Trabajo Obtencion de Un Extracto Rico en Fenoles de Uncaria Tomentosa

UNIVERSIDAD MAYOR DE SAN ANDRÉS
FACULTAD DE CIENCIAS PURAS Y NATURALES

CARRERA DE CIENCIAS QUÍMICAS
TRABAJO PARA OPTAR AL GRADO DE LICENCIADO EN

CIENCIAS QUÍMICAS
Obtención de un extracto rico en compuestos fenólicos de la

corteza de la especie Uncaria tomentosa Willd DC
PORPostulante: OSCAR MAMANI ROCHA
TUTORES: PhD. GIOVANNA ROCIO ALMANZA VEGA

Lic. SANTIAGO TARQUI TARQUI
LA PAZ – BOLIVIA
1
Julio, 2021
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DEDICATORIA
3
AGRADECIMIENTOS
4
TABLA DE CONTENIDO
INDICE DE FIGURAS
INDICE DE TABLAS
INDICE DE ANEXOS
RESUMEN
Palabras clave:
Obtención de un extracto rico en compuestos fenólicos de la
corteza de la especie Uncaria tomentosa Willd DC
1. INTRODUCCIÓN
A inicios de los años noventa, la Organización Mundial de la Salud identificó que

el 80% de la población mundial recurre a la medicina tradicional para asistir problemas
de salud, la cual se basa principalmente en el empleo de plantas medicinales (UICN et
al. 1993). Por otro lado, se ha llegado a comprender que estas están inmersas en
diferentes formas de vida de los pueblos originarios, grupos étnicos, comunidades y
ciudades multiétnicas de los diferentes países. El uso deen cada una de ellas es amplio,
pues incluso abarca el campo de lo mágico espiritual, adquiriendo una importancia que
supera al valor de uso convencional.
Una de las plantas, de gran uso tradicional y bastante estudiadas en el mundo es la

especie Uncaria tomentosa (Willd) DC, conocida popularmente en nuestra región, como
“Uña de Gato” por su particular forma. Esta planta es una liana que crece en las selvas
de América del Sur y central, donde durante casi 2.000 años se ha utilizado con fines
medicinales (Arteche et al, 1998). En Bolivia se encuentra en los bosques de los andes
orientales, como los yungas y el Madidi (Araujo y Zenteno, 2006).
Son muchos los usos terapéuticos que provienen de los extractos de la corteza o
corteza de raíz, e incluye una amplia gama de tratamientos. Se tiene reportados usos,
como remedio, para abscesos, alergias, artritis, asma, cáncer, efectos secundarios de la
quimioterapia, anticoncepción, prevención de enfermedades, fiebres, úlceras gástricas,
hemorragias, inflamaciones, irregularidades menstruales, recuperación del parto,
reumatismo, impurezas de la piel, inflamación del tracto urinario, infecciones virales,
debilidad, heridas y otras (Cerri et al., 1988; Aquino et al., 1991; Rizzi et al, 1993;
Wurm et al., 1998; Lemaire et al., 1999).
Los estudios de actividad antioxidante de extractos brutos y parciales de Uncaria

tomentosa han demostrado resultados con elevado potencial, especialmente in vitro,
estando esta actividad vinculada al contenido de polifenoles, representados en la especie
por los taninos, procianidinas y derivados cafeoilquinicos. Por otra parte, se sabe que las
1
funcionesón de los flavonoides en una planta son varias, así, se consideran como de
antioxidantes y secuestradores de radicales libres, agentes antimicrobianoles y
antinutricionales, fotoreceptores y protectores contra la luz UV, agentes quelantes de
metales, atractores visuales para los insectos, entre otros (Marcano D., Masahisa, H.,
2018).
En el presente trabajo se espera quiere obtener un extracto rico en compuestos

fenólicos, a partir de la corteza de la especie Uncaria tomentosa (Willd) DC, el cual
puede servir para el desarrollo de un potencial fitofármaco con las propiedades que
ofrecen estos compuestos
2. ANTECEDENTES
2.1. EL GÉNERO UNCARIA
El género Uncaria, pertenece a la familia Rubiaceae. Comprende alrededor de 60

especies y se caracteriza por plantas leñosas, generalmente plantas trepadoras, y algunos
arbustos. Las plantas de este género se encuentran con mayor frecuencia en los
continentes asiático y africano.
Las especies del género Uncaria son, en general, arbustos trepadores, lianas
trepadoras y rastreros ascendentes, con un par de espinas en forma de gancho, originadas
en pedúnculos abortivos, que suelen trepar hasta la copa de los árboles. Tienen hojas
simples y opuestas; consistencia ovada, elíptica, oblonga, de consistencia cartácea,
papirácea o coriácea, pecíolos cortos o largos. Con un par de estípulas interpeciolares,
libres en la base, deltoides, obovadas o cordados, caídas, sección de la rama cuadrada
terminal. Flores bisexuales o funcionalmente unisexuales, en capítulos densos y
globulares, terminales de inflorescencia axilares o en panícula. Fruta de la cápsula
agrandada; semillas aladas, con un margen entero, muescas o irregulares, endospermo
carnoso, embrión craviforme, cotiledón pequeño y radícula obtusa (Alves Pereira &
Marques Lopes, 2006).
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[2.2.] ASPECTOS BOTANICOS Y DISTRIBUCIÓN DE LA ESPECIE
UNCARIA TOMENTOSA
Clasificación taxonómica (Obregón, 1995).

Reino: Vegetal
División: Antófitos
Subdivisión: Angiospermas
Clase: Dicotiledóneas
Subclase: Simpétalas
Orden: Rubiales
Familia: Rubiaceae
Género: Uncaria
Especie: Uncaria tomentosa
Nombres comunes: Brasil: Acre: espera ahí, uña de garra; Amapá: jupinda,
jupindá; Amazonas: espera un minuto, uña de gato;. Bolivia: bereoquida, uña de gato;.
Perú: amarillo garabato, jipotatsa, misho mentis, paotati mösha, samento, toroñ, tsachk,
uña de gato, unganangui.
Descripción botánica: liana leñosa, enredadera o, en ocasiones, arbusto

decumbente; hasta 35 m de longitud y 12 cm de diámetro, tallo cilíndrico. Corteza
exterior marrón o marrón oscura, fisuras longitudinales bien marcadas, ritidoma
persistente; corteza interna de color rojo dorado o rojizo, fibroso-laminar, ligeramente
pulverulenta cuando está seca; secreción acuosa y astringente. Ramas terminales de
sección cuadrangular, verde amarillento o verde pálido, hojas lanceoladas, densamente
pubescentes. Hojas simples, opuestas, pareadas, oblongas, oblongo-ovadas u elípticas-
obovadas, 6-16 x 4-10 cm, membranáceas, margen entero o ligeramente sinuoso, ápice
agudo o raramente acuminado, base redondeada o con cordones, pinatinervia oblicua,
costillas secundarias 7-10 pares; en la cara adaxial, verde pálido o verde amarillento,
poco pubescente o glabra, en la cara abaxial verde claro, tomentoso principalmente en
las venas; pecíolo 6-26 x 1-2 mm, ligeramente pubescente. Estípulas interpeciolares,
deciduas o persistentes, deltoides, 5-10 x 3-8 mm. Espinas en pares, opuestas, curvadas
rectas y puntiagudas, leñosas, 8-10 x 3-6 mm. Inflorescencias terminales o axilares,
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compuestas por racimos o puntas de capítulos globosos, de 6-20 cm de largo; capítulos
de 1,3 a 3 cm de diámetro; pedúnculo 1.2-3 x 1-2 mm, tomentoso. Flores andróginas,
actinomorfos, hyanto tubular, sésiles, copa tubular, 0.8-1.3 x 0.7-1.1mm, 5 cálices
puntiagudos, vellosos, largos en los márgenes y más largos en la base; gamopetales, 5
lóbulos de la corola redondeados, 6-12 x 2.5-6 mm, amarillentos, densamente
pubescentes en el lado externo, glabros en el lado interno, 5 estambres, adnados al grifo
de la corola, alternipétalos; anteras oblongas, dorsifijas, base prolongada, divergentes,
0.8-1 x 0.3-0.4 mm; ovario inferior, 2carpelar, 2-locular, estigma elipsoide, 0,4-0,6 mm
de longitud, aguja lineal, extirpada, hasta 4 mm de longitud, placentación axilar. Cápsula
septicida de fruto, elipsoide, 4-8 x 2,5-7 mm; cáliz persistente, acrescente,
multidifundido. Semillas fusiformes, ala membranosa, un extremo lineal y el otro en dos
líneas, 2-3 x 0,4-0,6 mm.
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FIGURA 1 U. tomentosa: a. inflorescencia de rama terminal y capítulo; B. espina; C. flor; D. estigma; E.
corola; F. Fruta; G. semilla; H. cáliz; I. corte longitudinal de la flor; J. detalle de la cara abaxial de la hoja;K.
corte del pecíolo. Fuente: (Zevallos-Pollito & Tomazello Filho, 2010).
FiguraIGURA 2. U. tomentosa: a. inflorescencia de rama terminal y capítulo; B. espina; C. flor;

