Laboratorio de Biología Molecular -

Programa de microbiología

Extracción y evaluación de la cantidad y calidad del ADN de

Saccharomyces cerevisiae.

María Valeria Ampudia Chaux; Leidy Vanessa Rivera Ramos; Laura Camila Rodríguez
Gallar.

Facultad de Ciencias Básicas, Microbiología, Universidad Santiago de Cali, Cali, Colombia;

maria.ampudia00@usc.edu.co; leidy.rivera05@usc.edu.co; laura.rodriguez09@usc.edu.co

Resumen

En esta sección describa de forma general las actividades desarrolladas durante la práctica
correspondiente. Un resumen debe reunir los siguientes aspectos principales: objetivos de la
práctica, resultados más relevantes, discusión y conclusiones más relevantes. No se debe
superar las 150 palabras.

Nota: es recomendable la escritura de esta sección una vez haya finalizado con el desarrollo
de los demás apartados, que se encuentran más abajo.

Palabras clave: ADN; Electroforesis; S. cerevisiae; Extracción

Abstract

Presentación del resumen escrito en inglés.

Keywords: presentación de las palabras clave escritas en inglés.

INTRODUCCIÓN
En el presente informe se encontrará el desarrollo de dos laboratorios que se realizaron en
tiempos diferentes, pero de manera complementaria, en el primero de ellos se realizo la
extracción del ADN de Saccharomyces cerevisiae, en el segundo se realizó la calidad de este.
La extracción del ADN es el punto de partida del laboratorio y de los estudios que se
necesitan para entender mejor el funcionamiento y comportamiento general de las levaduras
utilizadas a nivel industrial, esta extracción se puede realizar por medio de protocolos que
permiten tener calidad y cantidad para su posterior estudio y observación. Los métodos que
se utilizan actualmente permiten que la separación del ADN sea exitosa y que su posterior

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Gallar.

tratamiento no sea presente problemas para su trato, sin importar el método que se utilice
siempre se deben pasar 5 etapas: homogeneización del tejido, lisis celular, separación de
proteínas y lípidos y la precipitación y redisolución del ADN.
Posterior a la extracción sigue el análisis de los resultados, en este caso la evaluación de
calidad y cantidad de ADN extraído cabe resaltar, que por falta de implementos en el
laboratorio solo se realizo la evaluación de calidad del ADN extraído, más no se pudo
observar la cantidad por falta de los implementos necesarios.
La evaluación de la calidad del ADN se realizo por medio de la electroforesis en gel de
agarosa, ya que este permite separar fragmentos de ADN y ARN en función de su tamaño y
topología.
Los objetivos planteados para estos laboratorios fueron, efectuar e identificar los pasos
necesarios para la extracción de ADN de levadura, adquirir experiencia en el manejo de
equipos y reactivos relacionados con la técnica de extracción y cuantificar y determinar la
pureza extraída del ADN extraído mediante electroforesis en gel de agarosa, para el
desarrollo posterior de la reacción en cadena de la polimerasa (PCR).

MATERIALES Y METODOLOGÍA
Materiales:

Materiales.

Extracción de ADN. Electroforesis en gel de agarosa.

 1 balanza analítica.  1 balanza.

 1 micropipeta.  1 beaker 250 mL.
 1 baño María.  1 vidrio reloj, 1 micro espátula.
 1 baño de hielo.  1 probeta de 50 mL, microondas.
 5 tubos de eppendorf de 1.5 ml.  Cámara de electroforesis horizontal.
 1 gradilla para tubos eppendorf.  Fuente de poder.
 1 micropipeta de 100-1000 µL con  Cinta de enmascarar
puntas.  1 micropipeta de 0,5-10 µL con
 1 micropipeta de 10-100 µL con puntas
puntas.  Trans iluminador UV.
 1 mortero con mazo.
 1 vidrio reloj.
 1 micro espátula.

Reactivos:

Reactivos.

Extracción de ADN. Electroforesis en gel de agarosa.

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Gallar.

 1 sobre de levadura activa seca  TBE 1X.

 EDTA 0,5M.  Agarosa en polvo.
 Tris-HCL 50 mM, EDTA 20, ph 7,4.  Buffer de carga.
 SDS 10%.  Sybr Green.
 Acetato de potasio (KAc) 5 M.  Marcador de peso molecular.
 Isopropanol FRIO.  Muestra de ADN de S. cerevisiae
 Etanol 70% FRIO extraída en el anterior laboratorio.
 Agua grado biología molecular.

