Determinacin de Biomasa

I. Objetivos Determinar la concentracin de levadura Saccharomyces cerevisiae en una muestra o solucin. II. Introduccin En un sistema biolgico se define al crecimiento bacteriano como el aumento ordenado de las estructuras y los constituyentes celulares de un organismo. Segn ello, el aumento de la masa celular producido por acumulacin de productos de reserva (glucgeno, poli hidroxibutirato) no constituyen crecimiento. Se puede considerar como crecimiento al incremento de clulas individuales por un lado, y por otro lado se puede considerar al crecimiento del nmero de clulas (proliferacin de la poblacin). En lo que se refiere al crecimiento de clulas individuales, este consiste en el aumento del tamao y peso de las clulas que precede a la divisin celular. Esta divisin trae aparejada un aumento en el nmero de clulas (proliferacin de la poblacin).

III. Fundamento terico

El crecimiento microbiano se evala haciendo mediciones sucesivas en tiempos determinados de la poblacin en estudio. En cada momento se evala cual es la poblacin en ese instante. Existen diversas formas de evaluar una poblacin bacteriana. a) Conteo microscpico directo

Es una tcnica comn, rpida y barata que utiliza un equipamiento fcilmente disponible en un laboratorio de microbiologa, ya que consiste en contar con un microscopio la cantidad de clulas presentes en un volumen determinado. Para estos recuentos se utilizan generalmente cmaras de recuentos (cmara de Petroff Hauser, cmara de Neubauer). Una de las mayores ventajas del recuento microscpico es brindar informacin adicional sobre el tamao y la morfologa de los objetos contados.

La muestra puede utilizarse tal cual (leche o cultivos puros en medio lquido), o puede prepararse una dilucin.

b) Conteo de clulas viables

El mtodo se basa en la consideracin que el crecimiento implica el aumento de los microorganismos capaces de formar colonias. Este mtodo puede hacerse con medios slidos o lquidos. El mtodo ms frecuentemente empleado es el conteo en placas (medios slidos) formando colonias. Por lo tanto se determinan por este mtodo solo las clulas microbianas viables en las condiciones de trabajo (nutrientes, atmsfera, temperatura). Para ello se siembra una cantidad conocida de la suspensin bacteriana cuyo nmero se desea conocer. En un medio slido cada bacteria se multiplicar formando una colonia visible a simple vista que puede ser contada. Como las colonias pueden originarse tanto de una clula como de un grupo de clulas, se utiliza el trmino: unidades formadoras de colonias (u.f.c.), y esto puede constituir una desventaja ya que si dos bacterias no se separan darn una sola colonia, subestimando de esta forma el nmero de microorganismos en la suspensin. Adems, a los efectos de que todas las clulas que queden en una placa tengan una adecuada disponibilidad de nutrientes, y que los errores del mtodo sean menores, se establece que las condiciones ptimas de conteo se dan cuando desarrollan entre 30 y 300 colonias. Algunas bacterias son difciles de contar en medios slidos (Nitritadores) y se requiere de conteos en medios lquidos. Para ello se recurre a la tcnica de determinacin del nmero ms probable (NMP) de microorganismos. Se basa en la determinacin de la presencia o ausencia de un determinado tipo de microorganismo (en funcin de que crezcan o de que produzcan determinada reaccin en el medio o no), en diferentes cantidades de muestra. Para poder determinar el NMP de microorganismo se debe diluir hasta tener una densidad que sea menor a 1 clula por cada mililitro de diluyente. La interpretacin de los resultados, se hace en base a una distribucin estadstica y en general se emplean tablas preparadas de acuerdo a la cantidad de muestra que se siembra en cada serie de tubos, teniendo en cuenta la dilucin en la que se observa proliferacin de microorganismos.

Este mtodo se emplea para recuentos microbianos de Nitritadores por la dificultad que presentan para ser visualizadas las colonias en medios slidos. Tambin es til para determinar cargas microbianas bajas, menores de 10 por gramo, pero puede igualmente emplearse para cargas mayores utilizando las diluciones apropiadas. Se prefiere adems este mtodo cuando los microorganismos son de lento crecimiento, o cuando han sido sometidos a condiciones adversas (temperatura alta, desecacin, etc.). c) Medicin de la densidad bacteriana

