Manual de “Prácticas de Bioquímica I” UNAP - FFB

PRACTICA Nº 05

DEMOSTRACION DE LA NATURALEZA PROTEICA DE LAS ENZIMAS

DEMOSTRACIÓN DE LA ACTIVIDAD ENZIMÁTICA Y ESPECÍFICA

DEMOSTRACION DE LA NATURALEZA PROTEICA DE LAS ENZIMAS

I. GENERALIDADES
Las enzimas participan en cada proceso bioquímico. Actuando en secuencias organizadas
catalizan cientos de reacciones consecutivas mediante las que se degradan nutrientes, se
conserva y transforma la energía química y se fabrican las macromoléculas biológicas a partir
de precursores sencillos.

Al igual que otras proteínas, las enzimas tienen una estructura tridimensional y la catálisis que
en ellos ocurre es por los mismos mecanismos que se observan en las reacciones orgánicas
ordinarias, por las estructuras proporcionadas a través de los residuos aminoacilos y sus
grupos prostéticos.

Las enzimas son capaces de acelerar las reacciones químicas de la digestión ahorrando así una
importante cantidad de energía y tiempo (sin ellas nuestras digestiones podrían durar varios
días). Hay tres categorías básicas de enzimas digestivas tales como: las proteasas o enzimas
proteolíticas (degradan las proteínas), las amilasas (degradan carbohidratos como los
almidones), las lipasas (degrada lípidos).

La saliva es un líquido opalescente, inodoro y suavemente alcalino segregado sobre todo por
las glándulas salivales, cuyos conductos la llevan a la boca en tres zonas: debajo del maxilar
inferior, frente al pabellón de la oreja y bajo la lengua. El revestimiento interior de la boca
también segrega algo de saliva. Es el primer jugo digestivo que ataca a los alimentos. Contiene
amilasa salival que es capaz de hidrolizar la molécula de almidón y de glucógeno hasta
maltosa.

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OBJETIVOS
Al término de esta práctica el alumno será capaz de:
➢ Verificar la naturaleza proteica de las Enzimas.
➢ Evidenciar que las enzimas son proteínas que gozan de las propiedades de estas y que
son sensibles a los agentes físicos, haciendo variar su comportamiento y su actividad.

II. MATERIALES, EQUIPOS Y REACTIVOS

MATERIALES
Tubos de ensayo de 13 ml Gradilla Vaso precipitado (400ml)
Pipetas (1ml, 2ml, 5ml y 10ml) Lunas de reloj Probeta de 50ml
Pizetas Embudo de vidrio Erlenmeyer de 100ml Espátula

EQUIPOS
Baño María Cocina eléctrica Balanza analítica

MATERIAL BIOLOGICO
Amilasa salival10%

REACTIVOS
Agua destilada NaOH 1N CuS04 20% Buffer fosfato 0.1 M pH 6.6
HCl 3 N HCl 0.05 N Acido Tricloroacético 20 %
NaCl 0.15 M Solución yodada

III. METODO - PROCEDIMIENTO

1. OBTENSION DE LA ENZIMA:
PROCEDIMIENTO:
Se obtiene la muestra salival en un vaso de precipitación la cual es posteriormente filtrada con
algodón o papel filtro delgado para evitar alteraciones de la muestra.

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2. DEMOSTRACION DE LA NATURALEZA DE LAS ENZIMAS:

Se realiza la preparación del siguiente sistema de tubos.

COMPONENTES / TUBOS I II III IV V VI

Muestra (Enzima al 10%) 1 ml 1 ml 1 ml 1 ml 1 ml 1 ml

NaOH 01 N 2.4 ml

HCl cc (3N) 2.4 ml

Acido tricloroacetico 2.4 ml

CuSO4 20% 2.4 ml

Buffer Acetato 0.1M pH 6.6 2.4 ml

Dejar los tubos del I al V en reposo por 10 minutos a temperatura ambiente.

Al tubo VI colocarlo en baño de agua hirviendo por 10 minutos.
Durante este lapso de tiempo preparar el siguiente sistema:

COMPONENTES / TUBOS I II III IV V VI

Sustrato Almidón 1 ml 1 ml 1 ml 1 ml 1 ml 1 ml

Buffer Acetato 0.1 M pH 6.6 5 ml 5 ml 5 ml 5 ml 5 ml 5 ml

NaCl 0.15 M 1.4 ml 1.4 ml 1.4 ml 1.4 ml 1.4 ml 1.4 ml

Agua destilada 2 ml 2 ml 2 ml 2 ml 2 ml 2 ml

A cada tubo Muestras del sistema pre incubar por 2 minutos a 37ºC

En seguida agregar 0.6 ml del preparado anterior a su tubo correspondiente y dejar en

incubación a 37ºC por 20 minutos

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DETERMINACION DE LA ACTIVIDAD ENZIMATICA:

Construir el siguiente sistema.

COMPONENTES / TUBOS I II III IV V VI

HCl 0.05 N 5 ml 5 ml 5 ml 5 ml 5 ml 5 ml

Tubos de Reacción del sistema

0.5 ml 0.5 ml 0.5 ml 0.5 ml 0.5 ml 0.5 ml
anterior

Agregar solución yodada 0.5 ml 0.5 ml 0.5 ml 0.5 ml 0.5 ml 0.5 ml

Observar el color producido e interpretar.

IV. RESULTADOS

V. DISCUSION

VI. CONCLUSIONES

VII. RECOMENDACION

VIII. REFERENCIAS BIBLIOGRÁFICAS

1.

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DEMOSTRACION DE LA ACTIVIDAD ENZIMATICA Y ESPECIFICA.

