UNIVERSIDAD NACIONAL PEDRO RUIZ GALLO

Faculta de Ciencias Biológicas

Castañeda Bulnes Claudia Romina Dra. Carmen Rosa Carreño Farfán

Práctica 11: Bacterias solubilizadoras de fosfato

I. INTRODUCCIÓN

El fósforo es un elemento esencial para las plantas, ya que lo necesitan para crecer,
desarrollar su potencial genético y forma la base de un gran número de compuestos siendo
los más importantes los fosfatos. El fósforo en el suelo se encuentra bajo forma orgánica,
que provienen de restos vegetales, animales y de otros residuos orgánicos, que al ser
degradados liberan compuestos fosfatados; y de forma inorgánica, mayormente en forma
insoluble, por lo que no están totalmente disponibles para las plantas y la disponibilidad
depende del pH del suelo, porque solo pueden ser tomados como ion ortofosfato, pero
estos pueden convertirse en fosfatos di y monobásicos, formas asimilables para las raíces
de las plantas, por medio de bacterias solubilizadoras de fósforo (García et al., 2015).

Las bacterias solubilizadoras de fosfatos constituyen una excelente alternativa

para reducir la cantidad de fertilizantes aplicados a diferentes cultivos, ya que solubilizan
tanto el fósforo orgánico, como el inorgánico e incluyen una amplia cantidad y diversidad
de géneros (Restrepo et al., 2015). Los fosfatos insolubles, que no pueden ser asimilados
por las plantas, pueden ser llevados a formas solubles por la acción de estos
microorganismos. La vía principal de solubilización es mediante la producción de ácidos
orgánicos tales como: acético, láctico, oxálico, cítrico, butírico, succínico, málico,
glucónico, fumárico y 2-cetoglucónico (García et al., 2015).

II. OBJETIVO

• Seleccionar bacterias solubilizadoras de fosfato en suelo rizosférico.

• Comparar el índice de solubilización de fosfato en agar NBRIP.
 • Comparar el fósforo solubilizado en caldo NBRIP.

III. METODOLOGÍA

Aislamiento de bacterias solubilizadoras de fosfato

Las muestras de raíces con suelo rizosférico adherido se depositaron en bandejas

de polietileno, bajo sombra, a temperatura ambiente, por 72 horas. A continuación,
(Alvarado y Valderrama, 2014), se cortaron en fragmentos de aproximadamente 5 cm,
aleatoriamente se tomaron submuestras de 10 g de raíces junto con el suelo adherido y se
depositaron en frascos de 250 mL de capacidad, conteniendo 90 mL (10-1) de solución
salina esterilizada (NaCl 0,85%, p/v). Después de agitar el contenido de los frascos,
durante 10 minutos, se obtuvo el sobrenadante, con el que se realizó una dilución
adicional (10-2), de la que se tomaron alícuotas y se sembraron por duplicado en agar
National Research Institute (NBRIP) con 1g PL-1 , correspondiente a 5,0 gL-1 de fosfato
tricálcico, como fuente de fósforo inorgánico insoluble. El medio de cultivo será
suplementado con 45 mg de Fluconazol, para inhibir el crecimiento de hongos.

Las placas de Petri fueron incubadas a 30 °C, durante 96 horas y las colonias de
bacterias desarrolladas que presenten zonas transparentes alrededor o halos de
solubilización, después de 72 horas, fueron cultivadas por dos veces consecutivas en el
mismo agar de procedencia para verificar la estabilidad de su actividad solubilizadora,
medir el diámetro del halo de solubilización y considerarlas como bacterias
solubilizadoras de fosfato. Para su mantenimiento, las bacterias se cultivaron en agar
similar al de su aislamiento y se llevaron a refrigeración (8 °C), realizando subcultivos
cada 30 días.

Determinación del Índice de Solubilización de fosfato en medio sólido

En la determinación del índice de solubilización de fosfato en medio sólido,

(Romero y Zapata, 2014), las bacterias cultivadas en agar tripticasa soya (TSA), durante
24 horas, se sembraron por triplicado, mediante la técnica de puntura superficial en agar
NBRIP con 1 gL-1 P inorgánico (5g fosfato tricálcico). Las placas de Petri se incubaron a
30 °C, durante 96 horas y cada 24 horas, se medió el diámetro de la colonia bacteriana y
el diámetro de la colonia más el halo de solubilización. Con los valores obtenidos a las
96 horas, se calculó el índice de solubilización, IS (García y Alvarez, 2012).
Cuantificación del fósforo soluble en caldo NBRIP

