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UNIVERSIDAD NACIONAL AUTNOMA DE MXICO

FACULTAD DE ESTUDIOS SUPERIORES CUAUTITLN


DEPARTAMENTO DE CIENCIAS BIOLGICAS
SECCIN DE BIOQUMICA Y FARMACOLOGA HUMANA
BIOQUMICA DIAGNSTICA
LABORATORIO DE GENTICA MOLECULAR
GRUPO: 1602 SEMESTRE: 2017-I
EQUIPO 3: LUNA BENTEZ MAX; ROSALES BOLAOS FRANCISCO ENRIQUE
PROFESORAS: BQD LARISSA ANDREA GONZLEZ SALCEDO; BQD NGELES LPEZ CABRERA
ENTREGA 7-OCTUBRE-2016

INFORME DE LA PRCTICA
EXTRACCIN, CUANTIFICACIN Y ELECTROFORESIS DE DNA
RESUMEN
Uno de los ms importantes aportes a la biologa ha sido el reconocimiento del DNA como la molcula de la vida. Para
su estudio y la aplicacin de tcnicas moleculares es necesario la extraccin de DNA ntegro y puro. La extraccin
consiste en el aislamiento y purificacin de molculas de DNA y se basa en las caractersticas fisicoqumicas de la
molcula. Una vez obtenido el material gentico, es importante determinar el rendimiento mediante espectrofotometra,
ya que una caracterstica del DNA es que absorbe la luz ultravioleta (UV) a 260 nm, lo que permite estimar su
concentracin. Adems de conocer la cantidad y calidad del DNA por espectrofotometra, es importante conocer si el
DNA obtenido est integro, lo cual se puede observar mediante electroforesis en gel de agarosa, debido a las bandas
que se forman. Los objetivos de la prctica son cuantificar DNA extrado por 2 diferentes mtodos (por perclorato de
sodio y por fenol-cloroformo) mediante espectrofotometra, as como evaluar la pureza e integridad del DNA por
electroforesis, para comparar los resultados obtenidos por ambos mtodos. Los resultados obtenidos por el mtodo de
perclorato de sodio fueron: relacin 260/280 = 1.577, concentracin = 22.371 ng/L, bandas difusas; mientras que por el
mtodo de fenol-cloroformo fueron: relacin 260/280 = 1.92, concentracin = 1342.28 ng/L, bandas muy difusas. Como
conclusiones, se logr extraer DNA humano por los mtodos de perclorato de sodio y de fenol-cloroformo, siendo que por
el mtodo de perclorato de sodio se obtuvo menor cantidad de DNA y contaminado, en contraste al mtodo de fenolcloroformo, con el cual se obtuvo mayor cantidad de DNA y alta pureza; y al no evaluarse la integridad de ambas
muestras por fallas en la electroforesis, se concluye que el mtodo ms eficaz es el de fenol-cloroformo.
Palabras clave: Nucletidos, espectrofotometra, absorbancia, densidad ptica, electroforesis.
SUMMARY
One of the most important contributions to biology has been the recognition of DNA as "the molecule of life". For their
study and application of molecular techniques is necessary the extraction of DNA full and pure. The extraction involves the
isolation and purification of DNA molecules and is based on the physicochemical characteristics of the molecule. After
obtaining the genetic material, it is important to determine the performance by spectrophotometry, as a feature of DNA is
that it absorbs ultraviolet (UV) at 260 nm, which allows estimation of their concentration. Besides knowing the quantity and
quality of DNA by spectrophotometry, it is important to know if the DNA obtained is integral, which can be observed by
agarose gel electrophoresis, because the bands are formed. The objectives of the practice are quantified DNA extracted
by 2 different methods (sodium perchlorate and phenol-chloroform) by spectrophotometry, and to assess the purity and
the integrity of the DNA by electrophoresis, to compare the results obtained by both methods. The results obtained by the
method of perchlorate were: ratio 260/280 = 1.577, concentration = 22.371 ng/L, diffuse bands; while by the phenolchloroform method they were: 260/280 ratio = 1.92, concentration = 1342.28 ng/L, very diffuse bands. In conclusion, it
was possible to extract human DNA by the methods of sodium perchlorate and phenol-chloroform, being that by the
method of sodium perchlorate less DNA and contaminated was obtained, in contrast to the method of phenol-chloroform,
the which greater amount of DNA and high purity was obtained; because the integrity of both samples evaluated by
electrophoresis failures, it is concluded that the most effective method is phenol-chloroform.
Keywords: Nucleotides, spectrophotometry, absorbance, optical density, electrophoresis.