Metodología:
Extracción de ADN de Saccharomyces cerevisiae.
Los pasos que se explicaran a continuación fueron los realizados en el laboratorio de
extracción de ADN de S. cerevisiae, en este hay cambios en tanto a las indicaciones de la
guía debido a la poca disponibilidad de tiempo para la realización del laboratorio.
Lo primero que se realizó fue la maceración de la levadura activa seca, esto para ayudar al
acceso del ADN ya que es un poco complejo por la pared celular, al realizar la maceración se
ayuda a romper esa pared celular haciendo que el ADN quede libre junto con otros
compuestos; terminada la maceración se pasó a agregar 2mL de EDTA 0.5M que ayuda a
proteger el ADN de las nucleasas, haciendo que estas se adhieran a este y no a los ácidos
nucleicos.
El segundo paso fue la centrifugación durante 5 minutos, esto para separar otros compuestos
innecesarios para el proceso como membranas, proteínas, etc.
Se paso a eliminar el sobrenadante y agregar al precipitado obtenido 0.5mL de tris-HCL y
EDTA, el tris-HCL sirve para ajustar el PH ya que el ADN puede ser destruido por un PH
ácido y como se menciono anteriormente el EDTA para proteger el ADN.
Se añadió al compuesto 50 µL de SDS al 10% y se expuso a baño María más o menos a 65°
durante 5 minutos. El SDS actúa como agente solubilizante de proteínas de componentes de
tejidos y membranas y se expone a baño María para ayudar a la desnaturalización de estos
componentes, pues a altas temperaturas los enlaces son más inestables.
Una vez se quito saco del baño María se agregó 200 µL de acetato de potasio y se dejo en
baño de hielo, esto durante 10 min. En este paso el acetato de potasio ayuda a retirar
proteínas denaturadas y la mayoría de los polisacáridos y se pone en el hielo pues este evita
que el ADN se fragmente por el calor.
Luego del baño de hielo se centrifugo durante 2 minutos a 13.000 x, el sobrenadante que salió
de este paso se paso a otro tuvo y se volvió a centrifugar para eliminar otras impurezas, el
sobrenadante se pasó a otro tubo.
Posteriormente, se agregó 500 µL de isopropanol, este precipita el ADN pues compite por el
agua, haciendo que este se deshidrate y haciendo que el ADN se vaya al fondo, se ayuda en
este proceso de manera manual agitando suavemente, esto se hizo aproximadamente 3
minutos.

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Terminada la agitación se volvió a centrifugar, esta vez durante 5 minutos a 13.000x y se

