3.2.5.

Métodos de análisis

3.2.5.1. Viscosidad: Se utilizó el viscosímetro de Brookfield con el husillo o spindle N° 1, a una

velocidad de 100 rpm y un volumen de muestra de 500 mL a 20 ± 1°C. La medida de viscosidad se
reportó en mPa.s (Huezo, 2008).

3.2.5.2. Acidez titulable: Se determinó por titulación con solución de NaOH (0.1 N), usando
indicador fenolftaleína. Los resultados se expresaron en g de ácido cítrico/100 mL de líquido o
porcentaje (%) de ácido cítrico (Carreiro, 2013).

3.2.5.3. Color: Las muestras se midieron utilizando un colorímetro Kónica-Minolta, acoplado con un
adaptador de muestra líquida. Se determinaron los valores de L*, a* y b*, repostándose el promedio
de 3 mediciones (Domínguez y otros, 2011).

3.2.5.4. Contenido de fenoles totales: Se utilizó el método colorimétrico de Folin-Ciocalteu. En un

tubo de ensayo se adicionaron 50 μL de la bebida, 425 μL de agua destilada y 125 μL del reactivo
Folin-Ciocalteu. Se agito y luego se dejó en reposo por 6 min. Posteriormente, se adiciono 400 μL de
carbonato de sodio al 7.1%. Después de reposar 1 h en la oscuridad, se dio lectura a la absorbancia a
760 nm. Se construyó previamente una curva estándar usando como patrón el ácido gálico. Los
resultados se expresaron como mg de ácido gálico/100 mL solución (Carreiro, 2013).

IV. RESULTADOS Y DISCUSIÓN

4.1. Viscosidad aparente

En la Figura 5, se presenta la viscosidad aparente de una bebida funcional a base de piña y

maracuyá. Se observa que a mayor concentración de extracto de hojas de moringa la viscosidad
aparente ascendió ligeramente, pero la tendencia fue más notoria con el incremento de la adición
de semillas de chía; los valores aumentaron de 0.028 a 0.039 Pa.s.

Figura 5. Viscosidad aparente de una bebida funcional a base de piña y maracuyá con extracto de
hojas de moringa y la adición de chía

Alvarado (2015) encontró que la viscosidad incrementó a mayor cantidad de chía (adición de 1.25 –
1.60%) en su bebida funcional a base de naranja con extracto de apio, los valores reportados
ascendieron de 0.00421 hasta 0.0142 Pa.s. Además, señaló que la concentración de apio tuvo un
efecto mínimo en la viscosidad. Estos resultados son similares a los de esta investigación en cuanto a
la influencia que presentó el extracto de moringa y adición de semillas de chía en la bebida
funcional.

El mucílago presente en la chía causó un notable aumento de la viscosidad en solución acuosa,

relación directa con la adición de semillas, esto debido al volumen ocupado por las cadenas del
polisacárido de alto peso molecular y la interacción de las mismas, cuando se solubilizan y dispersan
(Yaseen y otros, 2005).

En el Cuadro 9, se presenta la prueba de Levene para la viscosidad aparente en la bebida funcional,

donde existió homogeneidad de varianza (p>0.05), por lo que se procedió a realizar el análisis de
varianza y posteriormente la prueba de Duncan para determinar el mejor tratamiento.

Cuadro 9. Prueba de Levene modificada para viscosidad aparente de una bebida funcional con
extracto de hojas de moringa y la adición de chía

4.2. Acidez titulable

En la Figura 6, se presenta los resultados de acidez titulable de una bebida funcional a base de piña y
maracuyá. Se observa que a mayor concentración de extracto de moringa la acidez titulable
disminuyó, siendo más notoria esta tendencia con una mayor adición de semillas de chía, los valores
decrecieron de 0.762 a 0.662% de ácido cítrico.