INTRODUCCIN
Uno de los ms importantes aportes a la biologa ha sido
el reconocimiento del DNA como la molcula de la
vida. Para el estudio de DNA existen diferentes
muestras que pueden ser obtenidas y analizadas de un
paciente; sangre, semen, saliva, cabello, hueso, diente o
tejido, la forma ms rpida y fcil de obtener es la
sangre. La sangre est compuesta por clulas y restos
celulares en una solucin acuosa: el plasma. Dentro de
las clulas, estn los eritrocitos, leucocitos y plaquetas,
de las cuales, los leucocitos son las nicas clulas
nucleadas que se presentan como granulocitos,
monocitos y linfocitos, y, por lo tanto, las nicas de las
que se puede obtener DNA por la presencia de este
ncleo. (Koolman y Rhm, 2005)
Debido a que en el DNA se encuentran cifradas las
instrucciones que definen las caractersticas propias de
cada organismo, diversas tecnologas y sistemas de
anlisis se han desarrollado para la caracterizacin de
esta molcula. La aplicacin de tcnicas moleculares
inicia con la extraccin de DNA y la obtencin exitosa de
datos confiables y reproducibles depende, en gran
medida, de la extraccin de DNA ntegro y puro (Rocha,
2009).
El DNA est constituido por dos cadenas de nucletidos
unidas entre s formando una doble hlice. Los
nucletidos estn
integrados por un
azcar
(desoxirribosa), un grupo fosfato y una base nitrogenada
(adenina, guanina, timina o citosina). La unin de los
nucletidos ocurre entre el grupo fosfato y el azcar,
mediante enlaces fosfodister, dando lugar al esqueleto
de la molcula. Las bases de cadenas opuestas se unen
mediante puentes de hidrgeno y mantienen estable la
estructura helicoidal. Los grupos fosfato estn cargados
negativamente y son polares, lo que le confiere al DNA
una carga neta negativa y lo hace altamente polar
(Rocha, 2009).
La extraccin consiste en el aislamiento y purificacin de
molculas de DNA y se basa en las caractersticas
fisicoqumicas de la molcula. Los mtodos tradicionales
de extraccin utilizan solventes orgnicos para separar a
las protenas del DNA y, una vez suspendido en la fase
acuosa, aislarlo por precipitacin con etanol. En general,
la extraccin consiste de cinco etapas principales:
homogeneizacin del tejido, lisis celular, separacin de
protenas y lpidos, precipitacin y redisolucin del DNA
(Alejos, 2014).
Los mtodos de extraccin del DNA ms utilizados son
por perclorato (Salting Out) y por fenol-cloroformo. El
mtodo por perclorato de amonio o sodio a altas
concentraciones se fundamenta en el cambio de
solubilidad que experimentan las protenas cuando son
sometidas a modificaciones en la concentracin salina,
inicia con una lisis celular con un detergente aninico
que solubiliza los componentes celulares e inhibe la
accin de las nucleasas intracelulares, a continuacin se
desnaturalizan y se eliminan las protenas por

