para los contadores de apertura-impedancia y obligatorio para contadores de dispersin de luz hay demasiado solapamiento entre
las seales de ruido o los residuos y la de los
eritrocitos pequeos para que el recuento sea efectivo, entre los umbrales inferior y superior.
Bajo estas circunstancias es necesario ajustar una
curva de distribucin terica al histograma de volumen de plaquetas y extrapolar el recuento de
plaquetas a partir del rea bajo la distribucin terica5 (Fig. 4, C).
Recientemente, se han ampliado los diferentes tipos de mtodos empleados por los distintos fabricantes. Estos nuevos sistemas han sido importantes porque se sabe que el recuento de plaquetas con un solo
parmetro tal como la impedancia, tiene una tendencia a sobreestimar el recuento verdadero de plaquetas,
que es importante en las trombocitopatas y en el
manejo de pacientes trombocitopnicos.

AUTOMATIZACIN EN HEMATOLOGA

Por otra parte, esto es importante en el caso de

tener que hacer recuentos elevados de plaquetas, en
pacientes con trombocitosis y en el control de calidad.
Una limitacin actual es la imposibildad de distinguir
plaquetas de fragmentos celulares y restos celulares.
Es importante tambin la capacidad de reconocer
plaquetas de mayor tamao, que suelen estar excluidas de los algoritmos de recuentos de plaquetas. Los
fabricantes trataron de resolver esto de diferentes formas (Tabla 3).
Algunos fabricantes resuelven esto con mtodos
pticos y por impedancia y si no hay concordancia
tiene la alternativa de usar un mtodo inmunolgico
automatizado con un anticuerpo monoclonal contra
la glicoproptena gpIIIa, que es una gp presente slo
en plaquetas (Abbott). Otros usan un mtodo de impedancia sin umbral fijo y los resultados correlacionan bien con el mtodo de referencia, pero con
menor frecuencia de alarmas con relacin a otros contadores que tienen umbrales fijos (Sysmex).
Tambin se desarroll un sistema de medida
bidimensional en el cual se mide tanto el volumen
como el ndice de refraccin de cada una de las clulas (Bayer). Esto tiene una gran capacidad de discriminacin entre plaquetas, eritrocitos y partculas contaminantes. Esta tecnologa altamente novedosa es,
a la vez, muy confiable. Adems brinda otros parmetros como el VPM, el ancho de la distribucin del
volumen plaquetario (PDW), el plaquetocrito y el
componente plaquetario medio (CPM), mediciones
stas cuyo valor clnico an est en discusin10.
Recuento total y diferencial de glbulos blancos
El examen mediante microscopa ptica de un
frotis teido de sangre perifrica para evaluar la morfologa de eritrocitos y trombocitos (plaquetas) y la
generacin del recuento diferencial de leucocitos an
hoy resultan cruciales para el diagnstico de enfermedades hematolgicas1. Estos procedimientos, adems de la determinacin de recuentos celulares en la
sangre, tradicionalmente han sido las funciones principales de un laboratorio de Hematologa. Sin embargo, el recuento diferencial visual se reconoce como
una de las tareas de labor ms intensa en el laboratorio. Para lograr buena ejecucin se requiere un personal bien preparado y muy motivado. A pesar de su
honroso papel en el diagnstico de enfermedades
hematolgicas, estas mediciones estn plagadas de
errores. La confiabilidad del procedimiento debe supervisarse regularmente por encargados especializados e intercambiando extendidos con otros laboratorios. Siempre que sea posible se recomienda que los
principiantes muestren a los supervisores todas las
anomalas importantes, tales como leucocitosis pri-