D. estigma; E. corola; F. Fruta; G. semilla; H. cáliz; I. corte longitudinal de la flor; J. detalle de la cara
abaxial de la hoja;K. corte del pecíolo. Fuente: (Zevallos-Pollito & Tomazello Filho, 2010).
Distribución geográfica: Ees muy amplia en la Amazonía y Centroamérica,

pudiendo encontrarse entre 15º30'00 ”N-13º36'00” S y 51º58'00 ”W-89º00” 00 ”W y en
altitudes de 5-750 m . En la Amazonía y Centroamérica ocupan varias áreas de Belice,
Bolivia, Brasil, Colombia, Costa Rica, Ecuador, Guatemala, Guyana, Guayana Francesa,
Honduras, Nicaragua, Panamá, Perú y Venezuela. (Anexo 1). Especie muy abundante en
arroyos y claros de bosques primarios; caminos y senderos cerrados, generalmente en
suelos ricos en nutrientes y muy húmedos. Generalmente en bosques primarios vírgenes
o explorados o en bosques secundarios viejos, raro en los nuevos, requiere luz solar
5
moderada, perteneciente al grupo ecológico de heliófitos perennes (Zevallos-Pollito &
Tomazello Filho, 2010).
2.2.[2.3.] USOS TRADICIONALES DE U. TOMENTOSA (UÑA DE GATO)
Su empleo en la medicina tradicional es de larga data. Son muchos los usos

terapéuticos que provienen del extracto acuoso de la corteza o corteza de raíz, e incluye
una amplia gama de tratamientos. Se informa que es un remedio para abscesos, alergias,
artritis, asma, cáncer, efectos secundarios de la quimioterapia, la anticoncepción, la
prevención de enfermedades, las fiebres, las úlceras gástricas, hemorragias,
inflamaciones, irregularidades menstruales, recuperación del parto, reumatismo,
impurezas de la piel, inflamación del tracto urinario, infecciones virales, debilidad,
heridas y otras (Heitzman, Neto, Winiarz, Vaisberg, & Hammond, 2005).
La uña de gato se prepara generalmente en la medicina tradicional en forma de

infusión, por ejemplo, el líquido que se obtiene al hervir 10 g de la hoja con 200 ml de
agua se ingiere tres veces al día. Una tintura, preparada con un 10% de corteza p / p en
alcohol de 70 °, a menudo se mezcla con otras plantas medicinales (Sánchez Schwartz,
1995). Actualmente, la uña de gato está disponible en muchos tipos de presentación,
polvos secos o cortes de raíz y tallo, material en polvo encapsulado o extractos acuosos
liofilizados, tinturas, tabletas, ungüentos y geles (Reinhard, 1998).
Específicamente en Bolivia, los Tacanas administran decocción concentrada de

corteza de U. tomentosa para el tratamiento del reumatismo, menstruación irregular y
dolencias del tracto digestivo, hígado y riñón (Bourdy, y otros, 2000).
En la medicina tradicional Tikuna la efectividad del remedio no solo se da por su

correcta preparación y dosificación, sino que también es necesario que el paciente siga
una dieta adecuada mientras hace el tratamiento. Si no se siguen estas dietas de forma
adecuada o se toman en exceso los remedios de uña de gato, es posible que se presenten
efectos adversos que afectan la salud de la persona, en el corto y largo plazo. Por
ejemplo, algunos abuelos recomiendan no exceder su consumo pues puede intoxicar a la
persona, afectar de forma permanente la visión, resecar la piel y en el caso de los
hombres, causar impotencia. Sumado a esto, el uso de las especies de uña de gato tiene
una serie de restricciones y contraindicaciones, dependiendo de las situaciones
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especiales en la que se consuma. En estas comunidades los remedios se dan de forma
restringida a niños menores de dos años y algunos abuelos recomiendan que no se le
prepare a recién nacidos (Garzón, 2021).
[2.4.] FITOQUIMICAANTECEDENTES QUÍMICOS DEL GÉNERO

UNCARIA
De los estudios fitoquímicos realizados en algunas especies del género Uncaria, se

han encontrado principalmente alcaloides oxindólicos tetracíclicos y pentacíclicos
(Muhammad, Dunbar, Khan, Ganzera, & Khan, 2001; Aquino, y otros, 1991; Heitzman,
Neto, Winiarz, Vaisberg, & Hammond, 2005), alcaloides indólicos (Aquino, y otros,
1991) y β-carbonilícos (Pengsuparp, y otros, 2001), flavonoides (Heitzman, Neto,
Winiarz, Vaisberg, & Hammond, 2005), cumarinas (Valente, y otros, 2009),
protoantocianidinas (Gonçalves, Dinis, & Batista, 2005), taninos (Pilarski, Zieliński,
Ciesiołka, & Gulewicz, 2006), esteroides (Senatore, Cataldo, Iaccarino, & Elberti,
1989), triterpenoides derivados del ursano (Heitzman, Neto, Winiarz, Vaisberg, &
Hammond, 2005; Agüero, Sánchez, Stilke, & de Ugaz, 1988) y glicósidos de ácido
quinovico (Domínguez G. , 2007).
Dentro de su composición de alcaloides, se tiene, indólicos pentaciclicos

(akuammigina, tetrahidroalstonina, isoajmalicina) y tetraciclicos (hirsutina,
dihidrocorinanteina, hirsuteina, corinanteina); también alcaloides oxindoles
pentaciclicos (pteropodina, isopteropodina, mitrafilina, isomitrafilina, especioofilina,
uncarina F) y tetraciclicos (rinchofilina, isorinchofilina, corinoxeina, isocorinoxeina,
rotundifolina, isorotundifolina) (Keplinger, Laus, Wurm, Dierich, & Teppner, 1999;
Quintela & de Ugaz, 2003; Peñaloza, y otros, 2015).
Se han encontrado triterpenos polihidroxilados (ácido uncarico, ácido florídico),

