UNIVERSIDAD NACIONAL PEDRO RUIZ GALLO

Faculta de Ciencias Biológicas

Castañeda Bulnes Claudia Romina Dra. Carmen Rosa Carreño Farfán

Práctica 10: Bacterias rizosféricas y endófitas fijadoras de nitrógeno

no simbióticas

I. INTRODUCCIÓN

La rizósfera es el entorno influido bioquímica y biológicamente por las raíces

de las plantas, donde proliferan y compiten microorganismos. Algunos de estos son
beneficiosos para las plantas ya que ayudan a transportar nutrientes, producen
hormonas y pueden contribuir al control de patógenos. Esta relación
microorganismo-planta están mediadas por compuestos químicos. En la rizósfera
constituye un ambiente favorable parael desarrollo de los microorganismos y se ha
determinado que las poblaciones en los primeros 10 µm pueden alcanzar 1,2 x 10 8
células cm-3 o 10 9 células microbianas g-1 suelo. (Anaya et al., 2001)

Las bacterias fijadoras de nitrógeno pueden ser de vida libre o estar en

relación simbiótica con plantas leguminosas en las que forman nódulo de raíz o en no
leguminosas.Las bacterias libres fijadoras de nitrógeno se encuentran en la rizósfera
en grandes cantidades, la cual es una región ubicada a 2 mm de distancia de la raíz.
Entre las bacterias libres que pueden fijar el nitrógeno tenemos a Azotobacter y
Beijerinckia. En el caso de Azotobacter son aerobios utilizan gran cantidad de
oxígeno, lo que restringe la difusión al interior de la célula. De esta manera evitan
que la enzima nitrogenasa, la cual es muy sensible al oxígeno, entre en contacto con
esta. (Totora et al, 2007)

II. OBJETIVO

• Identificar fenotípicamente bacterias rizosféricas fijadoras de nitrógeno no

simbióticas.
 • Identificar fenotípicamente bacterias endófitas fijadoras de nitrógeno no
simbióticas.

III. METODOLOGÍA

❖ Identificación de bacterias rizosféricas fijadoras de nitrógeno

Obtención de muestras

En los cultivos de maíz en fase de pre-floración, se extrajeron aproximadamente

50 g de raíces y suelo adherido, se depositaron en bolsas plásticas debidamente
etiquetadas e inmediatamente se transportaron en una caja térmica (10±1°C), hacia el
laboratorio de Microbiología y Parasitología, de la Facultad de Ciencias Biológicas,
Universidad Nacional Pedro Ruiz Gallo, en Lambayeque.

Aislamiento de bacterias rizosféricas fijadoras de nitrógeno

Las muestras de raíces con suelo rizosférico fueron depositadas en una bandeja de
polietileno, bajo sombra, a temperatura ambiente, por 72 horas. Luego fueron
fragmentadas (5 cm), aleatoriamente se tomaron 10 g de raíces junto con el suelo adherido
y se depositaron en frascos de 250 mL de capacidad, conteniendo 90 mL de solución
salina esterilizada NaCl 0,85% p/v. Después de agitar el contenido de los frascos
manualmente, durante 10 minutos, se obtuvo el sobrenadante, para el aislamiento de
bacterias rizosféricas según Garrido (2007) y Altamirano et al. (2014). Se tomaron
alícuotas (una gota) y se sembraron mediante la técnica de puntura, en medios semisólidos
sin nitrógeno, para aislar bacterias microaerófilas y agotamiento y estría sobre la
superficie de medios sólidos, para bacterias aerobias. Ambos medios, semisólido y sólido,
sin nitrógeno, serán suplementados con antimicótico Fluconazol.

Los medios de cultivo semisólidos para bacterias microaerófilas serán NFb y LGI
para Azospirillum spp., JNFb para Herbaspirillum spp., LGI-P para Gluconacetobacter
spp. y JMV para Burkholderia spp. (Garrido, 2007; Jha et al., 2009; Marra et al., 2012).
Después de la incubación a 30±2°C por 7 días, se seleccionaron los medios con la mayor
dilución, donde se observe una película blanquecina bajo la superficie y el viraje del
indicador y se realizaron subcultivos en similares medios por dos veces consecutivas.
Para el aislamiento de bacterias microaerófilas, con la película bacteriana se obtuvo una
suspensión en solución salina esterilizada y se sembró en los medios sólidos respectivos,
incubando a 30±2°C por 2 días. Los diversos morfotipos de las bacterias aisladas se
cultivaron nuevamente en el medio semisólido (tercer subcultivo), posteriormente en el
medio sólido correspondiente contenido en placa de Petri y luego en vial.

