ASIGNATURA DE BIOLOGÍA -

PRÁCTICA

INFORME 10: "Extracción del ADN"

INTEGRANTES

 ALVITES PISCOYA FABRIZIO ISAAC 2020234968

 ARAUJO MIRANDA SOLANCH GUADALUPE 2020154374
 ARCE TANTARICO FRANK ERICH 2020234977
 BANCES SÚCLUPE EVELYN YOMARA 2020235026
 CABREJOS SOSA LINDA MARICIELO 2020235059
 FARFÁN SÁENZ BRANDT MARIO 2020109031
 LOAYZA MENDOZA RÓMULO ALESSANDRO 2019205447
 MEJÍA RODRÍGUEZ EDELMIRA KRISTHAL 2020235603
 MONTENEGRO PAREDES KARLA JIMENA 2020229042
 SANTISTEBAN VALDERRAMA ÁNGELA ROSALÍA 2020228515
 SECLÉN BERNABÉ MARÍA 2020236031
 SILVA REYES JHONNATAN BENJAMÍN 2020236048
 TORRES SANDOVAL EVELYN 2020108248
 ZELADA CARBONEL ADRIANA 2020228947

DOCENTE
Dr. Jorge Morales

SECCIÓN M26

CHICLAYO, PERÚ 2021

OBTEJIVOS:

1. Utilizar una técnica sencilla para poder extraer el ADN de un tejido animal y por
el aspecto que presenta, confirmar su estructura fibrilar.
2. A partir de la longitud enorme de las fibras también confirmar que en el núcleo el
ADN se encuentra replegado.
3. Comprobar la movilidad del ADN en un gel de agarosa.
4. Analizar la utilidad de esta técnica en ensayos de biología molecular aplicada.

INTRODUCCIÓN:

El ADN es un polímero de desoxiribonucleótidos, que en eucariotas es el

componente de la cromatina o material genético. En la cromatina el ADN
se encuentra como una doble hebra asociado a proteínas conocidas como
nucleoproteínas de tipo histonas, portaminas y en menor proporción con
proteínas de tipo ácidas. La extracción celular consiste en el aislamiento
y purificación de moléculas de ADN y se basa en las características
fisicoquímicas de la molécula. El ADN está constituido por dos cadenas
de nucleótidos unidas entre sí formando una doble hélice. Para extraer el
ADN sin arrastrar sus proteínas asociadas se podría emplear soluciones
ácidas. Sin embargo, éstas soluciones podrían dañar la estructura de la
hebra, de modo que se prefiere emplear solventes orgánicos como
cloroformo, el cual extrae proteínas dejando insoluble al ADN.
Las proteínas asociadas al ADN, de gran longitud, se habrán fraccionado
en
cadenas más pequeñas y separadas de él por acción del detergente. Sólo
queda, por tanto, extraer el ADN de esa mezcla de tampón y detergente.
I. PROCEDIMIENTO Y RESULTADOS
R. DE LA EXTRACCIÓN DEL ADN (saliva)
 Preparamos la disolución de detergente (A) al 25% de agua y la disolución de sal
(B) al 6% de agua.
 Nos enjuagamos la boca con una cucharada de agua durante 30 segundos. Luego
la vertemos sobre uno de los vasos de plástico.
 Una vez en el vaso la muestra, le añadimos una cucharada de la disolución A y
una cucharada de la disolución B. (Liberación del ADN del núcleo)
 Añadimos alcohol hasta la mitad del vaso, evitando que este se mezcle con la
disolución acuosa y dejamos reposar un minuto.
 Por último, retiramos parte del ADN concentrado en el vaso y lo colocamos en un
portaobjetos y lo teñimos para su posterior observación en el microscopio.
R. DE LA EXTRACCIÓN DE ADN DEL TOMATE:

 Triturar el tomate para romper las membranas celulares y se filtra con un colador.
 Preparar el tampón de lisis con un cuarto de litro de agua mineral, dos
cucharaditas de sal para neutralizar las cargas negativas de los grupos fosfato,
unas seis cucharaditas de bicarbonato de sodio al ras para controlar el pH de
esta solución y dos chorritos de lava vajilla, para romper la membrana de lípidos.
 Cada vez que se agregue los ingredientes, se agita la mezcla o solución de lisis.
 Se mide 10ml de tomate con 20ml del tampón de lisis, se coloca en un frasco con
tapa y se agita durante dos minutos.
 Se filtra esta solución y se pasa 5ml de esta solución a un tubo de ensayo y se
agrega 10ml de alcohol por las paredes del tubo de ensayo de manera lenta.
 Se observa que en la interfase del tomate y del alcohol una banda blanquecina
que es el ADN y se puede extraer con una pinza.
 Esta se puede visualizar fácilmente.

TUBO CON EL ADN EXTRACCION DEL ADN CON LA PIPETA

PIPETA
 II. CUESTIONARIO

1. ¿Qué hay en el primer carril?