triterpenos polioxigenados, glucósidos del ácido quinovico, ácido ursólico y ácido
oleanólico, glucósidos del nortriterpeno derivados del ácido piroquinovico
(tomentosidos A y B) y 5α-carboxistrictosidina (Keplinger, Laus, Wurm, Dierich, &
Teppner, 1999; Quintela & de Ugaz, 2003). Fitosteroles: β-sitosterol, estigmasterol,
campesterol (Aquino, y otros, 1991). También flavonoides: las procianidinas A1, B2, B3
y B4, kaempherol, dihidrokaempherol, quercetina, epicatequina y cinconaína Ia y Ib
7
(Falkiewicz & Lukasiak, 2001; Quintela & de Ugaz, 2003). Mossmann et al. 2003
identifica componentes químicos, esteroides y alcaloides, entre estos, destacan la
rinofilina y el pteropodina (Mossmann, Regner, & Bueno, 2003).
Así mismo, Montoro et al. 2004, reporta alcaloides y glucósidos del ácido
quinovico en muestras de corteza comercial, corteza cultivada y hojas (Montoro,
Carbone, de Dioz Zuniga Quiroz, De Simone, & Pizza, 2004).
Navarro et al. 2019, identifico 25 compuestos fenólicos, incluidos los ácidos

hidroxibenzoico e hidroxicinámico, monómeros de flavan-3-ol, dímeros de procianidina,
trímeros de procianidina, así como dímeros de propelargonidina (Navarro, y otros,
2019).
Peñaloza et al. 2015, reporta, en muestras silvestres de uña de gato, mostraron una
constitución química muy heterogénea, especialmente para los alcaloides oxindol. Los
mayores contenidos de alcaloides y polifenoles se encontraron en las hojas seguidas de
la corteza del tallo y las ramas, mientras que los glucósidos del ácido quinovico se
detectaron en cantidades significativas solo en las cortezas del tallo (Peñaloza, y otros,
2015). Por otra parte, Navarro et al. 2017, encontró mayor concentración de
proantocianidinas totales en extractos de corteza, tallos y hojas consecutivamente
(Navarro-Hoyos, y otros, 2017).
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FIGURA 3 Principales compuestos polifenólicos informados en las cortezas de Uncaria Tomentosa. (Fuente:
Heitzmann et al. 2005).
FiguraIGURA 4. Principales compuestos polifenólicos informados en las cortezas de Uncaria

Tomentosa. (Fuente: Heitzmann et al. 2005).
[2.5.] ASPECTOS ANTECEDENTES ETNOFARMACOLÓGICOS Y

FARMACOLÓGICOS DE UNCARIA TOMENTOSA
Estudios sugieren que los alcaloides pentacíclicos de oxindol son probablemente

sustancias responsables de la actividad antiinflamatoria (Mossmann, Regner, & Bueno,
2003). Uncaria tomentosa de acuerdo a los mecanismos de acción para determinar su
actividad biológica se describe que previene la activación del factor transcripcional NF-
IcB, inhibiendo la expresión de los genes que se inducen durante el proceso
inflamatorio, como el gen que regula la transcripción del óxido nítrico sintasa,
atenuando así la producción de un agente proinflamatorio como es el óxido nítrico
(Sandoval, y otros, 2000; Guijarro, 2001). Otros glucósidos del ácido quinovico reducen
la respuesta inflamatoria del edema de la pata de rata inducido por carragenano (Aquino,
y otros, 1991). Si por una parte, se ha comprobado su actividad antiinflamatoria en
9
estudios tanto in vivo como in vitro, pero también se ha visto que este efecto es menor si
se utilizan los heterósidos del ácido quinóvico aislados que si se emplean extractos del
fármaco, por lo que es muy probable que esta actividad biológica se potencie por otros
compuestos que actúen sinérgicamente. Por ello, es preferible utilizar el fármaco
completo. Igualmente se ha demostrado que Uncaria tomentosa posee una fuerte
actividad inmunoestimulante, y los extractos totales de la planta son más eficaces que
los componentes aislados. (López Luengo, 2006).
Domínguez et al. 2011, indica que Uncaria tomentosa, induce una fuerte
inmunomodulación, comprobándose que los niveles de TNF-α e IFN-α disminuyen y la
modulación de IL-10 (Domingues, y otros, 2011). Keplinger et al. 1999, menciona que
estimulan las células endoteliales para producir un factor regulador de la proliferación de
linfocitos, actuando como antagonistas (Keplinger, Laus, Wurm, Dierich, & Teppner,
1999).
Por otro lado, en un estudio se informa la actividad inmunoestimulante dada por,

isopteropodina, pteropodina, isomitrafilina, e isorincofilina; antivírica y antiinflamatoria
a partir de los glicósidos del ácido quinóvico. Y otras también como, citostática
(isorincofilina), antileucémica (isópteropodina, pteropodina, isomitrafilina, uncarina F y
especiofilina), antiagregante plaquetaria (rincofilina), hipotensora (hirsutina, mitrafilina
y rincofilina) y diurética (mitrafilina). Además de influir en La mejoría de los procesos
de memoria (uncarina E, uncarina C, mitrafilina, rincofilina e isorincofilina) (Guijarro,
2001).
Los extractos etanólicos y acuosos de Uncaria tomentosa mostraron actividades

antioxidantes prometedoras medidas a través de TEAC (capacidad antioxidante
equivalente a Trolox), PRTC (capacidad de atrapamiento de radicales peroxilo) y SOD
(actividad captadora de radicales superóxidos) (Pilarski, Zieliński, Ciesiołka, &
Gulewicz, 2006). También se detectaron altas actividades antioxidantes en las pruebas
de DPPH, SOD y PRTC y por inhibición de la peroxidación de lípidos. Según
Gonçalves et al 2005, estas actividades podrían explicarse por el alto contenido de
proantocianidinas y ácidos fenólicos, principalmente ácido cafeico en el extracto.
Navarro et al. 2019, confirman el valor de productos comerciales potenciales de
10
Uncaria tomentosa, ricos en proantocianidinas y que exhiben una alta actividad
antioxidante. También la evaluación de actividad antioxidante de los extractos
hidroalcohólicos de seis plantas peruanas entre ellas la Uncaria tomentosa, dio como
resultado una gran capacidad antioxidante de esta especie, los cuales concluyeron en que
el extracto hidroalcohólico al 50% es más activo que el extracto acuoso en el test de
inhibición de radicales superóxido y peroxilo así como en su capacidad antioxidante
total (Doroteo, Díaz, Terry, & Rojas, 2013).
Algunos de los usos medicinales mencionados por las comunidades han sido
corroborados a través de estudios clínicos que demuestran la efectividad de las dos
especies de uña de gato, gracias a sus diversas propiedades farmacológicas. Por ejemplo,
múltiples estudios han demostrado que la U. tomentosa tiene efectos anticancerígenos,
antioxidantes, anti-mutagénicos y anti-inflamatorios (Lozada-Requena, Núñez, Alvárez,
Kahn, & Aguilar, 2015; Farias, y otros, 2011; Riva, y otros, 2001; Gonçalves, Dinis, &
Batista, 2005).
Se encontró que esta especie sirve como coadyuvante para el tratamiento de cáncer
de mama, puesto que ayuda a reducir los efectos secundarios de la radiación y la
quimioterapia al modular la actividad del sistema inmune y restaurar el ADN dañado
(Santos Araújo, y otros, 2012). De igual manera, se han identificado otras propiedades
para contrarrestar la diabetes, la gastritis, la artritis, la endometriosis, las infecciones
urinarias y algunas enfermedades epidémicas como la malaria (Riva, y otros, 2001;
Pérez, 2002).
El uso de uña de gato está contraindicado en caso de úlcera péptica y gastritis, ya

que debido al efecto ulcerogénico de los taninos que contiene, se podría producir un
empeoramiento en ambos casos. La uña de gato no debe usarse durante el embarazo ni la
lactancia debido a la falta de ensayos clínicos que avalen su seguridad en estos casos.
(López Luengo, 2006). Algunas investigaciones clínicas señalan que el uso de U.
tomentosa está contraindicado a pacientes que les están administrando medicamentos
para evitar el rechazo de órganos trasplantados; además, está restringido durante el post
operatorio, pues reduce la agregación plaquetaria y la sangre disminuye (Garzón, 2021).
También recomiendan que esta especie no la consuman personas con enfermedades
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neurodegenerativas como el párkinson, pues pueden empeorar temporalmente los
episodios de temblores e hipocinesia (Cosentino & Torres, 2008).
3. PROBLEMATICA
Existe una gran cantidad de información, acerca de la especie Uncaria tomentosa