Para aislar bacterias aerobias, los medios de cultivo sólidos serán LG para
Azotobacter spp., BEIJ para Beijerinckia spp. y LGD para Derxia spp. (Garrido, 2007;
Jha et al., 2009). Después de la incubación a 30±2°C por 2 días, con los morfotipos de las
bacterias representativas se obtuvieron suspensiones en solución salina esterilizada y se
sembraron en los medios sólidos respectivos y posteriormente en agar batata. Con las
colonias de las bacterias microaerófilas y aerobias se realizaron tinciones de Gram y se
cultivaron en agar nutritivo y medios semisólido y sólido sin nitrógeno, constituyendo los
cultivos puros de bacterias fijadoras de nitrógeno rizosféricas, y se guardaron en
refrigeración (8°C).

Identificación fenotípica y mantenimiento de bacterias rizosférica fijadoras de

nitrógeno

Para identificar las bacterias rizosféricas fijadoras de nitrógeno se realizaron las

pruebas descritas en las tablas 1 a 7. Las bacterias rizosféricas diazotróficas identificadas
se cultivaron en el medio semisólido respectivo y en agar nutritivo, a temperatura
ambiente (28 ºC) y refrigeración (8 ºC), respectivamente, realizándose subcultivos cada
30 días.

Figura 1

Deshidratación de las raíces recogidas.

Figura 2

Fragmentación de las raíces con el suelo adherido.

Figura 3

Mezcla de 10 g raíces con suelo rizosférico y solución salina fisiológica, para la

obtención de sobrenadante.

Figura 4

Método para el aislamiento y obtención del cultivo puro de bacterias fijadoras de

nitrógeno microaerófilas, a partir del sobrenadante.
Figura 5

Técnica de siembra por agotamiento y estría de bacterias fijadoras de nitrógeno aerobias

en medios sólidos.
Figura 6

Uso de carbohidratos como fuente de C para la identificación de género y especie de

bacterias rizosféricas fijadoras de nitrógeno de los cultivos puros en medios semisólidos.

❖ Identificación de bacterias endófitas fijadoras de nitrógeno

Obtención de muestras

En los cultivos de maíz en fase de pre-floración, se extrajeron aproximadamente

50 g de raíces y suelo adherido, se depositaron en bolsas plásticas debidamente
etiquetadas e inmediatamente se transportaron en una caja térmica (10±1°C), hacia el
laboratorio de Microbiología y Parasitología, de la Facultad de Ciencias Biológicas,
Universidad Nacional Pedro Ruiz Gallo, en Lambayeque.

Aislamiento de bacterias endófitas fijadoras de nitrógeno

Desinfección del tejido

Las raíces fueron lavadas con agua potable para retirar el suelo adherido. Para la
desinfección superficial, se seleccionaron las diez raíces laterales más engrosadas, se
cortaron en fragmentos de aproximadamente 5 cm, se pesaron 5 g y se depositaron en
frascos de 500 mL de capacidad, con tapa, previamente esterilizados, para ser lavados
con 50 mL de agua destilada más detergente neutro 0,005% por 1 minuto y enjuagaron
por cuatro veces consecutivas con agua destilada esterilizada: 1 minuto por enjuaguar.
Después, se agitaron por 15 minutos en solución tampón de fosfato de potasio 0,05 molL-
1
, pH 7.0; se sometieron a inmersión por 1 minuto en alcohol 70 % y agitación por 5
minutos en solución de hipoclorito de sodio (NaClO) 5 % más Tween 80 % . (Pérez et
al., 2010; Altamirano et al.,2014). A continuación, el tejido fue llevado a nuevos frascos
previamente esterilizados, para la inmersión por 1 minuto en alcohol 70 %, seguida por
agitación por 15 minutos en solución tampón y finalmente, lavado por cuatro veces con
agua destilada esterilizada (Delgado y Suyón, 2017). Para confirmar la desinfección de la
superficie de las raíces, alícuotas del último lavado serán sembradas en agar nutritivo e
incubadas a 30ºC, por 48 horas.

Siembra y aislamiento

El tejido vegetal previamente esterilizado fue depositado en papel secante para

eliminar el exceso de humedad y luego fue llevado a bolsas de polietileno de 16x15 cm.
A continuación, el tejido vegetal fue macerado y resuspendido en 0,5-1 mL de solución
salina esterilizada (NaCl 0,85% p/v), si fuera necesario. Con una jeringa se extrajo 1mL,
sembrándose inmediatamente una gota por doble puntura en los medios de cultivo
semisólidos sin nitrógeno: NFb y LGI para Azospirillum spp., JNFb para Herbaspirillum
spp., LGI-P para Gluconacetobacter spp. y JMV para Burkholderia spp. (Garrido, 2007;
Jha et al., 2009). Adicionalmente se extrajo 1mL del macerado, se diluyó en solución
salina esterilizada (10-1) y se sembró en los medios semisólidos respectivos.