Figura 6. Acidez titulable de una bebida funcional con extracto de hojas de moringa y la adición de
chía

López (2015) reportó valores de acidez titulable de 0.56, 0.55 y 0.54% de ácido cítrico en sus bebidas
funcionales a base de maracuyá con extracto de moringa, para sus proporciones de 1:2, 1:5 y 1:8;
respectivamente, denotando un comportamiento similar a los resultados de esta investigación.
Narváez (2015) reportó que la acidez titulable fue disminuyendo de 0.628%, 0.574% y 0.518% en las
bebidas a base de maracuyá y piña a medida que aumentó la adición de semillas de chía (0, 1 y 2%);
mostrando resultados similares a esta investigación.

Considerando que el pH de jugo de maracuyá es cercano a 2.96; el de piña, 4.16 (Ruilova y otros,
2018), que el extracto de hojas de moringa presenta un pH de 5.6 (López, 2015); y el de semillas de
chía un pH entre 6 y 6.5 (Alvarado, 2015); en base a lo anteriormente mencionado se puede explicar
porque la acidez disminuyó en la bebida funcional a medida que incrementó la concentración de
extracto de hojas de moringa y la adición de semillas de chía.

4.4. Compuestos fenólicos

La Figura 10 muestra el contenido de compuestos fenólicos en las bebidas funcionales, donde se

observa que a mayor concentración de extracto de moringa y en menor grado la adición de semillas
de chía; esta variable fue incrementando en todos los tratamientos, presentándose los valores de
26.92 a 36.38 mg AG/100 mL

Figura 10. Contenido de compuestos fenólicos en una bebida funcional con extracto de hojas de
moringa y adición de semillas de chía

López (2015) determinó taninos y fenoles como compuestos fenólicos en la bebida de maracuyá con
extracto de moringa, este último como fuente principal de estos componentes, indicó que la
proporción 1:8 (jugo maracuyá: extracto de hojas de moringa), el contenido de compuestos fenólicos
totales fue de 13.95 mg AG/100 mL, presentando un valor de actividad antioxidante expresada como
IC50 del 42.4% de inhibición, muy cercano al IC50 del 44 % de inhibición del ácido ascórbico.

Los estudios de Gopalakrishman y otros (2016) discuten sobre la aplicación médica e importancia
nutritiva en la cual detallan las propiedades de Moringa Oleifera, destacando la presencia en las
hojas de ciertos fitoquímicos como taninos, esteroles, compuestos fenólicos, flavonoides, entre
otros. Es decir, el extracto de las hojas de moringa, contendría estos compuestos, así como, una
mayor concentración de este extracto, implicaría un incremento en el contenido de los fitoquímicos
como potenciador de las propiedades funcionales de la bebida de frutas.
Coz-Bolaños y otros (2018) reportaron valores de 24.3 – 29.2 mg AG/100 mL en infusión de hojas de
moringa.

Las semillas de chía pueden contener hasta 194.06 mg AG/100g de compuestos fenólicos en su
composición, mediante una extracción metanólica asistida con ultrasonido (Corona-Jiménez y otros,
2016).

En el Cuadro 20 se presenta la prueba de Levene para el contenido de compuestos fenólicos en la

bebida funcional, donde existió homogeneidad de varianza (p>0.05), por lo que se procedió a
realizar el análisis de varianza y posteriormente la prueba de Duncan para determinar el mejor
tratamiento.

file:///C:/Users/HP/Desktop/
RE_ALI_CARLOS.FLORES_CONCENTRACION.EXTRACTO.MORINGA.CHIA_DATOS.pdf

2.5. COMPUESTOS FENÓLICOS

Los compuestos fenólicos se caracterizan por ser uno de los grupos de compuestos presentes en el
reino vegetal, siendo parte importante de la dieta, tanto humana como animal. Constituyen un
amplio grupo de sustancias químicas, consideradas metabolitos secundarios de las plantas.
Actualmente se ha despertado gran interés por estos compuestos debido a sus propiedades
antioxidantes y sus posibles implicaciones beneficiosas en la salud humana tales como el
tratamiento y prevención del cáncer, entre otros (Martinez & Valverde, 2000).