(Uña de gato) en los últimos años, sin embargo, en nuestra regiónnuestro país no se
aprovecha estaes aprovechada, hacia aun teniendo diversas aplicaciones potenciales, por
lo cual no es utilizada en se puede inferir hacia la producción de medicamentos naturales
más eficientes, con una buena proporción de compuestos activos, en los productos
terminados deelaborados por la industria nacional.
Esta planta es muy reconocida y valorada a nivel mundial por sus propiedades, sin
embargo, en nuestro país no se la usa en plenitud, por no contar con estudios científicos
suficientes, que garanticen sus propiedades, en la elaboración de productos fitofármacos.
En la industria nacional, como la empresa nacional Naturalcos SA., se desarrollan

productos en base a ésta, sin embargo, no se tienenpero sin estudios estudios científicos
del principio activo en sus productos, que respalden su uso y permitan seguir innovando
en el mercado y así competir con productos extranjeros.
4. HIPOTESIS
La especie Uncaria tomentosa, conocida tradicionalmente como “uña de gato”,

además de alcaloides con reconocidas propiedades farmacológicas, contiene otros
compuestos bioactivos, como compuestos fenólicos, que pueden ser aprovechados
comercialmente, mediante un extracto rico en estos principios, conpor su gran actividad
antioxidante, entre otras.
5. OBJETIVOS
5.1. OBJETIVO GENERAL
Obtener un extracto rico en compuestos fenólicos a partir de la corteza de Uncaria

tomentosa (Willd) DC, para el desarrollo de un potencial fitofármaco.
12
5.2. OBJETIVOS ESPECÍFICOS
• Preparar extractos hidro-alcohólicos, de la corteza de Uncaria tomentosa,

variando el porcentaje de composición del solvente.
• Analizar los grupos de metabolitos secundarios en los extractos obtenidos,

mediante análisis fitoquímico preliminar y cromatografía en capa fina (TLC).
• Obtener fracciones ricas en compuestos fenólicos, de un extracto seleccionado

con base en su composición preliminar determinada y su rendimiento.
• Analizar los compuestos fenólicos, en los extractos y fracciones obtenidas

mediante cromatografía HPLC y UV/Vis?.
• Realizar pruebas de actividad antioxidante a los extractos y fracciones

obtenidas de Uncaria tomentosa.
6. JUSTIFICACIÓN
La medicina tradicional se utiliza ampliamente y es un sistema sanitario que está

creciendo rápidamente y de gran importancia económica. En África hasta un 80% de la
población utiliza la medicina tradicional para ayudar a satisfacer sus necesidades
sanitarias. En Asia y en Latinoamérica, las poblaciones siguen utilizando la medicina
tradicional como resultado de circunstancias históricas y creencias culturales. En
muchos países desarrollados el popular uso de la medicina complementaria alternativa
está propulsado por la preocupación sobre los efectos adversos de los fármacos químicos
hechos por el hombre, cuestionando los enfoques y las suposiciones de la medicina
alopática y por el mayor acceso del público a información sanitaria. (Organización
Mundial de La salud, 2002).
Bolivia, como algunos de los países suramericanos y de centroamericanos, posee

una gran biodiversidad vegetal, de las cuales muchos sonteniendo muchas plantas
conocidaos y empleadaos en medicina natural; por lo tanto, no podría estar exenta del
desarrollo de potenciales medicamentos naturales, que demanda la sociedad actual.
Una de las plantas, de gran uso tradicional y bastante estudiadas en el mundo es la

especie Uncaria tomentosa (Willd) DC, conocida popularmente en nuestra región, como
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“Uña de Gato” por su particular forma. Son muchos los usos terapéuticos que provienen
de los extractos de la corteza o corteza de raíz, e incluye una amplia gama de
tratamientos. Se tiene reportados varios usos, como remedio, para abscesos, alergias,
artritis, asma, cáncer, efectos secundarios de la quimioterapia, anticoncepción,
prevención de enfermedades, fiebres, úlceras gástricas, hemorragias, inflamaciones,
irregularidades menstruales, recuperación del parto, reumatismo, impurezas de la piel,
inflamación del tracto urinario, infecciones virales, debilidad, heridas y otras (Cerri et
al., 1988; Aquino et al., 1991; Rizzi et al, 1993; Wurm et al., 1998; Lemaire et al.,
1999).
Esta planta es una liana que crece en las selvas de América del Sur y central,
cuenta con numerosos estudios en todo el mundo, siendo paradójico, que justamente en
países donde no es factible su cultivo natural, sean los que más hayan estudiado esta
planta, llegando a patentar muchos extractos y productos; por lo cual este trabajo es uno
de los pocos en nuestro territorio, que aporta hacia el desarrollo de extractos
estandarizados, para el desarrollo de productos fitofármacos innovadores.
Mediante este proyecto, concretamente se plantea dar apoyo a la industria

nacional, como la empresa Naturalcos SA., dando un respaldo científico a un extracto
fenólico que puede ser utilizado en productos con propiedades antioxidantes y
antiinflamatorias.
7. MARCO TEÓRICO
7.1. LOS COMPUESTOS FENÓLICOS
Las plantas sintetizan una gran variedad de productos secundarios que contienen
un grupo fenol. Estas sustancias reciben el nombre de compuestos fenólicos, polifenoles
o fenilpropanoides. Los compuestos fenólicos constituyen un amplio grupo de sustancias
englobando más de 8000 compuestos de origen natural, los cuales poseen una
característica estructural en común, un grupo fenol con al menos un grupo hidroxilo
como sustituyente.
Desde el punto de vista de la estructura química, son un grupo muy diverso que
comprende desde moléculas sencillas como los ácidos fenólicos hasta polímeros
14
complejos como los taninos y la lignina. En el grupo también se encuentran pigmentos
flavonoides Muchos de estos productos están implicados en las interacciones planta –
herbívoro (Pérez-Urria Carril & Ávalos García, 2009).
7.2. CLASIFICACIÓN DE LOS COMPUESTOS FENÓLICOS
Desde un punto de vista analítico los compuestos fenólicos pueden dividirse en

extraíbles (libres y conjugados) y no extraíbles, formas insolubles principalmente ligadas
a polisacáridos de las paredes celulares. Además, han sido clasificados en diferentes
grupos de acuerdo a su estructura (número de anillos fenol y tipo y número de elementos
estructurales ligados), la cual varía desde moléculas muy simples hasta compuestos
altamente polimerizados. En esta clasificación estructural destacan los ácidos fenólicos
simples, estilbenos, curcuminoides, chalconas, lignanos, flavonoides e isoflavonas
(González-Castejón & Rodriguez-Casado, 2011), siendo los ácidos fenólicos y los
flavonoides los más ampliamente distribuidos en plantas (frutos, tallos, raíces y granos)
(Pietta P., 2000).
15
FIGURA 5 Clasificación de los compuestos fenólicos. (Fuente: González-Castejón y Rodriguez-Casado,
2011).
Figura 6. Clasificación de los compuestos fenólicos. (Fuente: González-Castejón y Rodriguez-