11
maria o reactivas, trombocitopenia o cambios notorios en los eritrocitos. Una forma de estimular el inters y aumentar el conocimiento de los responsables
en la evaluacin correcta de preparaciones sanguneas y frotis de mdula sea es la discusin peridica de extendidos de inters especial. Un anlisis cuidadoso de frotis sanguneo es una herramienta muy
til para la evaluacin clnica. Por otro lado, la triada
de factores formada por la importancia, el gasto y el
error aleatorio llev a los directores de laboratorios
y a los ingenieros industriales a la conclusin de que
la automatizacin del recuento diferencial proporcionara informacin ms exacta, adems de reducir los
costos y los errores.
En relacin al almacenamiento de muestras de
sangre para hacer los frotis preparados con sangre
anticoagulada por EDTA, conservados durante no
ms de 60 minutos a temperatura ambiente, muestran pocos cambios comparados con los que se preparan inmediatamente despus de obtener la sangre.
Se pueden discernir cambios tres horas despus, y entre 6 y 8 horas posteriores a la extraccin, los cambios son notorios. Los leucocitos se vacuolan y muchos muestran cambios nucleares degenerativos,
mientras que las concentraciones de leucocitos y de
plaquetas disminuyen. Todo esto ocurre a mayor velocidad si la temperatura ambiente es ms alta y se
retrasa si la sangre se mantiene a 4C1.
Para el recuento diferencial visual de leucocitos,
las clulas individuales se clasifican adecuadamente
cuando se estudian en las etapas ms maduras. Sin
embargo, es difcil medirlas adecuadamente en frotis
sanguneos debido a la gran variacin en las fracciones numricas de poblaciones celulares. Los recuentos diferenciales visuales se realizan de modo rutinario en 100-200 clulas nucleadas. El coeficiente de
variacin al contar los leucocitos ms frecuentes (es
decir, linfocitos y neutrfilos) puede ser mayor al
25%, pero el de las clulas que ocurren en fracciones
numricas menores al 10% (es decir, eosinfilos y
monocitos) puede ser de hasta del 100%. La obtencin de resultados exactos de clulas que se presentan en fracciones numricas menores al 1% (es decir,
eritrocitos nucleados o basfilos) es prcticamente
imposible ya que el total de clulas evaluadas es de
100-200 (Tabla 4).
A pesar de estas limitaciones, el recuento diferencial visual constituye el estndar para comparar resultados obtenidos con analizadores hematolgicos
automatizados. El papel del examen visual de frotis
sanguneos sigue siendo importante en el laboratorio clnico, ya que los analizadores hematolgicos automticos pueden rechazar un alto porcentaje de
muestras consideradas como anormales que deben
evaluarse visualmente1.

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HEMATOLOGIA

Volumen 9 - N 1, 2005

TABLA 4
Error de muestreo y variabilidad estadstica de recuentos
porcentuales en los recuentos diferenciales proporcionales*
N total de
clulas contadas
100
200
1000
10000

Porcentaje observado de clulas

50
5
10
30
1-9*
2-8
3.6-6.4
4.6- 5.4

4-16
6-14
9-11
9.4-10.6

21-39
24-36
27-33
29-31

40-60
43-57
47-53
49-51

* Rango 95%

Los glbulos blancos totales no pueden contarse

en diluciones simples de sangre entera porque el nmero proporcionalmente elevado de eritrocitos los
enmascararan. Deben agregarse, por lo tanto, reactivos adecuados para lisar los eritrocitos de modo que
los leucocitos remanentes puedan ser discriminados
de cualquier resto de eritrocitos. En los sistemas de
dispersin de luz tambin puede ser necesario aadir compuestos para filtrar el resto, causante de interferencia ptica. Con los primeros sistemas, se usaban agentes lticos muy fuertes, que removan la
mayora del citoplasma del leucocito, de modo que
en realidad lo que se evaluaba eran los ncleos. Ms
recientemente, sin embargo, se utiliza una lisis ms
suave para proteger tanto como sea posible la arquitectura celular, de modo que pueda ser usada como
base para el recuento diferencial de leucocitos5.
En el caso del recuento diferencial, los primeros sistemas se basaban en diferencias en el volumen de leucocitos medido por apertura-impedancia 12. Sin embargo, tales sistemas no son los ms
adecuados para discriminar entre clulas mono y
polinucleares, particularmente entre linfocitos y
granulocitos. Los intentos para clasificar otros tipos celulares en tres poblaciones diferenciales son
menos satisfactorios.
La dispersin de luz sola no es de valor para el
recuento diferencial de leucocitos. Resulta interesante que el ndice de refraccin interna de los leucocitos,
que est determinado por sus grnulos, sea tan importante como el volumen, cuando se determina por
dispersin de luz, el volumen aparente de leucocitos.
De este modo, debido a sus grnulos, los neutrfilos
aparecen ms grandes que los eosinfilos aunque
realmente tienen el mismo volumen cuando son medidos por apertura-impedancia13.
A pesar de la limitada utilidad de la dispersin de
luz sola para el recuento diferencial de leucocitos,
puede usarse en conjunto con la absorcin de luz,
cuando se estudian los leucocitos teidos en suspen-

