LABORATORIO II

CÓDIGO 2146

Carrera: Técnico de Laboratorio.

Dpto. de Biología Molecular.
Fac. de Ciencias Exactas Físico Químicas y Naturales.
Universidad Nacional de Río Cuarto.

TEMA 11: SEROLOGÍA PARTE 2.

BRUCELOSIS Laboratorio II

Dr. Pablo Cesar Bogino

SEROLOGÍA

Temario

Brucelosis
Agentes etiológicos
Vías de transmisión
Patogenia y manifestaciones clínicas
Métodos diagnósticos
Serología para brucelosis
BRUCELOSIS
BRUCELOSIS

Enfermedad antropozoonótica producida por bacterias del género Brucella

Representa un problema sanitario y económico mundial
Hay gran diversidad de animales portadores de la bacteria
El hombre es un huésped secundario, infectado a partir de una fuente animal
La brucelosis humana es considerada una infección de riesgo ocupacional
Sinónimos: Fiebre Malta o Mediterránea, Fiebre Ondulante, Melitococcia
La brucelosis animal también se denomina aborto infeccioso, aborto contagioso,
aborto epizoótico y enfermedad de Bang
BRUCELOSIS Género Brucella
Bacilos o cocobacilos gram negativos
Inmóviles
Aerobios estrictos
De crecimiento lento
No poseen cápsulas ni forman esporas
Principal determinante de virulencia es el lipopolisacárido (LPS) de membrana externa
Incluye seis especies diferentes, cuatro de las cuales pueden contagiar al hombre

Clasificación del género Brucella

Especie de Virulencia para
Huésped Natural
Brucella el Hombre
B. abortus Ganado vacuno Moderada
B. melitensis Cabras y ovejas Alta
B. suis Cerdos Alta
B. canis Perros Baja
B. ovis Ovejas Ninguna
B. neonates Roedores Ninguna
BRUCELOSIS Mecanismos de contagio

Vía Digestiva Vía Respiratoria

Infección de animales con Brucella

Infertilidad
Afinidad por tejidos de órganos reproductivos
Abortos

Mayor susceptibilidad de mamíferos sexualmente maduros

Excreción de bacterias en Contaminación y supervivencia

Leche ambiental relativamente alta
Productos de abortos Suelo
Secreciones genitales Corrales
Agua de arroyos, etc

Fuente de infección para humanos

BRUCELOSIS Vías de contagio en el hombre

1. Vía Conjuntival Contacto directo con

o Cutánea materiales contaminados

Contagio Laboral
Inhalación de aerosoles formados en o Profesional
operaciones de limpieza de establos,
2. Vía Respiratoria movimiento de ganado, actividades que
puedan remover polvo contaminado, etc

Ingestión de lácteos no pasteurizados Contagio No

3. Vía Digestiva
o alimentos crudos contaminados Profesional

Cadena Epidemiológica
de la Brucelosis
 BRUCELOSIS Riesgo Ocupacional/Profesional

Riesgo ocupacional de contraer Brucelosis

Ocupación Principal Especie de Brucella
Ganadero B. abortus, B. melitensis
Industria Lechera B. abortus
Veterinario B. abortus, B. suis, B. melitensis
Trabajador de
B. suis, B. abortus
frigorífico/matadero
Cazadores B. canis
Trabajadores de Laboratorio Todas las especies
BRUCELOSIS Huéspedes, especies, transmisión y manifestaciones

Es una enfermedad que se autolimita o se vuelve crónica

La evolución de la enfermedad dependerá de la respuesta inmune celular del huésped
El periodo de incubación varía entre 10-20 días
La sintomatología puede aparecer varios meses después
BRUCELOSIS Patogenia Mecanismos de supervivencia intracelular:
Síntesis de metabolitos bacterianos que INHIBEN
Fusión fagosoma-lisosoma
Desgranulación
Ingreso al organismo
Actividad de la mieloperoxidasa

Fagocitosis por PMN Respuesta Tisular:

y Macrófagos Estimulación
antigénica crónica
Si evaden la Infiltrado de células
eliminación mononucleares y
epiteloides
Nódulos
Diseminación sanguínea granulomatosos
a diferentes órganos Abscesos