Para la cuantificación del fósforo soluble en medio líquido (Vázquez et al., 2000),
se obtuvo el inóculo de cada bacteria cultivada en 2 mL de caldo NBRIP a 30 ºC, durante
20 horas, en agitación constante (150 rpm). A continuación, 0,6 mL de cada uno de los
cultivos bacterianos fueron inoculados en frascos o en biorreactores con 20 mL de caldo
NBRIP e incubados a 30 ºC, con agitación constante (150 rpm), hasta por 96 horas . Al
momento de la inoculación (0 horas) y después de 96 horas, se tomaron submuestras de
4 mL de caldo SRSM que fueron centrifugados a 3000 rpm, durante 5 minutos y en el
sobrenadante se determinó el pH y se cuantificó el fósforo soluble mediante el método
colorimétrico del molibdato según Rodier y Rodi (2005). La positividad a la
solubilización de fosfato se evidencia por una coloración azul y las concentraciones se
calcularon en una recta patrón, obtenida con diluciones crecientes de fosfato
monopotásico. Los resultados se expresaron como fósforo soluble (ppm).

Figura 1

Deshidratación de las raíces con suelo rizosférico.

Figura 2

Peso de 10 g de raíces y suelo rizosférico.

Figura 3

Obtención de las diluciones 10-1 de suelo rizosférico en solución salina.

Figura 4

Homogenización manual de las diluciones 10-1.

Figura 5

Segunda dilución de suelo rizosférico en solución salina esterilizada.

Figura 6

Siembra de cada dilución en agar NBRIP.

Figura 8

Siembra por triplicado en agar NBRIP con fosfático tricálcico, a partir de un cultivo de
bacterias solubilizadoras de fosfato.

Figura 9

Medición del diámetro de la colonia y del diámetro de la colonia más el halo de

solubilización.
Figura 10

Siembra de la bacteria, por triplicado, en frascos con caldo NBRIP.

Figura 11

Centrifugación de las submuestras en caldo SRSM.

Figura 12

Cuantificación del fósforo soluble mediante el método colorimétrico del molibdato según
Rodier y Rodi.
IV. RESULTADOS

Figura 13

Colonias de bacterias presuntamente solubilizadoras de fosfato.

Figura 14

Colonias de bacterias solubilizadoras de fosfato, obtenidas después de dos subcultivos.

Figura 15

Cultivos de bacterias solubilizadoras de fosfato.

Tabla 1

Determinación del índice de solubilización de Pseudomonas aeruginosa 43 y

Burkholderia cepacia 60 en agar NBRIP – fosfato dicálcico

Bacteria código Diámetro de la colina Diámetro de la Índice de

+ halo (mm) colonia (mm) solubilización (%)
P. aeruginosa 43 10,0 4,0 2,50
B. cepacia 60 11,0 4,0 2,75

Nota. Para calcular el índice de solubilización (IS) se realiza la siguiente ecuación:

𝐷𝑖á𝑚𝑒𝑡𝑟𝑜 𝑑𝑒 𝑙𝑎 𝑐𝑜𝑙𝑜𝑛𝑖𝑎 + 𝑑𝑖á𝑚𝑒𝑡𝑟𝑜 𝑑𝑒𝑙 ℎ𝑎𝑙𝑜

𝐼𝑆 =
𝐷𝑖á𝑚𝑒𝑡𝑟𝑜 𝑑𝑒 𝑙𝑎 𝑐𝑜𝑙𝑜𝑛𝑖𝑎

Tabla 2

Determinación del fósforo soluble de Pseudomonas aeruginosa 43 y Burkholderia

cepacia 60 en medio líquido

Bacteria código Medio sólido Medio líquido

IS P (ppm)
P. aeruginosa 43 2,50 4,69
B. cepacia 60 2,75 4,50

V. BIBLIOGRAFÍA

García, R., Lovaisa, N., y Ulla, E. (2015). Aislamiento y caracterización de bacterias

solubilizadoras de fosfatos del Noroeste Argentino y su efecto en la
promoción de crecimiento en maíz (Zea mays L.). Revista Agronómica del
Noroeste Argentino, 35(1), 13-28. https://n9.cl/aw6j8

Restrepo, G., Marulanda, S., De la Fe, Y., Díaz, A., Lucia, V., y Hernández, A.
(2015). Bacterias solubilizadoras de fosfato y sus potencialidades de uso en
la promoción del crecimiento de cultivos de importancia económica. Revista
CENIC Ciencias Biológicas, 46(1), 63-76.
https://www.redalyc.org/pdf/1812/181238817006.pdf