Casado, 2011).
7.2.1. Ácidos fenólicos
Los ácidos fenólicos se derivan de los ácidos benzoico y cinámico. Hay dos clases
de ácidos fenólicos: ácidos hidroxibenzoicos y ácidos hidroxicinámicos. El primer grupo
incluye el ácido gálico, p-hidoxibenzoico, vanílico, entre otros; en el segundo grupo se
16
encuentran el ácido cumárico, cafeico y ferúlico. En general, los ácidos fenólicos pueden
estar en forma esterificada, glicosilada y polimerizada (Häkkinen, 2000).
FIGURA 7 Estructura química de los ácidos fenólicos. a) hidroxibenzoicos: ρ- hidroxibenzoico, R1 = H, R2 =
H; ácido gálico, R1 = OH, R2 = OH y b) hidroxicinámicos: ácido ρ-cumárico, R1 = H; ácido cafeico, R1 = OH;
ácido ferúlico, R1 = OCH3. Fuente: (Häkkinen, 2000).
Figura 8. Estructura química de los ácidos fenólicos. a) hidroxibenzoicos: ρ- hidroxibenzoico, R1

= H, R2 = H; ácido gálico, R1 = OH, R2 = OH y b) hidroxicinámicos: ácido ρ-cumárico, R1 = H; ácido
cafeico, R1 = OH; ácido ferúlico, R1 = OCH3. Fuente: (Häkkinen, 2000).
Los ácidos fenólicos se encuentran principalmente en la capa externa de los

granos, formando parte de una estructura compleja como la lignina o como un derivado
de azúcar. Los derivados de los ácidos cinámico y benzoico se desarrollan prácticamente
en todos los alimentos vegetales, encontrándose dispersos en semillas, hojas, raíces y
tallo. Además, estos compuestos han sido relacionados con diversas funciones en
plantas, incluyendo absorción de nutrientes, síntesis de proteínas, actividad enzimática,
fotosíntesis y alelopatía (Robbins, 2003).
7.2.2. Flavonoides
Los flavonoides sin ser metabolitos primarios, se encuentran casi en cualquier

vegetal superior, hay más de 8000 compuestos conocidos de plantas vasculares. La
función de los flavonoides en la planta son varias. Así, se consideran como de
antioxidantes y secuestradores de radicales libres, agentes antimicrobiales y
antinutricionales, fotorreceptores y protectores contra la luz UV, agentes quelantes de
metales, atractores visuales para los insectos, entre otros (Marcano & Masahisa, 2018).
La estructura general de los flavonoides comprende un anillo A derivado de la

cadena del policétido (sigue el patrón de oxigenación del oroglucinol o del resorcinol:
17
patrón meta), un anillo B, derivado del ácido shikímico, con sustitución en orto, como en
los ácidos cumárico, cafeico y gálico, y tres átomos de carbono que unen los anillos A y
B , correspondientes a la parte alquílica del fenilpropano. Es por ello que se les conoce
como unidades C15: C6-C 3-C 6 y el esqueleto recibe el nombre de núcleo de flavano.
FIGURA 9 Estructura de flavano
Figura 10. Estructura del flavano
Estos pueden contener un anillo central heterociclo (γ-pironas) que son los más
abundantes, o una cadena abierta: chalconas, como precursores de los anteriores. La
proporción de oxigenación varía y puede estar como OH, OMe, dioximetileno y aun
formando glicósidos. Las polimerizaciones son frecuentes, hay muchos monómeros,
algunos dímeros, pocos trímeros y tetrámeros; la mayoría son polímeros entre los cuales
se encuentran los taninos condensados. La polimerización ocurre principalmente por
uniones C-C y a medida que ésta aumenta, se intensifica el color. El estado de oxidación
del anillo central determina varios grupos estructurales. La hidroxilación en los anillos
aromáticos es muy frecuente en las posiciones 7 y 4', frecuente en 5 y 3', a veces en 5' y
8, y escasa en 6 y 2'. Hay un grupo de flavonoides que presentan el anillo B unido a C-3
y se denominan isoflavonoides.
18
FIGURA 11 Grupos de flavonoides.
Figura 12. Grupos de flavonoides.
Dentro del grupo de flavonoides más ampliamente distribuidos en las plantas

destacan la catequina, epicatequina, epigalocatequina, así como la quercetina y el
kaempferol (Pietta P., 1999).
7.2.3. Antocianinas
Las antocianinas son pigmentos solubles en agua que se encuentran en la

naturaleza generalmente como glicósidos de antocianidinas. El glicósido más común es
el 3-glicósido. La estructura generalizada de los pigmentos de antocianinas se muestra
en la Figura 7. Dentro de este grupo sobresalen la delfinina, cianidina, petunidina,
peonidina y malvidina, aunque actualmente han sido identificadas más de 540
antocianinas en la naturaleza, con la mayor parte de variaciones estructurales por
sustitución glucosídica en las posiciones 3 y 5 y una posible acilación de residuos de
azúcares con ácidos orgánicos. En general, están presentes en las plantas particularmente
en los tejidos de frutos y flores y son responsables de un diverso rango de coloración,
incluyendo rojo, azul y violeta (Vermerris & Nicholson, 2008; Fraga, 2010).
19
FIGURA 13 Estructura generalizada de las antocianinas. Cianinida: R1 = OH, R2 = H; delfinidina: R1 =
OH, R2 = OH.
Figura 14. Estructura generalizada de las antocianinas. Cianinida: R1 = OH, R2 = H;

delfinidina: R1 = OH, R2 = OH.
[7.2.4.] Taninos condensados
Los taninos son un grupo de compuestos hidrosolubles producidos por la

condensación de compuestos fenólicos simples, con un peso molecular comprendido
entre 300 y 5000 Daltones y se dividen en dos clases: taninos condensados o
proantocianidinas y taninos hidrolizables (Reed, 1995). Los taninos hidrolizables son
derivados del ácido gálico, mientras que las proantocianidinas consisten en unidades
polimerizadas de flavan-3-ol ((+)-catequina y (-)-epicatequina) que contienen un gran
número de grupos hidroxilo, entre otros grupos funcionales, siendo capaces de unirse a
proteínas y a otras macromoléculas (Martínez-Valverde, Periago, & Ros, 2000; Dykes &
Rooney, 2007; Ignat, Volf, & Popa, 2011).
20
FIGURA 15 Estructura química de taninos condensados. Procianidina: R = H; prodelfinina: R = OH.
Figura 16 Estructura química de taninos condensados. Procianidina: R = H; prodelfinina: R =

OH.
Los taninos condensados han sido asociados con la resistencia de las plantas a
insectos y enfermedades (Lege, Cothren, & Smith, 1995).
7.3. BIOSÍNTESIS DE LOS COMPUESTOS FENÓLICOS
Hay dos vías principales a través de las cuales se biosintetizan los compuestos
fenólicos en la naturaleza: acetato - malonato (acetogeninas o policétidos aromáticos) y
ácido shikímico (fenilpropanos). Ambas vías pueden generar compuestos con el mismo
esqueleto, como por ejemplo las quinonas, o pueden conjugarse formando compuestos
de origen mixto, como ocurre en los flavonoides (Marcano & Masahisa, 2018).
21
FIGURA 17 Esquema general de biosíntesis de productos naturales,. Fuente: (Marcano & Masahisa, 2018)
Figura 18. Esquema general de biosíntesis de productos naturales,. Fuente: (Marcano &
Masahisa, 2018)
La ruta del ácido malónico es una fuente importante de fenoles en hongos y

bacterias, pero es poco empleada en plantas superiores.
La ruta del ácido shikímico es responsable de la biosíntesis de la mayoría de los