Osteoarticular
Genitourinaria
Son patógenos intracelulares facultativos Protección contra antibióticos Hepática
con capacidad de adherirse, penetrar y y mecanismos inmunitarios Neurológica
multiplicarse tanto en células fagocíticas dependientes de anticuerpos Otras
como no fagocíticas

Evolución a la Formas
enfermedad crónica Localizadas
 Clínica polimorfa con gran variedad de formas de presentación: asintomática,
BRUCELOSIS síndrome infeccioso inespecífico o cuadros focales con o sin sintomatología

MANIFESTACIONES CLÍNICAS
Duración de
Síntomas y Signos
Etapas síntomas antes Serología Comentarios
Principales
del diagnóstico
IgG > IgM
SUBCLÍNICA No reconocidos Bajo título
de SAT
FIEBRE, SUDORACIÓN,
ARTRALGIAS. IgM > IgG > IgA Frecuentemente
AGUDA 2-3 meses
Malestar, fatiga, debilidad, Alto título bacteriemia con
cefaleas, pérdida de peso, de SAT presentación
SUBAGUDA 3 meses a 1
hepato-esplenomegalia, (> 1/500) aguda
año
linfadenopatía
Entre 3-10 meses
Igual a etapa aguda pero
IgM, IgG después de la
RECAÍDA 2-3 meses con fiebre más alta, mayor
SAT positivo enfermedad
fatiga y debilidad
aguda
Relativamente asintomática, IgG, IgA > IgM
Complicaciones
CRÓNICA Más de 1 año fiebre y manifestaciones SAT baja o
localizadas
neuropsiquiátricas ausente

SAT: Seroaglutinación en Tubo

BRUCELOSIS Diagnóstico

El diagnóstico de brucelosis se sospecha en pacientes con fiebre de

origen desconocido y que cuenten con los factores de riesgo (ocupación)
Dado el curso clínico de la infección, se requiere del diagnóstico de
laboratorio
Los análisis de rutina no muestran datos específicos
En ocasiones se encuentran ligeramente elevadas las transaminasas
Se requiere de análisis serológico para establecer el diagnóstico
BRUCELOSIS Diagnóstico de Laboratorio Métodos Directos

Evidenciar la presencia de la bacteria o de sus componentes en los tejidos

Casi nunca es posible su aplicación debido a la inespecificidad de la sintomatología
Dificultades para su implementación

Método de
Ruiz-Castañeda

Aislamiento
1. Hemocultivo
de la Brucella

Diagnóstico
Sistema Bactec de certeza

2. ELISA
3. IFD
Búsqueda de Ag de Brucella en los tejidos
4. PCR
Polymerase Chain Reaction
BRUCELOSIS Diagnóstico de Laboratorio

Métodos Indirectos: SEROLOGÍA

Prueban indirectamente el contacto con la bacteria a través de la detección de Ac

Debido a las dificultades de los métodos directos, son el recurso diagnóstico más
utilizado

Durante el transcurso de una infección:

1. Inicialmente se generan Ac de clase IgM
2. Luego se generan Ac de clase IgG e IgA y comienzan a desaparecer los IgM
3. Los títulos de IgM e IgA irán descendiendo progresivamente hasta negativizarse
alrededor de los 6 meses
4. Los Ac de clase IgG permiten seguir el curso de la infección, podrán mantenerse
detectables hasta 4 años después de la primoinfección
5. En los casos de Brucelosis crónica se generan Ac IgG incompletos o no aglutinantes
(80% del total)
BRUCELOSIS Diagnóstico de Laboratorio: SEROLOGÍA
Huddleson
En Placa Rosa de Bengala
BPA (Buffered Plate Antigen)
Pruebas de
Aglutinación
SAT (Wright) sin o con 2-ME
En Tubo
Prueba de Coombs
Serología para
Brucelosis

FC: Fijación del complemento

IFI: Inmunofluorescencia Indirecta
Pruebas de
ELISA Indirecto
unión primarias
ELISA Competitivo
FPA: Polarización de la Fluorescencia

Para el diagnóstico de brucelosis humana se utilizan las pruebas de aglutinación en

placa como screening y la prueba de SAT (con y sin 2-ME) como confirmatoria
Se requieren de pruebas seriadas a fin de poner en evidencia cambios en el título de Ac
BRUCELOSIS Diagnóstico de Laboratorio: SEROLOGÍA