Fig. 6: Recuento diferencial leucocitario, usando dispersin de luz (vertical) y tincin de peroxidasa (horizontal). Los basfilos se estiman independientemente porque se superponen con los monocitos.

sin. Los primeros trabajos fueron hechos con

leucocitos teidos por su actividad de peroxidasa y
cuando la dispersin y la absorcin de luz se midieron simultneamente clula por clula se hizo posible discriminar con exactitud cuatro clases de leucocitos, es decir neutrfilos, linfocitos, monocitos y
eosinfilos junto con una categora conocida como
clulas grandes no coloreadas (Fig. 6).
Esta propuesta se describi como medicin
multiparamtrica simultnea, es decir los dos parmetros de dispersin y absorcin resueltos en un nico canal. El trmino canal en este contexto, se refera
al sistema para dilucin de sangre, lisante de
eritrocitos, donde se haca la reaccin de peroxidasa
y luego se meda la dispersin y la absorcin de luz.
El empleo de un canal de peroxidasa hizo una contribucin mayor al recuento diferencial leucocitario, pero
no result adecuado para el recuento diferencial de
basfilos. Por lo tanto, los fabricantes tuvieron que
agregar un canal adicional para contar estas clulas.
Tales instrumentos multicanales de recuento diferencial de leucocitos han sido desarrollados y tienen actualmente un uso difundido. Otro aspecto es que se
incluyen parmetros como los blastos, eritrocitos
nucleados y granulocitos inmaduros aunque todava
existen algunas discrepancias en la identificacin de
los polimorfonucleares (PMN) en bandas.
En paralelo con el desarrollo de los instrumentos multicanales, tambin ha habido una tendencia
a realizar ms y ms mediciones simultneas, usando con frecuencia un nico canal. Por ejemplo, los
sistemas de apertura-impedancia pueden ser mejorados para proporcionar informacin sobre la com-

AUTOMATIZACIN EN HEMATOLOGA

posicin interna de los leucocitos, mediante el uso de

una sonda electromagntica de alta frecuencia al mismo tiempo que se meda el volumen. Los sistemas de
dispersin de luz tambin pueden ser enriquecidos
examinando la dispersin en diferentes ngulos. Finalmente, ahora es posible combinar tanto la tecnologa
de apertura-impedancia como la dispersin de luz, con
sus varios refinamientos, dentro de un canal nico5.
A modo de resumen, en la Tabla 3 se indican las
distintas caractersticas del recuento total de blancos
y distintos aspectos del diferencial leucocitario, que
tradicionalmente fue hecho en forma manual por revisin microscpica de extendidos.
Las ventajas del mtodo automatizado son:
-

Disminucin del error aleatorio por el gran nmero de clulas contadas.

Disminucin del tiempo de retorno por la velocidad con que el instrumento hace la cuantificacin.