La forma más frecuente de encontrar los compuestos fenólicos en los vegetales es en forma de
monómeros, oligomeros y polímeros (Andaray, 1997; citado por Calsin, 2007) Los fenoles protegen a
las plantas contra los daños oxidativos y llevan a cabo la misma función en el organismo humano,
actúa como metabolito esencial para el crecimiento y reproducción de las plantas, dar pigmentación
a las flores y frutos y favorecer la producción modular. Además, actúan como agentes protectoras
frente a la acción de patógenos, radiación UV y enfermedades, siendo secretados en estos casos
como mecanismos de defensa (Bimis, 2001, citado por de la Riva, 2010).

2.5.1. Clasificación de Compuestos Fenólicos.

a. No Flavonoides

Los no flavonoides se subdividen en compuestos como los ácidos fenólicos, estilbenos y taninos
hidrosolubles, los ácidos fenólicos distinguen dos familias distintas, la serie benzoica y la serie
cinámica que se pueden encontrar en forma libre o esterificada con azucares. La actividad
antioxidante de los ácidos fenólicos se debe también a los hidrógenos fenólicos, la posición de los
grupos hidroxilo y el grado de hidroxilacion se determina en gran medida la actividad antioxidante, la
presencia de un segundo grupo hidroxilo aumenta la capacidad antioxidante (Garcia, 2005).

b. Flavonoides

Se han descrito más de 4000 flavonoides (C6-C3-C6) diferentes que se clasifican en varias familias
según cambios en su estructura básica. Son compuestos polifenolicos tanto de bajo como de elevado
peso molecular que comparten el esqueleto común de difenil piranos: dos anillos benceno unidos a
través de un anillo pirona o pirano heterocíclico, que pueden poseer varios grupos hidroxilo (OH)
unidos a esta estructura de anillos (Garcia, 2005).
Los flavonoides es el grupo más ampliamente distribuido (flavonoles, flavonas, isoflavonas,
flavanonas, antocianinas y flavanonas) (Pokorny, Yanishlieva, & Gordon, 1995) estos son
constituyentes naturales de los alimentos vegetales y proporcionan, en gran medida, el flavor, color
y textura de estos alimentos. Los flavonoides más abundantes en los vegetales son los flavonoles y
las flavonas (un subgrupo de flavonoles) y los glucosidos de ambos. Los flavonoles poseen una
coloración amarillenta, estos compuestos pueden ser identificados claramente por la existencia de
un grupo carbonilo en C4. Según el grado de oxidación de la molécula pueden distinguirse diferentes
tipos de compuestos.

Los compuestos fenólicos o polifenoles provienen del metabolismo secundario de las plantas. Existe
una gran variedad de compuestos fenólicos, y se clasifican en flavonoides y no flavonoides (Estrella,
2010).

Los flavonoides contienen en su estructura química un número variable de grupos hidroxilo,

fenólicos y excelentes propiedades de quelación del hierro y otros metales de transición, lo que les
confiere una gran capacidad antioxidante (Espin, Tomas, & Barberan, 2005).

La mayoría de los flavonoides se caracterizan por ser hidrosolubles y estables al calor. Son
susceptibles a los cambios químicos (maduración de las frutas), a los físicos en el procesamiento de
los alimentos: picado y trituración (estos forman parte de la organización tisular y de estructuras,
que al romperse se lixivian y se destruyen parcialmente en contacto con el aire), y a los cambios
térmicos, ya que el calor excesivo altera los pigmentos de los alimentos. Son sensibles al pH,
tendiendo hacia un amarillo intenso en medio alcalino (Potter & Hotchkiss, 1995).

Las proantocianidinas o taninos condensados (que son polímeros formados por unidades de
antocianidina (flavonoide) y que han sido hidrolizados), han demostrado ser efectivos antioxidantes
con actividad aún mayor que los fenoles simples (Boateng, Verghese, Walker, & Ogutu, 2008).