traslado el sobrenadante a otro tubo. El siguiente paso fue la centrifugación del sobrenadante,
esto para ayudar a limpiar impurezas, el sobrenadante que salió de este último paso se separo
y el precipitado se descartó. Desde este paso de tiene ADN.
Luego, se agregó 500 µL de etanol al 70% frío, se llevo el tuvo a centrifugar durante 2
minutos a 13.000x. En este paso el etanol ayuda a conservar, precipitar y concentrar el ADN.
Este se centrifuga para finalmente tratar de separar las impurezas que aún puedan quedar.
Luego de sacar de centrifugar con mucho cuidado de no tocar lo que se observa de ADN, se
quita todo el sobrenadante y se deja secar el precipitado, en este caso por tiempo se ayudo
con toallas desechables cuidando de no tocar, ni rozar el ADN.
Lo último que se realizó en el laboratorio de extracción de ADN de S. cerevisiae fue agregar
100 µL de TRIS a lo que se logró obtener de ADN para ayudar a su conservación. Este se
conserva en -20°C hasta su próximo uso.
Evaluación de la cantidad y calidad del ADN.
Los procedimientos que se encontraran a continuación se realizaron en el segundo laboratorio
que compone este informe, por falta de materiales no se pudo realizar el protocolo completo,
solo se realizó la primera parte de este, que es la verificación de la extracción de ADN por
electroforesis en gel de agarosa al 1% p/v.
La información obtenida del laboratorio de evaluación de la cantidad y calidad del ADN
puede llegar a ser un poco imprecisa debido a la falta de oportunidad de llevar a cabo el
laboratorio de manera presencial. La información desde el paso a paso, resultados y en lo que
se basa la discusión y conclusiones relacionadas a este laboratorio se hace en base a lo
explicado y pasado por los compañeros que continuaron este laboratorio con la muestra del
laboratorio de extracción que si se pudo realizar de manera presencial.
Lo primero que se realizó fue toar 0.4 gramos de agarosa y disolverla en 40 mL de TBE 1X,
la agarosa proviene del agar y lo que hace es tener una función como de “tamiz molecular”, o
sea tiene una gran capacidad de absorción para materiales disueltos con cierto tamaño
molecular, el TBE funciona como tampón, teniendo propiedades para regular el PH,
mantenerlo estable y proteger el ADN de la degradación gracias a sus componentes.
La mezcla de agarosa y TBE se calentó hasta que se disolvió totalmente y luego se sirvió en
la cámara de electroforesis, se agregó el peine para el diseño de los pozos y se dejó
solidificar.
Posteriormente se mezcló lo siguiente:
a. Se mezcló 5 μL del ADN (muestra) +1 μL de Buffer de carga 6X+ 1 μL de Sybr
Green el buffer de carga es una disolución que se mezcla con la muestra antes de
aplicarla al gel. Sus componentes cumplen varios propósitos en electroforesis de DNA
el Sybr Green es un agente intercalante utilizado en la tinción de ADN para el análisis
por electroforesis de productos de PCR, principalmente. Esta molécula se introduce
en la estructura secundaria de la doble hélice del ADN y se acopla energéticamente a
los ácidos nucleicos que lo forman, de manera que se incrementa notablemente su tasa
de emisión fluorescente. Este fenómeno se conoce como transferencia de energía
mediante resonancia de fluorescencia.

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b. Se Añadio 1uL de marcador de peso molecular +1 μL de buffer de carga + 1 μL de

Sybr Green. El marcador peso molecular Son moléculas de ADN o de proteínas que
permiten determinar por comparación el tamaño de los fragmentos de ácidos
nucleicos o proteínas contenidos en las muestras sometidas a electroforesis.

c. Control positivo: ADN (verificado anteriormente) +1 μL buffer de carga +1 μL de Sybr

Green.
d. Control negativo: 1uL de buffer de carga + 1uL de Sybr Green.

Luego se conectó la fuente de poder y se vierte el gel de 100-110 V durante

aproximadamente 1 hora; La potencia de la fuente de poder para electroforesis está
diseñada para su uso en la separación de ADN y ARN, RFLP, fragmentación del
ADN, electroforesis preparativa Page (electroforesis en geles de poliacrilamida) y la
separación de proteínas.

Por último, se desmonto el gel y se visualizó bajo luz UV

RESULTADOS.
Extracción de ADN de S. cerevisiae.

Figura 1. Muestra de ADN extraído de S. cerevisiae.

Lo observado en la figura 1 es lo obtenido al terminar del proceso de extracción, lo que se
observa en el final del tubo de tonalidad blanca.
Evaluación de la cantidad y calidad del ADN.

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Figura 2. Resultados obtenidos en la observación en cámara de electroforesis bajo luz UV.

En la figura 2 se puede ver el ADN obtenido en la figura 1, en la electroforesis bajo luz UV,
lo que mostro la calidad de ADN que se obtuvo.

DISCUSIÓN

1. Calcular la cantidad y calidad del ADN extraído.

La cantidad y calidad del ADN no se pudo calcular debido a que el laboratorio no se pudo
llevar a cabo totalmente por falta de instrumentos.

2. Discutir acerca de la calidad de ADN, ¿Se observa contaminación y de qué tipo?

En la practica evaluación de la cantidad y calidad del ADN no la realizamos por ende con los datos
que nos compartieron a partir de la realización de electroforesis nos dan a entender que la muestra que
obtuvimos de la extracción del ADN no contiene una contaminación pronunciada, solo el tipo de
contaminación encontrada fue de proteínas, pero no se encontraron

3. ¿Cómo podría disminuirse la contaminación del ADN por proteínas y carbohidratos?

Cuando se trabaja en laboratorio todos los materiales y reactivos que se usan para la extracción
deberán estar limpios y esterilizados. Además, deben estar libres de nucleasas, con el fin de evitar la
degradación de ADN

4. ¿Qué otros métodos de cuantificación de ADN existen?