La electroforesis en gel de agarosa es una técnica
muy utilizada para separar moléculas o fragmentos
de moléculas de ácidos nucleicos. En esta técnica,
los geles se comportan como un tamiz molecular y
permiten separar moléculas cargadas en función de
su tamaño y forma (1). Al aplicar esta técnica, el
campo magnético producido va a provocar la
migración del ADN del polo negativo hacia el polo
positivo.
Como vemos en la imagen, en el carril 1, se puede
visualizar que, a partir de la electroforesis realizada,
la muestra se ha separado en moléculas de ADN y
ARN.

2. En la muestra 1, ¿qué tamaño aproximado tienen las bandas de ADN?

Como podemos observar, en la imagen hay diversos fragmentos de ADN, los

cuales se encuentran distribuidos en dos carriles. Pero en este caso nos piden
calcular el tamaño que tienen las bandas en la muestra 1 y para ello se debe
tener en cuenta los pesos que se encuentran establecidos en la primera
columna ya que en ella se van a encontrar fragmentos de ADN de tamaño
conocido (2). Entonces como todas las muestras migran al mismo tiempo y en
el mismo gel, se puede establecer aproximadamente el tamaño de los
fragmentos de ADN de las muestras desconocidas basándonos en los tamaños
ya conocidos, por lo cual se podría establecer que:
 CARRIL MUESTRA 1
Fragmento 1: 6.8 kpb
Fragmento 2: 6.1 kpb
Fragmento 3: 3.9 kpb

3. ¿Por qué aparece RNA en algunas nuestras y por qué aparece tan abajo,
comparado al ADN?
Como se sabe, la electroforesis es una técnica que se utiliza
de forma generalizada en la que, fundamentalmente, se
aplica corriente eléctrica a moléculas biológicas, ya sean
ADN, ARN o proteínas. (3)
La separación se da en función del tamaño o topología de las
diferentes moléculas. (3) Cuanto más corta sea, más migran
en el gel utilizado para la electroforesis. Asimismo, las
proteínas más pequeñas terminarán en la parte inferior de las
muestras cargadas en pozos, mientras que las de mayor
tamaño en la parte superior.
Esta técnica es utilizada para separar en este caso el ADN del ARN, haciendo uso de
 corriente eléctrica para permitir que las moléculas se muevan y se separen a través del
gel, cuyos poros actúan como un colador.
Por otro lado, es necesario tener en cuenta las estructuras de estos ácidos nucleicos. En
el caso del ARN, esta cuenta con una sola hélice, por lo que no solo es más simple, sino
que cuenta con un peso molecular menor al del ADN. De esta manera, se logra explicar
la razón por la cual el ARN o RNA en algunas muestras aparece tan abajo.

4. ¿Qué significado tiene que algunas bandas sean más gruesas que otras?

Para entender mejor esta pregunta, es necesario tener claro que es la electroforesis en
gel, esta es una técnica utilizada para separar fragmentos de ADN (u otras
macromoléculas, como ARN y proteínas) por su tamaño y carga (4). La electroforesis
consiste en aplicar una corriente a través de un gel que contiene las moléculas de interés
(5).
Los geles para separar ADN suelen estar hechos
de un polisacárido llamado agarosa, que se
consigue como hojuelas secas pulverizadas.
Cuando la agarosa se calienta en una solución
amortiguadora (agua mezclada con algunas
sales) y deja enfriar, se forma un gel sólido
ligeramente blando. A nivel molecular, el gel es
una matriz de moléculas de agarosa que se
mantienen unidas por puentes de hidrógeno y que
forman pequeños poros (4).
Con base en su tamaño y carga, las moléculas se desplazarán por el gel en diferentes
direcciones o a distintas velocidades, con lo que se separan unas de otras (5). Es por ello
que en cada una de las tres vías del gel donde se cargue el DNA plasmídico, se verá tres
bandas de distinto tamaño y esta son las que corresponden a las tres formas principales
con las que migra el mismo en función a su grado de enrollamiento.
Son las formas circulares, enrollada y superen rollada que migran con menor a mayor
velocidad, respectivamente, en una electroforesis. Entonces, se recalca que si las bandas
en las muestras son gruesas, estas equivalen a una mayor numero de proteínas, por el
 contrario, si las bandas son finas equivaldrá a una menor número de proteínas.

5. ¿Qué hubiera esperado encontrar si corría un gel con su ADN recién extraído?
Existe una serie de procesos químicos y físicos que se deben realizar para que, al extraer
el ADN, este se mantenga íntegro y puro; y así, el fraccionamiento en la electroforesis
vertical sea óptimo. Existen distintos protocolos para obtener una calidad adecuada de
ADN. Existen métodos tradicionales y comerciales (más actuales); sin embargo, ambos
cumplen con una colecta de muestra y una homogeneización del tejido (mecánica o
química) (6).

Si no se realiza este procedimiento con las medidas necesarias, el ADN puede perder su
integridad y así estropear la electroforesis. La integridad se puede observar al usar la
técnica de electroforesis en gel de agarosa. Si este está en condiciones adecuadas,
observaremos una banda estrecha cerca al pozo en que se colocó la mezcla de ADN. Si
está fragmentado, observaremos una banda de más de un centímetro de ancho o también
podremos visualizar un sendero luminoso en el carril de la muestra. Cuando el ADN está
fragmentado, va a dificultar la amplificación de los productos de PCR (reacción en cadena
de la polimerasa) de alto peso molecular y va a afectar que se realicen las técnicas (6).
Figura 1. Gel de agarosa para visualizar la integridad del ADN. Carril 1 marcador de peso molecular,
carril 2 y 3 vacíos, carril 4 y 7 muestras con poca fragmentación, carril 5 muestra fragmentada y
carril 6 muestra integra.