3.4.4.2. Determinación de compuestos fenólicos

Para determinar los compuestos fenólicos se utilizó el método espectrofotométrico propuesto por
(Singleton, Orthofer, & Rosa, 1966), el cual se basa en la cuantificación espectrofotométrica del
complejo coloreado formado por la reacción entre los compuestos fenólicos y el reactivo Folin-
Cicocalteau. El procedimiento es el siguiente:

Se preparan soluciones de carbonato de sodio y de Folin-Cicocalteau.

Para cuantificar los compuestos fenólicos totales se depositaron en tubos de prueba de 500μl de los
extractos obtenidos, a ello se le añadió 250μl del reactivo folin-Cicocalteau 1N y se adicionó 1250μl
de la solución de carbonato de sodio se homogenizó el conjunto y se dejó reposar durante 30
minutos a temperatura ambiente, luego se hizo la lectura a la longitud de onda de 755nm.
Paralelamente se preparó un blanco con etanol en lugar extracto y se trabajó bajo las mismas
condiciones, el blanco servirá para llevar a cero el espectrofotómetro.

Se determinó la concentración del ácido gálico a 725nm usando una curva estándar. Los resultados
se expresaron como mg acido gálico/100g de bebida.

La ecuación para la cuantificación de compuestos fenólicos es la siguiente:

𝑌 = 0.0345 𝑥 Abs + 0.0018

Dónde:

Y = contenido en ml de ácido gálico/ml

El contenido de compuestos fenólicos totales se calculó con la siguiente ecuación:

Mg ácidogálico/100ml = ((0.0345 x Abs) – 0.0018) x Fd x A x 100

Dónde:

Abs = absorbancia de la muestra medidas a 755nm

Fd = Factor de dilución

A = (Volumen (ml) de solvente utilizado + Peso de la muestra (g))/Peso de la muestra (g).

Ccasa_Mamani_Julieta_Rosalía_Castillo_Tacora_Roxana.pdf

1.8.1. Fenoles totales: Método de Folin Ciocalteu

Los compuestos fenólicos son un grupo de sustancias que poseen un anillo aromático con uno o más
sustituyentes hidroxilos, son relativamente polares y tienden a ser solubles en agua, muestran
inmensa absorción en la región ultravioleta del espectro. En la naturaleza existe una amplia variedad
de compuestos que presentan una estructura molecular caracterizada por la presencia de uno o
varios anillos fenólicos, indispensables para las funciones fisiológicas vegetales y en las funciones de
defensa frente al estrés. (Quiñonez, 2012)

Los fenoles están asociados al desarrollo del color, generan características sensoriales entre las de
dureza, sabor y la astringencia, suelen presentar características nutritivas y desarrollar propiedades
antioxidantes que se encuentran en los alimentos de origen vegetal. (Robbins, 2013)

Los polifenoles poseen acciones molusquicidas además de antiinflamatorias, antivirales,

antidiarreicas, antialérgicas y vasodilatadores. Los antioxidantes de los fenoles y su desarrollo han
generado el origen de distintas funciones biológicas como las de antienvejecimiento y
anticancerígenas, en forma particular exhiben una gran gama de efectos biológicos dentro de los
cuales está incluida la actividad bacteriana, antiinflamatoria, actividad antioxidante, antialérgica y
vasodilatadora. (Paladino, 2011)

El ensayo Folin Ciocalteu, es usado para medir el contenido de fenoles totales en productos
vegetales por el carácter reductor del reactivo. Los compuestos fenólicos reaccionan con una mezcla
de ácidos fosfowolfrámico y fosfomolíbdíco en medio básico, dando lugar a una coloración azul
susceptible a ser medida espectrofotométricamente a 725 nm. (Olaya y Restrepo, 2011)

Es un método preciso y sensible, que puede sufrir diversas variaciones, relacionadas principalmente
a los volúmenes utilizados de la muestra, la concentración de los reactivos y el tiempo de reacción.
Los resultados se expresan en mg GAE por 100 g de pulpa de frutos. (García et al., 2015)
Figura 4: Oxidación de las forma fenólica por la acción del reactivo FolinCiocalteu

(Fuente: Diez de la Inglesa, 2018).