precipitacin salina, por ltimo el DNA en solucin se


precipita con isopropanol y se lava con etanol para
finalmente ser resuspendido en un tampn estabilizante
para DNA. El segundo mtodo permite la purificacin de
DNA mediante la adicin de fenol y cloroformo lo que da
lugar a la aparicin de 2 fases: una fase acuosa superior
que contiene los cidos nucleicos y una fase orgnica
que contiene las protenas disueltas en el fenol y los
lpidos disueltos en el cloroformo, posteriormente se
precipita el DNA de la fase acuosa con isopropanol o
etanol absoluto y se lava con etanol al 70% para
eliminar sales y pequeas molculas orgnicas que
podran an estar presentes en la muestra, se emplea
alcohol isoamlico para cambiar la constante dielctrica
del medio , por ltimo el DNA se resuspende en un
tampn apropiado ().
Una vez obtenido el material gentico, es importante
determinar el rendimiento mediante espectrofotometra.
La ley de Beer-Lambert indica que la concentracin de
una molcula en solucin depende de la cantidad de luz
absorbida de las molculas disueltas. Una caracterstica
del DNA es que absorbe la luz ultravioleta (UV) a 260
nm, con lo cual se puede estimar su concentracin.
Cuando la longitud de la celda en que se disuelve el
DNA, es de 1 cm, la absorbancia es igual a la densidad
ptica (DO). En el caso de DNA genmico o de doble
cadena, una densidad ptica equivale a 50 g/ml
(Alejos, 2014).
Adems de conocer la cantidad y calidad del DNA por
espectrofotometra, es importante conocer si el DNA
obtenido est integro. La integridad del DNA se puede
observar mediante electroforesis en gel de agarosa. Si
el DNA est integro, se debe observar una banda
estrecha cercana al pozo en que se coloc la mezcla de
DNA. Si est fragmentado, se observar una banda de
ms de 1 cm de ancho o un sendero luminoso en el
carril de la muestra. El DNA fragmentado dificulta y
afecta la reproducibilidad de las tcnicas moleculares
(Alejos, 2014).
METODOLOGA
Se siguieron las metodologas para las prcticas 2, 3, 4
y 5 del manual de prcticas de gentica molecular de la
FES Cuautitln, pginas 23-24, 29-30, 35, 41-42.
RESULTADOS
Tabla 1. Resultados
espectrofotomtricas.

de

las

determinaciones

Mtodo de
extraccin

Lectura
260 nm

Lectura
280 nm

Relacin
260/280

Concentracin
DNA (ng/L)

Perclorato

0.022

0.014

1.577

22.371 ng/L

FenolCloroformo

1.342

0.699

1.92

1342.28 ng/L

Grfica 1. Se muestra una grfica de barras comparativa de las


concentraciones de DNA obtenidas por espectrofotometra Epoch de
los mtodos de extraccin por Perclorato de sodio y por FenolCloroformo. Se puede observar que por el mtodo de FenolCloroformo se obtuvo una mayor cantidad de DNA con respecto al
mtodo
de
Perclorato
de
sodio.

Imagen 1. Electroforesis de DNA extrado por perclorato


de sodio y por fenol-cloroformo.

DISCUSIN DE RESULTADOS
La pureza de la muestra est relacionada con el valor de
mxima absorbancia de los cidos nucleicos detectada
a una longitud de onda de 260 nm, la relacin de
absorbancia a 260 nm y 280 nm se utiliza para evaluar
la pureza de ADN, una proporcin de 1.7-1.9 es
generalmente aceptada como DNA puro (Alejos, 2014).
En el caso de la extraccin por perclorato se obtuvo una
proporcin de 1.577 mientras que en la extraccin por
fenol-cloroformo se obtuvo 1.92. Estas relaciones
indican que por el mtodo de perclorato se obtuvo un
DNA impuro lo cual se puede deber a la presencia de
protena, fenol u otros contaminantes que absorben
fuertemente en o cerca de 280 nm. Mientras que por el
mtodo de fenol-cloroformo el DNA obtenido fue casi
puro, con alguna leve presencia de contaminantes, pero
en muy poca cantidad. Tambin es necesario considerar
que ambas muestras de sangre se encontraban
lipmicas, por lo cual los lpidos pudieron participar en la
contaminacin por el mtodo de perclorato, mientras
que esto no ocurre en el mtodo de fenol-cloroformo ya
que el cloroformo se encarga de disolver a los lpidos
(Riera, 2010).