Para el recuento diferencial de leucocitos automtico, el anlisis de imgenes tiene una aplicacin muy
limitada y de comercializacin reducida. En principio,
el anlisis de imagen automatiza y reproduce el recuento diferencial visual. Los frotis sanguneos se analizan con ptica de alta velocidad en una plataforma
controlada por computadora. Se simulan los criterios
del diferencial visual con algoritmos, enumerando las
subpoblaciones celulares en forma ms reproducible
y cuantitativa. Varios contadores de leucocitos por anlisis de imagen fueron producidos durante los aos 70
y al principio de los 80 (Lara de Corning Medical
Instruments, Hematrak de Geometric Data, Dic 4 de
Coulter Electronics, ADC-500 de Abbott Diagnostics).
Fueron desplazados del mercado por contadores ms
rpidos y completos1.
En los sistemas comerciales disponibles actualmente, se hacen recuentos de clulas sanguneas automticos incluyendo al menos un recuento diferencial de
blancos de cinco subclases. Estos analizadores usan
tecnologa sofisticada y constituyen un equipamiento
de ltima generacin que se integra a los laboratorios
de rutina. Las muestras sanguneas son procesadas en
sistemas de muestreo cerrados, usan sistemas automticos de lectura para la identificacin por cdigo de
barras y tienen interfases con el sistema de informacin del laboratorio para introducir las pruebas requeridas, los datos identificatorios del paciente y la obtencin de resultados. Procesan grandes cantidades de
muestras (ms de 100 por hora), se pueden seleccionar variantes que cubren un rango amplio de opciones informatizadas como es el establecimiento de alarmas, acumulacin de datos de control interno y produccin de resultados grficos de materiales de control interno y de muestras de pacientes.

13
En relacin con los aspectos tecnolgicos, es importante conocer qu informacin brindan los diferentes sistemas y qu tecnologa usan de acuerdo
con los distintos mtodos descriptos por los fabricantes. La capacidad y confiabilidad de los instrumentos para recuentos diferenciales evoluciona continuamente.
Actualmente, luego de que se ha usado el recuento diferencial por ms de 25 aos, la confiabilidad y
la exactitud del instrumental automatizado ha alcanzado niveles muy altos. Por ello, donde se dispone
de los mismos no es conveniente reemplazarlos por
el recuento manual basado en la revisin de solo 100
clulas. Cada laboratorio debe establecer criterios
para revisar los extendidos, basado en las alarmas del
instrumento, pero por lo general la revisin est ms
relacionada con la observacin de la morfologa de
eritrocitos o de plaquetas que a un problema en el
recuento diferencial leucocitario.
Pero a pesar de estos avances, an hay necesidad de examinar el extendido sanguneo para determinar la naturaleza de un recuento anormal de poblaciones leucocitarias y de la morfologa de
plaquetas y de eritrocitos. En 1994 se recomend,
luego de un estudio definitivo, no informar discriminadamente los neutrfilos en banda de los
neutrfilos totales y que era aconsejable usar el nmero absoluto de neutrfilos para detectar una infeccin. Hay dos indicaciones para la revisin de un
extendido en caso de recuentos leucocitarios normales, como el caso de un neonato con fiebre y pacientes con sospecha de fiebre tifoidea. La deteccin de
un recuento alto de neutrfilos en banda, asociado
a un recuento de neutrfilos normal, tiene un valor
clnico significativo14.
Una adicin interesante a la artillera diagnstica
de los nuevos contadores es la inclusin del dispositivo para hacer extendidos como el includo en el
Coulter GEN-S. El instrumento puede ser programado para producir extendidos centinela automticamente
cuando aparece cualquier alarma para eritrocitos,
plaquetas y glbulos blancos con datos identificatorios
includos15. Otro dato interesante es la graficacin de
eritrocitos no lisados como en los Sysmex NE 8000 que
permite detectar clulas resistentes a la lisis como es
el caso de las clulas en diana15.
Otra consecuencia del mejoramiento continuo del
instrumental es que se ha podido ampliar el uso de
las alarmas. Por ejemplo si no hay clulas inmaduras
o blastos, no hay necesidad de revisar el extendido
para buscar anormalidades en los neutrfilos a menos que el porcentaje de neutrfilos exceda el 90%.
As, a comienzos de los aos 90 en un centro
asistencial de agudos se hacan 100 revisiones manuales y esta cifra baj a 13%14-16.