Después de la incubación a 30±2°C por 7 días, se seleccionaron los medios

semisólidos con la mayor dilución, donde se observe una película blanquecina bajo la
superficie y el viraje del indicador y se realizaron subcultivos en los mismos medios, por
dos veces consecutivas. Para el aislamiento, con la película bacteriana, se obtuvo una
suspensión en solución salina esterilizada y se sembró en los medios sólidos respectivos,
incubando a 30±2°C por 7 días. Las colonias desarrolladas se cultivaron nuevamente en
medio semisólido libre de nitrógeno y luego en agar sólido, obteniendo los cultivos puros
que después de una tinción de Gram, fueron guardados en refrigeración (8°C).

Identificación fenotípica y mantenimiento de bacterias endófitas

Las bacterias endófitas nativas fijadoras de nitrógeno se identificaron en función

de las características morfológicas y fisiológicas según el Manual de Bergey de
Bacteriología Sistemática (Brenner et al. 2005), Schoebitz (2006) y Garrido (2007). Con
todas las bacterias se realizaron pruebas de catalasa, oxidasa y motilidad. Para el género
Azospirillum, las pruebas serán tolerancia a NaCl 3%, utilización de sacarosa, glucosa,
manitol y ácido málico como fuentes de carbono para la fijación de nitrógeno y
requerimiento de biotina. Para Herbaspirillum se investigará el crecimiento en caldo NFb,
hidrólisis de la urea y reducción de nitratos.

Para Gluconacetobacter se investigaron el crecimiento en agar Batata, hidrólisis

de gelatina y almidón y utilización de citrato, glucosa y sacarosa al 30%. Para
Burkholderia, se realizaron pruebas de resistencia a la polimixina-B (300 UI),
descarboxilación de lisina y prueba de hidrólisis de urea. Para su mantenimiento, las
bacterias endófitas diazotróficas identificadas se cultivaron en el medio semisólido
respectivo y en agar nutritivo, a temperatura ambiente (28°C) y refrigeración (8°C),
respectivamente, realizándose subcultivos cada 30 días (Silva y Zúñiga, 2017).

Figura 7

Recolección de raíces de Zea mays L. en floración.

Figura 8

Lavado de raíces.

Figura 9

Fragmentación de las raíces engrosadas seleccionadas.

Figura 10

Pesar 5 g de raíz.
Figura 11

Desinfección en frasco de las raíces.

Figura 12

Inmersión de las raíces en alcohol de 70 %.

Figura 13

Inmersión de raíces en solución de hipoclorito de sodio-Tween 80 %.

Figura 14

Agua del último enjuague de raíces.

Figura 15

Siembra del agua de último enjuague en agar nutritivo.

IV. RESULTADOS
Figura 16

Colonias de bacterias fijadoras de nitrógeno en medio NFb.

Figura 17

Cultivo puro de bacterias rizosféricas microaerófilas fijadoras de nitrógeno en medio

NFb.

Figura 18

Utilización de carbohidratos como fuente C y tolerancia al NaCl 3% de Azospirillum

lipoferum.
Figura 19

Bacterias endófitas microaerófilas fijadoras de nitrógeno en medios semisólidos.

V. BIBLIOGRAFÍA

Anaya, A., Espinosa, F., y Cruz, R. (Ed.). (2001). Relaciones químicas entre
organismos:aspectos básicos y perspectivas de su aplicación. Plaza y
Valdez, S.A.
https://books.google.com.pe/books?id=8Gt7CoKx3W4C&pg=PA100&dq=
rizos fera&hl=es
419&sa=X&ved=2ahUKEwivvr3LnqLzAhXOJ7kGHShlBboQ6AF6BAgC
EAI#v=onepage&q=rizosfera&f=false

Totora, G., Funke, B., y Case, C. (2007). Introducción a la Microbiología (9ª

ed.).Editorial Médica Panamericana.
https://books.google.com.pe/books?id=Nxb3iETuwpIC&pg=PA815&dq=b
acterias+fijadoras+de+nitrogeno&hl=es-
419&sa=X&ved=2ahUKEwiv8OaJtpHzAhXKEbkGHacjAm0Q6AF6BAgJ
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