En el diagrama de flujo 2, se muestra la metodología empleada para el análisis de fenoles totales en

fruto maduro, liofilizado y mermelada.

Diagrama de flujo 2: Metodología de análisis de la variabilidad del contenido fenólico en el fruto

Prunus serotina – Cerezo

(Fuente: elaboración propia).

2.10.2. Contenido de Fenoles totales: Método Folin Ciocalteu

Fundamento

El ácido fosfomolibdotúngstico (formado por ambas sales en medio ácido), de color amarillo al ser
reducido por los grupos fenólicos da lugar a un complejo de color azul, cuya intensidad es la que se
mide para evaluar el contenido de fenoles totales, como se muestra en la figura 8.
2.10.3. Procedimiento

Cruzado, et al. (2013) describió la siguiente metodología para la determinación de fenoles adaptada
para el fruto Prunus serotina (Cerezo):

a) Se realizó la extracción a partir de 2,5 gramos de muestra con 12,5 mL de etanol al 50 % v/v en
reposo por 72 horas (3 repeticiones). El sobrenadante obtenido de cada repetición se llevará a un
volumen final de 50 mL y se utilizará para las determinaciones del contenido de fenoles totales y
para la medición de su actividad antioxidante.

b) El contenido de fenoles se cuantificó por el método de Folin Ciocalteu preparando una curva de
calibración usando como patrón el ácido gálico en un rango de concentración de 50 a 300 ppm.

c) Posteriormente para realizar la medición se adicionaron 1 000 µL de reactivo de Folin Ciocalteu al

10 % v/v y 1 000 µL de Na2CO3 al 7,5 % en tubos de ensayo y se completará con agua hasta volumen
de 2 100 µL.

d) Luego de agregarle el reactivo Folin dejar en reposo durante 15 minutos a temperatura ambiente
(20 °C) en la oscuridad, pasado el tiempo de reposo se le añadirá el Na2CO3 y se llevará a baño
María a 45 °C durante 15 minutos seguidamente se harán las lecturas de absorbancia a 725 nm.

Del extracto etanólico que se obtuvo a partir de 2,5 g de muestra, se tomó los mismos volúmenes y
condiciones descritas con anterioridad con 100 µl del extracto de la muestra. La muestra control se
utilizó bajo las mismas condiciones, pero con 100 µL de agua destilada. Los resultados se expresaron
como mg equivalentes de ácido gálico por cada 100 g de fruto maduro, liofilizado y mermelada.

Los extractos etanólicos se prepararon a partir de 2,5745 g de muestra de fruto maduro; 2,5878
liofilizado y 2,5323 mermeladas con un volumen final de 50 mL. Del extracto etanólico de fruto
maduro se tomó un volumen de 100 µL por cada repetición, haciendo un total de 300 µL; de igual
forma se realizó el mismo procedimiento para liofilizado y mermelada.

𝑌 = 𝐴𝑋 + B

Dónde:

Y = Absorbancia de la muestra (analito).

A = Pendiente de la ecuación de la linealidad de la curva patrón.

X = Es el dato que no se conoce (Concentración)

B = Intercepto de la ecuación de la linealidad de la curva patrón

Determinación de la concentración de fenoles del fruto maduro Prunus serotina a las que se realizó
3 repeticiones obteniendo los siguientes resultados de absorbancia 0,398 - 0,396 – 0,399; se
consideró la siguiente ecuación de la recta de una curva patrón de ácido gálico:

𝑦 = 0,0047𝑥 + 0,0377

La concentración de fenoles para el fruto maduro Prunus serotina corresponde a 76,5886 ppm.
Promedio de absorbancias: 0,3977

http://repositorio.unsa.edu.pe/bitstream/handle/20.500.12773/11554/QUrocobp
%26bovims.pdf?sequence=1&isAllowed=y