14
Clulas madres o troncales
La concentracin de las clulas madres o troncales
(stem cells) es alta en mdula sea, en tanto que en
sangre perifrica es baja y pueden ser recolectadas
despus de tratar al paciente con quimioterapia seguida de factores de crecimiento, para aumentar su
concentracin.
Cuando se las recolecta por afresis es necesario
cuantificar la cantidad en sangre perifrica. Esto se
hace por inmunofluorescencia usando anticuerpo
monoclonal anti-CD34 FITC. Esta prueba requiere
tiempo y a veces no est disponible. Como estas clulas (stem cells) contienen pocos lpidos y son resistentes a la lisis por detergentes, pueden ser medidas
usando impedancia y radiofrecuencia tal como ha
sido desarrollado recientemente10. Esta prueba requiere poco tiempo comparado con las 2-3 h de la
citometra de flujo.
Ancho de la distribucin del volumen y de la
concentracin de hemoglobina eritrocitaria
Adems de estimar VCM es posible producir
histogramas que muestren el ancho de la distribucin
del volumen de eritrocitos (RDW). Tales histogramas
son tiles para medir la anisocitosis y para caracterizar situaciones en las que dos poblaciones eritrocitarias estn presentes, por ejemplo en la deficiencia de hierro que responde al tratamiento.
Si se utiliza una dispersin de luz de ngulo
dual es posible medir la concentracin de hemoglobina individual de un eritrocito y construir
histogramas que muestren el ancho de la distribucin de la concentracin celular de hemoglobina
(HDW).
Ancho de distribucin del volumen plaquetario
(PDW)
Este parmetro puede ser usado para determinar
el recuento de plaquetas as como para medir el volumen medio de la plaqueta y la anisocitosis plaquetaria. As, los contadores hematolgicos automatizados ofrecen un rango de los llamados nuevos
parmetros, tales como anisocitosis eritrocitaria y
plaquetaria, volumen medio de plaquetas y otros
ms que reflejan otras caractersticas de los
eritrocitos, plaquetas y leucocitos. Desafortunadamente, la mayora de estos parmetros tienden a ser
especficos de un instrumento y la comparacin de
los parmetros del mismo nombre puede resultar
pobre entre diferentes instrumentos, an del mismo
fabricante. Es probable que por esta razn hayan
encontrado poca aplicacin en la hematologa
diagnstica.

HEMATOLOGIA

Volumen 9 - N 1, 2005

Se han publicado muchos estudios interesantes

que muestran diferencias entre diversos trastornos,
por ejemplo la anisocitosis plaquetaria en la trombocitosis secundaria y la trombocitemia. Sin embargo, estas diferencias con frecuencia no son suficientes o no estn suficientemente establecidas para convertirse en criterios firmes de diagnstico, aunque
pueden arrojar alguna luz interesante sobre la fisiopatologa subyacente.
Sin embargo, los nuevos parmetros disponibles
tienen un rol importante dentro del laboratorio, an
si no son informados, debido a que constituyen una
gua til sobre cmo y cuando debe examinarse un
extendido de sangre.
Alarmas e indicaciones para examinar un extendido
de sangre
Todos los instrumentos producen alarmas diseadas para alertar al operador sobre circunstancias
en las cuales las mediciones pueden no ser
confiables o en las que puede haber clulas anormales como los blastos o eritrocitos nucleados en sangre perifrica.
Las alarmas deben ser consideradas, en conjunto
con los nuevos parmetros, con todos los diagramas
producidos por el instrumento, con los ltimos resultados del recuento sanguneo, con cualquier cambio
de los resultados previos y los detalles clnicos, al
considerar si un extendido de sangre debe ser examinado o no17.
En trminos generales, se espera que los contadores automatizados modernos de clulas sanguneas
brinden los siguientes servicios:
-