compuestos fenólicos de plantas. A partir de eritrosa-4-P y de ácido fosfoenolpirúvico se
inicia una secuencia de reacciones que conduce a la síntesis de ácido shikímico y,
22
derivados de éste, aminoácidos aromáticos (fenilalanina, triptófano y tirosina). La
mayoría de los compuestos fenólicos derivan de la fenilalanina. Esta ruta está presente
en plantas, hongos y bacterias, pero no en animales. La fenilalanina y el triptófano se
encuentran entre los aminoácidos esenciales para los animales que se incorporan en la
dieta. La tirosina no es esencial en el sentido de que los animales pueden sintetizarla por
hidroxilación de fenilalanina.
FIGURA 19 Derivados del ácido shikímico. Fuente: (Marcano & Masahisa, 2018).
Figura 20. Derivados del ácido shikímico. Fuente: (Marcano & Masahisa, 2018).
23
La enzima fenilalanina amonio liasa (PAL) cataliza la formación de ácido
cinámico por eliminación de una molécula de amonio de la fenilalanina. Esta enzima
está situada en un punto de ramificación entre el metabolismo primario y secundario por
lo que la reacción que cataliza es una importante etapa reguladora en la formación de
muchos compuestos fenólicos. Las reacciones posteriores a la catalizada por PAL son
básicamente adiciones de más grupos hidroxilo y otros sustituyentes. Los ácidos trans-
cinámico y p-cumárico se metabolizan para formar ácido ferúlico y ácido caféico cuya
principal función es ser precursores de otros derivados más complejos: cumarinas,
lignina, taninos, flavonoides e isoflavonoides. (Pérez-Urria Carril & Ávalos García,
2009).
7.4. METODOS DE EXTRACCIÓN
La extracción es un proceso de transferencia de materia. Los métodos de

extracción implican el tratamiento del material vegetal con el disolvente adecuado, que
solubilice dentro de lo posible, únicamente el principio activo deseado.
Como en el caso de otros compuestos fenólicos, los flavonoides son por lo general,
altamente polares y esta propiedad es aprovechada para su aislamiento. Se ubican
preferentemente en las vacuolas y por tanto son hidrofílicos. La extracción con agua o
solventes acuosos puede presentar algunas desventajas como es la co-extracción de otros
compuestos hidrosolubles difíciles de separar: azúcares, péptidos, o enzimas, como por
ejemplo la glicosidasa, que o se destruyen por el medio acuoso y al actuar sobre los
compuestos fenólicos produce cambios en las moléculas originalmente presentes. Tam
poco con solventes acuosos es posible aislar aquellos flavonoides ocluidos en los
cloroplastos y otros organelos, pues se requiere de solventes lipídicos para destruir la
membrana y permitir su flujo hacia el medio. Los polifenoles, a menos que sean
totalmente esterificados o eterificados son solubles en solventes polares y los glicósidos
lo son en agua (Marcano & Masahisa, 2018). Por lo que se emplea normalmente mezclas
de solventes para su extracción.
24
7.5. ANÁLISIS FITOQUÍMICO
Lla fitoquímica estudia las propiedades y estructuras químicas de los productos

naturales de las plantas, a través de lo que se conoce como marcha fitoquímica, se
determina la existencia de un tipo de compuesto químicometabolitos secundarios (Sierra,
Barros, Gómez, Mejía, & Suarez, 2018).
Para determinar la composición química de las plantas medicinales y conocer sus

constituyentes biológicamente activos pueden seguirse metodologías que van desde un
análisis fitoquímico preliminar, hasta estudios químicos sistemáticos bioguiados. Lo
ideal es iniciar con estudios fitoquímicos preliminares que permitan hacer una
discriminación de las plantas a estudiar en términos de su composición química, con el
fin de seleccionar únicamente aquellas más interesantes para posteriores estudios
sistemáticos. El objetivo de un estudio fitoquímico preliminar es determinar la presencia
o ausencia de los principales grupos de metabolitos en una especie vegetal, comoa saber:
alcaloides, antraquinonas y naftoquinonas, esteroides y triterpenos, flavonoides, taninos,
saponinas, cumarinas, lactonas terpénicas y cardiotónicos. Dado que cada uno de estos
grupos de compuestos está relacionado con actividades biológicas específicas, partiendo
de los resultados obtenidos en el estudio fitoquímico preliminar es posible orientar
investigaciones posteriores para determinar la actividad biológica de las especies en
cuestión y los principios activos involucrados (Carvajal, Hata, Sierra, & Rueda Niño,
2009).
7.6. CROMATOGRAFÍA EN CAPA FINA (TLC)
En la cromatografía en capa fina la fase estacionaria se deposita, formando una

capa delgada, sobre un material de soporte tal como placas de vidrio o aluminio. La fase
móvil asciende a lo largo de la fase estacionaria por capilaridad, produciéndose la
separación de los componentes de la muestra en base a su diferente distribución entre la
fase móvil y la fase estacionaria. La altura máxima que alcanza el disolvente en la placa
recibe el nombre de frente de disolvente, y se utiliza como referencia para calcular las
distancias relativas recorridas por los componentes de la mezcla en el cromatograma.
25
Se denomina factor de retardo (Rf) a la relación existente entre la distancia
recorrida por un compuesto y la recorrida por el disolvente en el mismo tiempo:
distancia recorrida por el compuesto

Rf=
distanciarecorrida por el solvente
Este factor depende tanto de las condiciones experimentales (temperatura, grado

de saturación de la cámara de desarrollo, cantidad de muestra, etc.) como de la
composición de la fase móvil y de la fase estacionaria, pero es una constante física de
cada especie química. Por este motivo, para un sistema cromatográfico dado
(condiciones experimentales/fase estacionaria/fase móvil), el valor de Rf de un
compuesto determinado es constante, permitiendo la identificación de especies.
[7.7.] CROMATOGRAFÍA POR EXCLUSIÓN (SEPHADEX® LH-20)
La cromatografía de exclusión molecular Sephadex ™ LH-20 es un medio de

cromatografía líquida diseñado para separar losel productos naturales por su tamaño
molecular de productos naturales como esteroides, terpenoides, lípidos y péptidos de
bajo peso molecular (hasta 35 residuos de aminoácidos), entre otros. Dependiendo de los
disolventes elegidos, este medio también puede separar los componentes de la muestra
por partición entre las fases estacionaria y móvil. Sephadex LH-20 es útil para escalas
analíticas e industriales.
Sephadex LH-20 es dextrano reticulado en perlas que ha sido hidroxipropilado

para producir un medio de cromatografía con carácter tanto hidrófilo como lipófilo.
Debido a su carácter dual, Sephadex LH-20 se hincha en agua y varios disolventes
orgánicos. Tanto el tamaño de partícula húmeda como el límite de exclusión del medio
varían según el solvente usado para el hinchamiento, Por ejemplo el volumen medio
empaquetado con etanol es de 3.6 – 3.9mL/g de polvo seco.
7.7.[7.8.] CAPACIDAD ANTIOXIDANTE
Los antioxidantes naturales son sistemas biológicos que poseen diferentes

mecanismos para afrontar los diferentes procesos de oxidación ocasionados por el estrés
oxidativo los cuales proceden de su interacción con el medio. Por este motivo los
26
mecanismos de los antioxidantes tienden a clasificarse en enzimáticos y no enzimáticos,
los cuales depende del tipo de interacción que pueden llevar a cabo.
En el caso de los antioxidantes enzimáticos como por ejemplo tenemos por

ejemplo: superóxido dismutasa, catalasa y, tioredoxina-reductasas., Ppor el contrariootra
parte, tenemos a losa antioxidantes no enzimáticos, que son moléculas de diversos
grupos químicos que actúan retardando y/o inhibiendo la formación o propagación de
especies radicales, que ocasionan daño a nivel celular, entre los grupos más comunes se
pueden mencionar: polifenoles, flavonoides, tocoferoles y tocotrienoles. (Decker, Elias,
& McClements , 2010).
Desde otro punto de vista, los antioxidantes también se clasifican en endógenos y

exógenos, entre los primeros tenemos a los que son elaborados por la propia célula, y
como segundo tenemos a los que son más conocidos ya que ingresan en el organismo a
través de la dieta o de suplementos con formulaciones antioxidantes (Vallejo-Zamudio,
Rojas-Velázquez, & Torres-Bugarín, 2017).
Por consiguiente, los antioxidantes tienen como finalidad primero inhibir radicales
libres, segundo eliminar las enzimas que generan los radicales libres y por último reparar
los daños oxidativos generados en el organismo (Choque Juchani, 2013). Por ello se
considera que los antioxidantes son un mecanismo de defensa contra radicales libres ya
que posee una afinidad mayor para interactuar que cualquier otra molécula. Finalmentes,
se puede considerar u concepto decomo antioxidantes, a toda sustancia que hallándose
en bajas concentraciones, respecto a las de una molécula oxidable o biomolécula, retarda
o previene la oxidación de este sustrato. (Castaño Amores & Hernández Benavides,
2018).
7.8.[7.9.] CROMATOGRAFÍA LIQUIDA DE ALTA RESOLUCIÓN (HPLC)
(HPLC de High Performance Liquid Chromatography o Cromatografía Líquida de