I. GENERALIDADES
Al no ser posible medir la cantidad de enzima directamente en las estructuras biológicas, se
recurre a la medida de la velocidad de la reacción que cataliza. Esto es posible debido a que la
velocidad de la reacción es directamente proporcional a la cantidad de enzima. De esta manera
se puede expresar la cantidad de una enzima en términos de unidades enzimáticas,
entendiéndose por UNIDAD DE UNA ENZIMA a la cantidad de ella que produce cierta
velocidad de reacción bajo determinadas condiciones. Esa velocidad de reacción se expresa
como la cantidad de sustrato transformado en cierto tiempo.

Las reacciones enzimáticas pueden ser medidas controlando el sustrato no transformado

(sustrato residual) o controlando los productos liberados. Es conveniente definir alguna forma
que exprese la velocidad de una reacción que puede ser producida por una cantidad dada de un
preparado enzimático. Dicha velocidad puede ser expresada en las siguientes formas:

Unidad de Enzima: (U)

Una Unidad Internacional (UI) de cualquier enzima está definida como aquella cantidad de
enzima que cataliza la transformación de un micro mol de sustrato en un minuto bajo
condiciones definidas de pH y temperatura.

Actividad Especifica:
Se denomina Actividad Específica a la cantidad de una enzima expresada en términos del
contenido de proteína de la preparación, y se expresa como el número de unidades de la
enzima por miligramo de proteína. La actividad específica además de cuantificar la enzima,
constituye una medida del grado de pureza de la enzima durante el proceso de purificación.

Actualmente la Unión Internacional de Bioquímica, recomienda el uso de una nueva unidad

EL KATAL (kat) que se define como la cantidad de enzima que transforma un mol de sustrato
en producto por segundo.

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OBJETIVOS
Al término de esta práctica el alumno será capaz de:
➢ Demostrar y cuantificar la actividad de una enzima
➢ Determinar y medir la actividad específica de una enzima
➢ Deducir su importancia de la actividad enzimática en el mantenimiento de la vida

II. MATERIALES, EQUIPOS Y REACTIVOS

MATERIALES
Tubos de ensayo de 13 ml Gradilla Vaso precipitado (400ml)
Pipetas (1ml, 2ml, 5ml y 10ml) Pizetas Probeta de 50ml, 100ml
Embudo de vidrio Espátula Agitador (varilla) de vidrio
EQUIPOS
Baño María Cocina eléctrica Balanza analítica
MATERIAL BIOLOGICO
Amilasa salival10%
REACTIVOS
Agua destilada Buffer acetato 0.02 M pH 5.0 Sacarosa 0.17 M
Hidróxido de Bario 0.3 N Sulfato de Zinc 5 % Solución fosfomolíbdica
Solución cúprico alcalina Reactivo de Biuret

III. METODO - PROCEDIMIENTO

1. SISTEMA DE INCUBACIÓN:
Preparar el siguiente sistema:

COMPONENTES / TUBOS I II
Sacarosa 0.17 M 0.3 ml
Buffer acetato 0.02 M pH 5.0 0.5 ml 0.5 ml
Incubar a 37°C. (Pre incubación ) por 2 minutos
Preparado enzimático 0.2 ml 0.2 ml
Mezclar e incubar a 37°C Por 20 minutos
Detener la reacción empleando :

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Hidróxido de bario 0.3 N 0.5 ml 0.5 ml

Sulfato de zinc 5 0.5 ml 0.5 ml
Sacarosa 0.17 M 0.3 ml
Agua destilada 8.0 ml 8.0 ml
MEZCLAR: Separar el precipitado de proteínas filtrando o centrifugando por 10 minutos.

2. DETERMINACIÓN DE PRODUCTOS DE LA REACCIÓN: (Azúcar reductor)

Se empleará los filtrados libres de proteínas del paso anterior y se determinará el azúcar
reductor mediante el siguiente procedimiento:
COMPONENTES / TUBOS I II BLANCO
Filtrado I 0.5 ml
Filtrado II 0.5 ml
Agua destilada 0.5 ml 0.5 ml 1.0 ml
Solución cúprico alcalina 1.0 ml 1.0 ml 1.0 ml
Colocar en baño de agua hirviendo durante 8 minutos
Enfriar al chorro de agua
Solución Fosfomolíbdica 1.0 ml 1.0 ml 1.0 ml
MEZCLAR: agregar 7 ml de agua destilada.
Mezclar y dejar en reposo durante 10 minutos.
Leer a 420 nm (filtro azul) factor = 0.088

2.1. CALCULOS DE LA CONCENTRACIÓN DE LOS PRODUCTOS (HEXOSAS)

u moles de hexosa/ml = Factor (Lectura II - Lectura blanco) - (Lectura I - Lectura Blanco)

2.2. CALCULO DE (U)

Micromoles de sustrato transformado Micromoles de Hexosa/2
U= =
Minuto Tiempo de incubación minutos

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3. DETERMINACIÓN DE LA ACTIVIDAD DE ESPECIFICA:

3.1. DETERMINACIÓN DE LA CONCENTRACIÓN DE PROTEÍNAS EN EL
PREPARADO ENZIMÁTICO: (REACCIÓN DE BIURET).
COMPONENTES / TUBOS I II
Preparado enzimático 0.2 ml
Agua destilada 1.0 ml 0.8 ml
Reactivo de Biuret 4.0 ml 4.0 ml
Mezclar y dejar en reposo por 30 minutos
Leer a 540 nm (Filtro verde) Factor = 0.15

3.2. CALCULO DE LA ACTIVIDAD ESPECIFICA:

U
A. E. =
mg. de proteínas

IV. RESULTADOS

V. DISCUSION

VI. CONCLUSIONES
VII. RECOMENDACION

VIII. REFERENCIAS BIBLIOGRÁFICAS

1.