Es por eso que no se puede correr un gel con ADN recién extraído ya que se deben realizar
una serie de procesos. Por ejemplo, en cuanto a la colecta y transporte de sangre, se debe
usar desde agujas de calibre apropiado, usar anticoagulantes, homogeneizar la muestra
para evitar la hemólisis (cuando se libera hemoglobina y se contamina e inhibe las
reacciones enzimáticas), la coagulación y la contaminación bacteriana (6).

Una vez que hemos colectado la muestra, es necesaria una homogenización de manera
que las uniones entre las células se rompan y así se facilite la interacción con las
soluciones de lisis que ayudan a liberar el material genético. En el proceso de
homogenización se usa nitrógeno líquido para congelar de inmediato la muestra y evitar
que se formen cristales en interior de la célula y así, se rompa la estructura celular y se
inicie el proceso de degradación. Otro paso importante de esta técnica, es el uso de buffers
de lisis para que se puedan desnaturalizar las proteínas y mantengan estable el ADN. En
el proceso de lisis, se usan soluciones básicas, detergentes o agentes caotrópicos que
permiten disolver la membrana celular, así como inhibidores para inactivar las enzimas que
degradan el ADN (7).
III. CONCLUSIONES

 La electroforesis en gel de agarosa es una técnica muy utilizada para separar

moléculas o fragmentos de moléculas de ácidos nucleicos.

 Sobre los resultados de la electroforesis, sabemos que si las bandas en las

muestras son gruesas, equivalen a una mayor número de proteínas, mientras que
si las bandas son finas, entonces equivaldrá a una menor número de proteínas.

 Cuando el ADN está fragmentado, va a dificultar la amplificación de los productos

de PCR de alto peso molecular y va a afectar que se realicen las técnicas logrando
así que se formen cristales en interior de la célula y se rompa la estructura celular.
IV. FUENTES DE INFORMACIÓN

1- Padilla C, Diez J, Martínez E, Bárcena J, García C. Electroforesis de ácidos nucleicos en

geles de agarosa. Aislamiento y caracterización electroforética de DNA plasmídico
[Internet]. Argentina: Departamento de Bioquímica y Biología Molecular [consultado 2021
mayo 25]. Disponible en: https://www.uco.es/dptos/bioquimica-biol-
mol/pdfs/17%20ELECTROFORESIS%20ACS%20NUCLEICOS%20GELES%20AGARO
SA.pdf
2- Expresión y regulación génica. [Internet]. Khanacademy.org. [Consultado el 25 de mayo
de 2021]. Disponible en: https://es.khanacademy.org/science/ap-biology/gene-
expression-and-regulation
3- Electroforesis de ácidos nucleicos en geles de agarosa. Aislamiento y caracterización
electroforética de DNA plasmídico. Padilla C, Diez J, Martínez E, Bárcena J, García C.
[Internet]. [Citado el 25 de mayo de 2021]. Disponible en:
https://www.uco.es/dptos/bioquimica-biol-
mol/pdfs/17%20ELECTROFORESIS%20ACS%20NUCLEICOS%20GELES%20AGARO
SA.pdf
4- Electroforesis en gel (artículo). [Internet]. Khancademy.org. [Consultado el 24 de mayo
de 2021]. Disponible en: https://es.khanacademy.org/science/ap-biology/gene-
expressionand-regulation/biotechnology/a/gel-electrophoresis
5- Electroforesis de ácidos nucleicos en geles de agarosa. Aislamiento y caracterización
electroforética de DNA plasmídico. Padilla C, Diez J, Martínez E, Bárcena J, García C.
[Internet]. [Consultado el 25 de mayo de 2021]. Disponible en:
https://www.uco.es/dptos/bioquimicabiolmol/pdfs/17%20ELECTROFORESIS%20ACS%
20NUCLEICOS% 20GELES%20AGAROSA.pdf
6- Es. Cornejo A. et al. Herramientas Moleculares Aplicadas Ecología: Aspectos teóricos y
prácticos [Internet]. 1.ª ed. Ciudad de México; 2014 [Consultado 2021 May 25]. Disponible
en:
https://www2.congreso.gob.pe/sicr/cendocbib/con4_uibd.nsf/770DBBBD5ADF75950525
7D4900580FE6/$FILE/HerramientasMolecularesAplicadasEcolog%C3%ADa.pdf
7- Ministerio de Salud. Manual de procedimientos de electroforesis para proteínas y ADN
[Internet]. 38.ª ed. Lima: Leonid Lecca; 2003 [Consultado 2021 May 25]. Disponible en:
https://bvs.ins.gob.pe/insprint/SALUD_PUBLICA/NOR_TEC/38.pdf