Alta Eficiencia): Es uno de los tantos métodos de cromatografía para la separación y
análisis de los componentes químicos de una mezcla más eficaces y más utilizados.
Básicamente, en este método participan las fases: móvil y estacionaría (inmiscibles entre
sí) y la muestra de interés. La fase móvil es líquida y su función es llevar la muestra a
través de la fase estacionaría, que puede ser sólida o una película líquida soportada en un
27
sólido inerte, gracias a una alta presión. Las distintas fuerzas químicas y físicas que
actúan entre la mezcla a analizar y las dos fases determinan la retención y separación de
cada uno de los componentes de la mezcla. Los componentes con mayor afinidad con la
fase estacionaria se desplazarán con menor velocidad que aquellos que presentan menor
afinidad. Estas diferencias de velocidades dan origen a la separación de los componentes
(Suarez Ospina & Morales Hernández, 2018).
8. METODOLOGÍA
[8.1.] OBTENCIÓN DEL MATERIAL VEGETAL LA MUESTRA
El material vegetal fue proporcionado por la empresa Naturalcos S.A., el cual

consiste en corteza seca de la especie Uncaria tomentosa (Willd DC), conocida
popularmente como “uña de gato”, que va de dimensiones desde 1 cm hasta 20 cm, y
variable en grosor desde 1 mm a 4 mm (ver figura 11). Según la información
proporcionada por la empresa mencionada, este material se encontraba almacenadoa en
previos de sus instalaciones de la zona Rio Seco de la Ciudad de El Alto, cuidando de la
luz y la humedad.
FIGURA 21 Muestra de corteza seca de la especie Uncaria tomentosa de la empresa Naturalcos S.A.
Figura 22. Muestra de corteza seca de la especie Uncaria tomentosa de la empresa Naturalcos
S.A.
28
También fue proporcionadoa por la empresa Naturalcos S.A., 5 litros de extracto
hidro-alcohólico de corteza de Uncaria tTomentosa, que según información
proporcionada esta se obtuvo mediante la maceración de la corteza de la planta por 6
meses, utilizando una solución hidroalcohólica al 70%, en una relación de 50% masa de
corteza, 50% masa de solvente.
8.1.[8.2.] DETERMINACIÓN DEL MEJOR SOLVENTE DE EXTRACCIÓN
8.1.1.[8.2.1.] Obtención de extractos con variación de solvente
En principio se realizóa extracciones variando la composición del solvente entre

Etanol 96º, hidroalcohólicos y agua. Para esto se desmenuzóa la corteza mecánicamente
con tijeras vendimia y luego se llevóa a la moledora que tiene tamiz de 6 mm de
diámetro. A 5 matraces eErlenmeyer, se colocóa a cada unamuestras de 10 g de muestra
molida de uña de gato, se realizapara realizar extracciones por maceración, con 100 mL
de solvente (relación masa de muestra- volumen de solvente 1:10) variando el solvente
con entre Etanol 96º, Etanol 70%, Etanol 50%, Etanol 30% y Agua, para cada extracción
se realizó, durante 48 horas. Posteriormente el extracto líquido se decantóa y se filtraó
con papel filtro grado 6 S/N en embudo de filtración, enseguida y se concentróa en
Rotaevaporador Heindolph 1, a 45°C, y velocidad de rotación 100 rpm con vacío
regulado constantemente; una vez concentrado hasta eliminar el etanol (cuando
condensa solamente agua en el refrigerante y su volumen es 1/3 del inicial
aproximadamente) se vacióía en vasos descartables de plástico, previamente pesados, los
cuales se pusierononen en un refrigerador para congelar por 24 horas y posteriormente
se liofilizarn durante 72 horas, en liofilizador Christ Alpha 1-R LD plus. Para calcular el
rendimiento de la extracción se realizaó estas extracciones por triplicado.
FIGURA 23 Muestra de corteza de “uña de gato” molida a tamiz de 6 mm.
29
Figura 24. Muestra de corteza de “uña de gato” molida a tamiz de 6 mm.
Por otra parte, para analizar y comparar el extracto obtenido por la empresa
Naturalcos S.A., con los extractos obtenidos en el presente trabajo, se liofilizase lo
sometió a un proceso de eliminación de solvente y se determinóa el rendimiento del
extracto líquido proporcionado por dicha empresa. Así, Aa partir de 5 litros del extracto
hidro alcohólico de corteza de Uncaria tTomentosa (Willd DC), proporcionado por la
empresa “Naturalcos SA.” (tiempo de maceración 6 meses, utilizando etanol al 70%, en
una relación de 50% solido, 50% liquido), se tomóa una alícuota de 100 mL , que se
guarda como testigo, el resto fuees concentrado en rotaevaporador PXG-5, a 45°C,
velocidad de rotación 30 rpm y vacío regulado constantemente, hasta eliminar los restos
de etanol, hecho que se observó cuando condensa agua en el refrigerante y el volumen
disminuye hasta una tercera parte aproximadamente; este concentrado se vacióía en
vasos descartables de plástico para congelarlos en refrigerador por 24 horas y
posteriormente se liofilizóa en liofilizador Christ Alpha 1-R LD plus, durante 72 horas,
obteniéndose el extracto liofilizado denominado UGNAT, para el presente trabajo. El
rendimiento de este extracto se midió tomando 3 alícuotas, de 100mL cada una, del
extracto inicial, en balones pesados previamente, realizando en estos el mismo
procedimiento de concentración, congelación y liofilización., pero a diferencia del
anterior la concentración se realizó en rotaevaporador Heindolph 1 por ser alícuotas
relativamente de poca cantidad.
30
8.1.2.[8.2.2.] Realización de pruebas fitoquímicas preliminares
Se realizóa las pruebas fitoquímicas preliminares a los diferentes extractos

obtenidos, para determinar los metabolitos secundarios de interés que pudieran estar
presentes en estos.
Se empleóa el método de cribado fitoquímico de Dominguez 1973 (Domínguez X.