Es una tcnica en la que se mide la masa de microorganismos en una suspensin. Para ello se utiliza un espectrofotmetro y se mide la cantidad de luz que atraviesa en una suspensin de microorganismos, en comparacin con un blanco que es el medio esterilizado y sin sembrar. Cuanto mayor es el nmero de clulas en suspensin, tanto menor es el porcentaje de luz que atraviesa el medio. Para relacionar la transmitancia con la densidad bacteriana se requiere de hacer curvas patrn de densidad conocida. d) Otros mtodos de recuento Determinacin de ATP: es una tcnica que permite determinar indirectamente la masa de una poblacin bacteriana. Se considera que la proporcin de ATP encontrado en una muestra es proporcional con la presencia de clulas vivas. Recuento electrnico: los contadores electrnicos permiten realizar recuentos de bacterias, levaduras no filamentosas y protozoarios, pero no de hongos y microorganismos filamentosos o miceliares. Estos instrumentos constan de electrodos que miden la resistencia elctrica del sistema. Un volumen fijo de una suspensin bacteriana es forzado a pasar desde un compartimiento al otro a travs del pequeo conducto. Cuando pasa un microorganismo, la resistencia al pasaje de una corriente elctrica se incrementa debido a que la conductividad de la clula es menor que la del medio. Estos cambios en la resistencia son convertidos en pulsos y contados. Este tipo de recuento presenta algunos inconvenientes. No pueden medirse soluciones muy concentradas de

microorganismos, debido a que el pasaje de ms de una clula en un breve perodo de tiempo va a ser tomado como una clula ms grande, y es comn la obstruccin del orificio por microorganismos muy grandes.

IV. Resultados En esta prctica determinamos la concentracin de clulas de levadura Saccharomyces en cierto volumen de agua. Se prosigui de la siguiente manera: Se extrajo de una placa de cultivo de levadura Saccharomyces con un hisopo a travs de un raspado cierta cantidad de microorganismos. Se llev el hisopo y se introdujo en un tubo con cierta cantidad de agua, se mezcl bien. Luego con una pipeta se sac 1 mL de esta muestra y se diluy en otro tubo (10-1). Finalmente de esta dilucin colocamos 2 gotas, 1 a cada lado de la lmina en la cmara de Neubauer. Se procedi a la lectura.

Nuestros resultados fueron:

19 20 15 8 16

25 25 15 17 19

17 22 5 14 14

14 22 11 21 14

15 22 17 12 14

 Determinacin del nmero de clulas de levadura Saccharomyces por mL de muestra

(19+20+15+8+16+25+25+15+17+19+17+22+5+14+14+14+22+11+21+14+15+ 22+17+12+14)/25 = 16.52 = 17 clulas de levadura Saccharomyces en promedio por cada cuadrante.

x 10 = 4.25 x

clulas / mL

Determinacin del coeficiente de variabilidad

Coeficiente de variabilidad (CV) =

Para todas las lecturas: Desviacin estndar () = 4.89 Promedio (X) = 16.52 CV = = 0.296 = 29.6%

Como nuestro coeficiente de variabilidad (CV) nos sale menor al 30%, entonces podemos concluir que nuestros datos son buenos.

 Para 5 datos, tomados al azar: 15, 11, 22, 25, 14. Desviacin estndar () = 5.86 Promedio (X) = 17.4

CV =

= 0.3368 = 33.68%

Podemos concluir que nuestros 5 datos tomados al azar son representativos de todas las lecturas, ya que nos sale aprox. 30% que significa que nuestros datos son buenos.

V. Discusiones Para el conteo de levaduras totales: viables + muertas, se utiliza la cmara de Neubauer que tiene una capacidad de 0.3 mm3 y permite realizar el conteo de microorganismos a travs de una cuadrcula (400 cuadraditos) impresa en la cmara. Se obtiene el nmero aproximado de UFC/mL. (Arniz, C.; 2000) El conteo por cmara de Neubauer realiza el conteo casi instantneo de la muestra, por ejemplo en caso de fermentacin, y se puede tener control de cmo avanza la microflora, sin embargo los datos son inexactos o muy cercanos. (Madigan, 1998) Se demuestra la practicidad de la tcnica pero la ineficacia de su exactitud, lo cual permite una eleccin sobre los propsitos, una investigacin; es decir, si bien la exactitud permite un estudio pormenorizado, por el tiempo de demora de la preparacin de material y muestra este sera ineficaz para un control de proceso. (Brock, T.; 1993)

El conteo por cmara de Neubauer permite un control cercano y al momento en el mismo proceso de fermentacin microbiana, lo cual para trminos tcnicos es bastante deseado, aunque no es exacto permite visualizar una aproximacin del cultivo, que bien podra mejorarse con otras tcnicas alternas de recoleccin de muestra. (Prescott, L.; 1999)

VI. Conclusiones Se determin la concentracin de levadura Saccharomyces cerevisiae en una muestra o solucin. VII. Bibliografa ARNIZ, L.; 2000; Determinacin de la biomasa en procesos biolgicos. Mtodos directos e indirectos; Tecnologa del agua; pgs. 45 52. MADIGAN, M.; 1998; Biologa de los microorganismos; 8 edicin; Edit. Prentice Hall; Espaa. BROCK, T.; 1993; Microbiologa; 6 edicin; Edit. Prentice Hall; Mxico. PRESCOTT, L.; 1999; Microbiologa; 4 edicin; Edit. McGraw Hill; Mxico.