Por lo que la extraccin de DNA por el mtodo de


perclorato de sodio al basarse en la reduccin de
solubilidad del DNA por efecto de las sales y aumento
de las interacciones hidrofbicas (cargas negativas tanto
de DNA como de protenas), lo que reduce las
interacciones polares del DNA con el disolvente y
favorece las interacciones hidrofbicas entre las
protenas y el DNA, causando finalmente su
precipitacin, permite cuantificar mayor cantidad de
DNA, y favorece que el DNA obtenido no se encuentre
contaminado por la utilizacin de otros solventes
orgnicos, pero si por protenas que le restara pureza,
como en este caso. Mientras que por el mtodo de
fenol-cloroformo es mejor en base a la calidad que se
obtiene, pero no as en la concentracin, ya que como el
fenol elimina las protenas asociadas al DNA, y la mayor
parte del DNA genmico se encuentra unido a histonas
(protenas) se puede arrastrar algo de este al momento
de realizar la extraccin con este mtodo, aunque en
este caso no existi ni contaminacin por fenol o por
cloroformo, y la cantidad extrada de DNA fue bastante
(Sepp, 2004).
Con la finalidad de verificar la integridad del DNA
extrado, as como el tamao de distintos fragmentos de
DNA, se realiz electroforesis en gel de agarosa. La
electroforesis consiste en la separacin de molculas
(protenas, isoenzimas, cidos nucleicos) a travs de
una matriz tamponada, agarosa en este caso, la cual
funciona como un filtro separando las molculas en un
campo elctrico, de acuerdo al tamao y la carga neta
que poseen. Las bandas se logran observar gracias a la
tincin con GelRed, colorante fluorescente no txico,
que acta mediante insercin entre las pares de bases
que conforman el cido nucleico, permitiendo la
fluorescencia bajo luz UV (Fierro, 2014).
La resolucin y velocidad de separacin de fragmentos
de DNA por electroforesis son reguladas a travs de la
concentracin de agarosa en el gel y el voltaje aplicado
durante la electroforesis (Fierro, 2014). En esta prctica
se utiliz agarosa al 0.8% y la electroforesis fue a 100
volts durante 30 minutos. Se puede observar que para el
caso del mtodo. Sin embargo, debido a la
contaminacin y a la perforacin del gel de agarosa
(respectivamente), las bandas resultantes no tenan
resolucin, por lo cual la electroforesis fall y no se
puede evaluar la integridad del DNA obtenido.
Hay que considerar que al aumentar la concentracin de
agarosa se dificulta el movimiento de los fragmentos a lo
largo del gel, permitiendo una mayor resolucin en los
fragmentos de menor longitud. Por otro lado, el
incremento del voltaje aumenta proporcionalmente la
velocidad de migracin de los fragmentos en el gel
(Fierro, 2014).
La tcnica para la cuantificacin de ADN en la
electroforesis consiste simplemente en la utilizacin de
una secuencia de concentraciones de solucin patrn de
ADN (marcador de peso molecular) con la que se
comparan muestras de ADN de concentracin

desconocida (Fierro, 2014). Sin embargo, como las


bandas por ambos mtodos no estaban bien definidas, o
nada definidas, no se pudo realizar la comparacin con
el marcador de peso molecular.
CONCLUSIONES
Se logr extraer DNA de dos muestras de sangre
humana por los mtodos de perclorato y de fenolcloroformo. En cuanto a la cuantificacin del DNA por
espectrofotometra, el mtodo de fenol-cloroformo
obtuvo una mayor concentracin de DNA, as como
tambin una mejor calidad del mismo en base a la
relacin 260/280, esto en comparacin con el mtodo de
perclorato de sodio.
Por lo que, comparando los resultados obtenidos se
observ que por el mtodo por perclorato es sencillo
trabajar y extraer el DNA, slo que en ocasiones se
puede extraer una menor cantidad de DNA o estar
contaminado por protenas si no se agregan las sales
como es debido. Mientras que por el mtodo de
cloroformo es posible extraer mayor cantidad de DNA,
pero el riesgo de contaminacin por fenol o por
cloroformo aumenta si no se realiza correctamente la
extraccin. Una mejor tcnica en la electroforesis
hubiera ayudado a corroborar la integridad del DNA por
ambos mtodos, pero al no tomarse en cuenta, se
concluye que el mtodo ms eficaz es el de fenolcloroformo.

REFERENCIAS BIBLIOGRFICAS
Alejos, L. (2014). Extraccin y purificacin de DNA.
Herramientas moleculares aplicadas en ecologa:
aspectos tericos y prcticos (Compilado). Mxico:
SEMARNAT. Pgs. 1-3.
Fierro, F. (2014). Electroforesis de DNA. Herramientas
moleculares aplicadas en ecologa: aspectos tericos y
prcticos (Compilado). Mxico: SEMARNAT. Pgs. 2729.
Koolman, J. & Rhm, K. (2005). Bioqumica: texto y
atlas. (3 ed.). Espaa: Mdica Panamericana. Pg. 274.
Riera, M. (2010). Protocolo de extraccin de DNA por
salting-out para pequeos volmenes de sangre.
Revista de Ciencia y Tecnologa; 12(14): 4-7 pp.
Rocha, P. (2009). Teora y prctica para la extraccin y
purificacin del ADN de palma de aceite. Palmas; 23(3):
9-17 pp.
Sepp, R. (2004). Rapid techniques for DNA extraction
from routinely processed archival tissue for use in PCR.
J Clin Pathol; 47(4): 318-323 pp.