-para la cuantificación del ADN existen dos métodos indirectos que permiten estimar la concentración
del ADN en las muestras, por visualización y mediante espectrofotómetro.

 Cuantificación del ADN por visualización:

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Gallar.

Método indirecto más recomendable para la determinación de la concentración de ADN en una

muestran es mediante la visualización de un gel de electroforesis en el cual se colocan muestras con
concentraciones conocidas, se coloca cada una de las muestras que se quieren evaluar en pozos
individuales, dejando al menos unos 10 pozos libres, posteriormente se inicia la electroforesis con
6v/cm y diez minutos antes de que concluya la corrida, se detiene la fuente de poder se destapa la
cámara de electroforesis, sembrando muestras de concentración conocidas, finalmente se visualiza el
producto con U.V y se toma una fotografía.

 Cuantificación del ADN mediante espectrofotómetros:

En este método se utiliza un espectrofotómetro que mida la absorción a 260 mn y 280 nm. En un
equipo automatizado, se conecta el espectrofotómetro al menos unos 15 minutos antes de iniciar con
las lecturas
-Preparación del blanco:

Agregue 10 ml de te-rnasa (o la solución que se utilizó para re suspender el ADN de la muestra) y

990 m l de Agua dd. En una celda, asegurándose de la perfecta homogeneización, Coloque la celda en
la posición 1 del espectrofotómetro.

-Preparación de las muestras.

Agregue 10 m l de la muestra problema y 990 m l de Agua dd, en otra celda, asegurándose de la

perfecta homogeneización.

-Lectura.

Para la lectura solo se tiene que responder con el teclado del equipo las preguntas que aparecen en
pantalla. El equipo permite evaluar la concentración de proteínas (limpieza de la muestra), presencia
de ARN y concentración de oligos (ADN degradado). Es importante aclarar que la relación
A260/A280nm no es lineal, por lo que puede llevar a lecturas erróneas, recomendándose solo como
método complementario de evaluación

 Cuantificación de ADN por slot blot:

La cuantificación por Slot Blot es tal vez el método más utilizado en el ámbito forense (Butler, 2001).
Su objetivo específico es el medir la cantidad de “ADN humano”, por comparación con un patrón. La
técnica consiste en la hibridación de una sonda específica de 40 pb (pares de bases) complementaria a
la secuencia D17Z1, localizada en el cromosoma 17 es muy certero ya que puede detectar ADN
humano de cadena simple y doble. Además, permite la cuantificación de varias muestras al mismo
tiempo.

5. ¿Qué es el NanoDrop y en qué consiste?

Es un espectrofotómetro UV-VIS de barrido espectral que mida la variación de la absorbancia
con la longitud de onda empleando solo una micro-gota y opcionalmente en cubeta, Permite
la medición rápida, fiable y reproducible de pureza de DNA, RNA y proteínas en volúmenes

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de micro litro, mostrando todo el espectro para detectar impurezas. No necesita diluciones de
las muestras para su correcta medición. Se ajusta de forma automática para muestras de bajas
y alta concentraciones en la misma medición, de modo que cualquier muestra desconocida
caiga siempre dentro del rango de medida. El pedestal es altamente hidrológico para prevenir
la contaminación cruzada y facilitar la limpieza inter-lectura. Compatible con la mayoría de
los solventes utilizados en los laboratorios de Biología Molecular, Celular y Bioquímica.

Realice la interpretación, análisis y explicación de los resultados obtenidos durante la fase

experimental. Es importante que se centre en conocer la causa y connotación de los
resultados que se hayan generado. Debe tener en cuenta que la discusión de resultados es una
parte fundamental y decisiva de su informe de laboratorio; por lo tanto, es crucial que usted
lleve a cabo una búsqueda y presentación de información adecuada, siempre de acuerdo con
lo establecido en la literatura, ya que una discusión NO se elabora a partir de conocimiento
empírico.
Dado el caso de presentar errores en sus resultados, realice una justificación de ¿cuál? fue la
posible causa de estos.

CONCLUSIONES

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Gallar.

Corresponde a la última parte del estudio, en donde usted determina el nuevo conocimiento
generado como consecuencia del desarrollo del laboratorio, esto mediante la interpretación de
todo lo recolectado y la posterior identificación de hallazgos.

Es una sección corta que establece el punto de finalización de todos los datos y argumentos
que anteriormente haya presentado.

BIBLIOGRAFÍA

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