Identificar la muestra por cdigo de barras

Homogeneizar la muestra
Perforar la tapa del tubo de colecta de sangre y
aspirar la muestra
Distribuir la muestra en canales para mediciones
separadas, es decir canales de:
- Recuento y medicin del tamao de eritrocitos
y plaquetas
- Recuento total y diferencial de leucocitos (puede haber uno o ms canales, dependiendo del
instrumento)
- Recuento de reticulocitos
- Hemoglobinometra
Dentro de cada canal, deben hacerse las diluciones relevantes, agregar reactivos y esperar hasta
que la dilucin est lista para la medicin.
Hacer las mediciones de cada uno de los canales
especificados arriba.
Alertar sobre cualquier anomala y facilitar la visualizacin en forma adecuada por el operador

15

AUTOMATIZACIN EN HEMATOLOGA

Verificar el control de calidad usando controles

adecuados o valores medios del paciente
Trasmitir los datos en lnea al sistema de computacin del laboratorio
Ser compatible con sistemas robotizados para la
automatizacin total del laboratorio.

Todos los instrumentos de ltima generacin tienen buena conformidad con los requerimientos generales listados arriba y tienen relativamente pocas caractersticas distintivas.
Al seleccionar un contador uno puede requerir
desde un equipo que haga un bajo nmero de muestras por hora a un instrumento que resuelva un gran
nmero en el mismo lapso. Los comentarios siguientes tienen que ver con los equipos que procesan un
gran nmero de especmenes. Si se va a trabajar con
una poblacin anormal de pacientes, el nmero de
alarmas para el recuento manual es crtico si se quiere reducir la intensa labor de revisin manual de extendidos de sangre perifrica. Hay equipos que tradicionalmente tienen muchas alarmas tanto para datos normales como anormales, en particular para recuentos plaquetarios y para leucocitos inmaduros.
Para ello se introdujeron nuevas tecnologas y la posibilidad de contar con los cut off puestos por el usuario. Dependiendo de los equipos, la revisin de los
extendidos es cada vez menos requerida.
Tambin para reducir el trabajo, hay equipamientos que hacen marcado de extendidos
automticamente. Por otra parte, los hay para el
escaneo automtico de extendidos, anlisis de imgenes y proyeccin en monitor a color y de alta resolucin que hacen que la microscopa sea una actividad cada vez ms lejana, en los laboratorios que poseen esa tecnologa.
Se le han agregado otras funciones a los contadores automticos como el estudio de antgenos de diferenciacin en la superficie celular o marcadores
linfocitarios o el anlisis diferencial de clulas de
mdula sea. Es de remarcar que estos estudios conviene hacerlos con un citmetro de flujo destinado a
tal fin, con personal especializado. De todas formas
si se dispone de ese instrumental, esos estudios tienen un valor importante para el mdico. Hay argumentos a favor de que agregar mucha informacin
confunde al clnico y debe ser as ya que hay
parmetros como el VCM y RDW que an hoy resultan poco familiares.
A partir de los aos 90, particularmente en Japn,
se generaron sistemas de laboratorio de tercera generacin que estaban basados en dos conceptos claves
como la consolidacin y la integracin que permitieron
combinar distintas teconologas o estrategias analticas e integrar instrumental con dispositivos pre y

postanalticos, de modo de reducir complicaciones

como algunas relacionadas a la bioseguridad. Inicialmente, la mayor parte (2/3) de los sistemas de laboratorio de tercera generacin fue instalada en el laboratorio hematolgico, con lo cual se vislumbra que
a futuro los mayores avances sern en esa direccin18.

ABSTRACT
Most of the practices in the laboratory of
hematology are related with observations that include
the identification of cells and the interpretation of the
composition of blood cell populations. In this work,
the methodology used in automated instruments for
the conventional blood examination is reviewed,
including the measurement of hemoglobin, erythrocyte
count and erithrocyte indexes, platelets count, total
and differential leukocyte count, and reticulocytes.
Different technologies used for those measurements
are described, with examples of automated
hematology analyzers used, available in the market.
Key words: Automation, Hematology, Analytical
systems, Technology

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