Pruebas de Aglutinación en Placa

Utilizan Antígenos en suspensión preparados con las cepas de B.abortus 1119-3 o 99S
Detectan Ac anti B. abortus, B. melitensis y B. suis
Rápidas, fáciles y accesibles
Utilizadas como pruebas de tamiz o screening

PRUEBAS DE AGLUTINACIÓN EN PLACA

HUDDLESSON ROSA DE BENGALA BPA
pH 6-7 3,65 ± 0,02 4,00 ± 0,02
B. abortus al 3-10 % en B. abortus al 8,5 % B. abortus al 11 %
Suspensión
fenol con verde brillante con el colorante con verde brillante
Antigénica
y cristal violeta Rosa de Bengala y cristal violeta
Cantidades decrecientes
30 ml de suero + 30 80 ml de suero + 30
Método de suero se enfrentan
ml de Ag ml de Ag
con el Ag
Informe Título de Ac Positiva o Negativa Positiva o Negativa
BRUCELOSIS REACCIÓN DE HUDDLESON (ANTÍGENOS FEBRILES)

Fundamento

Los Ac (aglutininas) presentes en el suero del enfermo, reaccionan

con una suspensión antigénica de Brucella abortus produciendo una
aglutinación visible en forma macroscópica
Se enfrentan cantidades decrecientes del suero con cantidades
constantes de antígeno

Antígenos Bacteria
Bacterianos

(+) (-)
Muestra IgM

Suero fresco
Hemólisis franca o suero lipémico puede dar lugar a reacciones inespecíficas
Puede conservarse hasta 7 días en refrigerador
BRUCELOSIS REACCIÓN DE HUDDLESON (ANTÍGENOS FEBRILES)

Técnica Sobre una placa de vidrio transparente disponer:

Mezclar con varilla de vidrio o madera. Balancear con movimientos circulares. Observar sobre
fuente luminosa la presencia o no de aglutinación dentro de los dos min.

Resultados Se informa la mayor dilución en la cual se observa aglutinación

Títulos mayores o iguales a 1/100 se consideran probatorios cuando están

acompañados de sintomatología
Títulos mayores 1/200 son concluyentes
Un título de 1/50 se considera sospechoso
Los resultados obtenidos en la titulación en placa se aproximan a los de SAT
 BRUCELOSIS Pruebas de Aglutinación en Placa

REACCIÓN DE BPA ROSA DE BENGALA

Positivo

Negativo

Positivo Positivo

Negativo
 BRUCELOSIS Pruebas de Aglutinación Tubo

Prueba de Aglutinación en Tubo de Wright o SAT (Seroaglutinación en Tubo)

Fundamento y bases metodológicas

Diluciones crecientes del suero a investigar se enfrentan con cantidades constantes de

Ag (suspensión de B. abortus al 4,5 %), se incuba un periodo de tiempo y se observa la
presencia o ausencia de aglutinación en los tubos correspondientes

Negativo

Positivo

TÍTULO ≥ 1/160 se considera POSITIVO

 BRUCELOSIS Pruebas de Aglutinación Tubo

Prueba de Wright con 2-ME

Fundamento, bases metodológicas e interpretación

Es una variante de la SAT que emplea el tratamiento (incubación) del suero del paciente
con el agente reductor 2-ME (2-Mercaptoetanol 0,1 M en solución salina)
El 2-ME inactiva las IgM por ruptura de los enlaces disulfuro del pentámero, de esta
manera, las IgM pierden su capacidad para aglutinar el Ag (suspensión B. abortus 4,5 %)
Se realizan simultáneamente las pruebas de SAT con y sin tratamiento del suero con 2-ME
La diferencia de título obtenida entre ambas pruebas corresponde a los Ac de clase IgM
Los títulos obtenidos se correlacionan con la evolución clínica de la infección
El título es significativo si es ≥ 1/40
Si el título entre ambas pruebas no varía indica enfermedad en estadío crónico
Si el título entre ambas pruebas es variable indica enfermedad en etapa aguda o de
evolución reciente
BRUCELOSIS Pruebas de Aglutinación Tubo