A., 1973), modificado por Martinez et al. 2008 (Martínez, Valencia, Jiménez, Mesa, &
Galeano, 2008). Se realizaron los ensayos de Shinoda y Cloruro férrico que, indican la
presencia de compuestos flavonoidicos y fenólicos respecivamente:
Reacción del FeCl3: A 1 ml de la muestra se le agregan 3 gotas de FeCl 3 al 1 %

acuoso. la aparición de colores o precipitados verdes, azules o negros e s prueba positiva
de la presencia de taninos y compuestos fenólicos en la muestra.
Reacción de Shinoda: A un tubo con 1mL de extracto diluido se le agrega un

trocito de viruta de magnesio amalgamado y cinco gotas de ácido clorhídrico
concentrado. L a aparición de colores que van del rojo a magenta indica la presencia de
una flavona o dihidroflavonol.
8.1.3.[8.2.3.] Realización de cromatografía en capa fina (TLC)
Para verificar cualitativa y semicuantitativamente la composición de los extractos

se realizó placas cromatográficas (TLC) de silica gel 60 F254 de 5 cm de altura, con
base de aluminio. El sembrado de la muestra se realizóa a medio centímetro de la base, a
una concentración de aproximadamente de 3mg/mL, la misma cantidad cada muestra
(medida con la altura fija de un mismo capilar).
Solventes: Se utilizó como fase móvil: Éter de petróleo, Acetato de Etilo, Metanol,
etanol, agua y mezclas de estos, buscando el eluyente y fase estacionaria idóneos para
los diferentes extractos. Para una mejor identificación, la cromatografía debe repetirsese
repitió en el sistema de solventes flavonoide específico para flavonoides: acetato de
etilo-ácido fórmico-ácido acético glacial-agua (100: 11: 11: 26) (Wagner & Bladt,
1996).
31
Los cromatogramas desarrollados se inspeccionaron primero con luz UV-254 y
UV-365 nm.
 UV-254nm: Se detectan zonas sin fluorescencia. La extinción es causada por

todos los compuestos con dobles enlaces conjugados. Por ejemplo,
antraglucósidos, arbutina, cumarinas, flavonoides, propilfenoles en aceites
esenciales, algunos tipos de alcaloides como alcaloides indol, isoquinolina y
quinolina.
 UV-365nm: Se detectan zonas fluorescentes: todos los antraglucósidos,

cumarinas, flavonoides, ácidos fenolcarboxílicos; algunos tipos de alcaloides
(por ejemplo, alcaloides de China, Rauwolfia, Ipecacuanha). No se observa
fluorescencia: glucósidos cardíacos, principios amargos, saponinas,
terpenoides en aceites esenciales, valepotriatos.
Sin tratamiento químico, los flavonoides muestran una extinción clara de la

fluorescencia en UV-254 nm y una fluorescencia amarilla, verde o azul débil en UV-
365nm.
Después de una inspección preliminar con luz UV-254 y UV-365nm, cada

cromatograma se analiza mediante revelado con un reactivo de grupo apropiado. Este
tiene que reaccionar con los productos adsorbidos proporcionando compuestos
coloreados. Para esto se utilizó principalmente:
 Ácido sulfúrico. Uso: General, especialmente cuando los demás no funcionan. Re-
quiere calefacción. Preparación: 100 ml de ácido sulfúrico concentrado se añade len-
tamente a 100 ml de agua a 0 ° C.
 Cloruro férrico. Uso en revelación de fenoles y compuestos enolizables. Preparación:

1 g de cloruro férrico se disuelve en 100 mL de Etanol.
 Reactivo dragendorff. Para la revelación de alcaloides. Preparación: En un matraz

Erlenmeyer de 125 mL disolver 8 g de nitrato de bismuto pentahidratado con 20 mL
de ácido nítrico (cuya densidad sea 1.18g/mL, al 30%). En otro matraz colocar 27.2g
de yoduro de potasio con 50 mL de agua. Mezclar las dos soluciones y dejarlas en
32
reposo durante 24 horas. -decantar la solución (para separar los residuos de cristales
de nitrato de potasio) y aforar con agua a 100mL.
8.2.[8.3.] DETERMINACIÓN DEL MEJOR TIEMPO DE EXTRACCIÓN
Una vez establecido el mejor solvente de extracción de compuestos fenólicos, se

realizóa extracciones a diferentes tiempos para determinar el mejor tiempo de
maceración. Para esto se desmenuza la corteza mecánicamente con tijeras vendimia y
luego se lleva a moledora que tiene tamiz de 6 mm de diámetro. A 10 g de muestra se
realiza larepitió el proceso de extracción por maceración, con 100 mL de solvente etanol
al 70%, variando los tiempos de extracción, de 3hrs, 12hrs, 24hrs y 72hrs.
Posteriormente el extracto líquido se decantóa y, se filtró y se sometió al mismo proceso
de eliminación de solventes descrito anteriormente.a con papel filtro grado 6 S/N en
embudo de filtración, enseguida y se concentra en rotaevaporador Heindolph 1, a 45°C,
y velocidad de rotación 100 rpm con vacío regulado constantemente; una vez
concentrado hasta eliminar el etanol (cuando condensa solamente agua en el
refrigerante) se vacía en vasos descartables de plástico, previamente pesados, los cuales
se ponen en refrigerador para congelar por 24 horas y posteriormente se liofilizan
durante 72 horas, en liofilizador Christ Alpha 1-R LD plus. Para calcular el rendimiento
de la extracción se realizaó estos procesos por triplicado.
Para analizar y comparar la composición cualitativa de metabolitos de estos

extractos obtenidos a diferentes tiempos, se realizóa pruebas fitoquímicas preliminares
para compuestos fenólicos y placas de cromatografía en capa fina (TLC) de estos,
siguiendo losel mismos procedimiento descritos en las secciones 8.2.2. y 8.2.3.,
respectivamente.
33
[8.4.] OBTENCIÓN DE FRACCIONES MAS CONCENTRADAS EN
COMPUESTOS FENÓLICOS.
[8.6.]
8.2.1.[8.6.1.] Obtención de extracto optimizado
Del mejor extracto, obtenido con solvente y tiempo optimizado (UG7048), se

realizóa unel fraccionamiento, mediante extracciones solido-líquido sucesivas, con
solventes de diferente polaridad.
En principio, para este y otros procesos se obtuvoiene una buena cantidad de este
extracto UG7048. Para esto sese desmenuzó la corteza de Uncaria tomentosa
mecánicamente con tijeras vendimia y luego se llevó a moledora que tiene tamiz de
6mm de diámetro, Se realizóa la extracción por maceración de 2000 g de muestra
molida, con 20 litros de etanol al 70%, durante 48 horas, en galones de plástico,
posteriormente se decantóa, mediante coladores en la boca del galón, sin exprimir el
residuo; luego del cual, el extracto líquido se filtra con papel filtro grado 6 S/N, del
extracto, se guardóa una alícuota de 100 mL, como testigo y se concentraó el resto en
rotaevaporador PXG-5, a 45°C, velocidad de rotación 30 rpm y vacío regulado
constantemente, durante la concentración también muestra mucha efervescencia. Una
vez concentrado hasta eliminar el etanol (cuando condensa solamente agua en el
refrigerante) se vacióía en vasos descartables de plástico y se ponen en refrigerador para
congelar en un refrigerador durante 24 h y posteriormente se liofilizanliofilizarlo durante
72 horas, en liofilizador Christ Alpha 1-R LD plus.
8.2.2.[8.6.2.] Fraccionamiento del extracto optimizado
Se tomóa una muestra de 100 g del extracto obtenido (UG7048), en el cual se

realizóa una extracción solido-líquido con 1000 mL de éter de petróleo 20-40 (relación
masa de muestra-volumen de solvente 1:10), durante tres horas, al inicio de esta
maceración se ayuda la disolución con ultrasonido por 5 min, luego de las 3 horas, se
separóa mediante filtración con papel filtro grado 6 S/N, el extracto líquido se
concentróa en rotaevaporador Hheildolph 1, luego el concentrado se secóa en estufa a
34
45°C; el residuo sólido se secóa también, en estufa a 45ºC por 48 h., Lluego, del cual se
realizóa una segunda extracción con 1000 mL de acetato de etilo por 3 horas, llevando
también en un inicio 5 min a ultrasonido, luego de las tres horas el extracto líquido fuees
filtrado y concentrado en rotaevaporador heildolph 1 y, el concentrado secado en estufa
a 45°C;. el residuo sólido también esfue secado en estufa a 45ºC por 48h.,
Pposteriormente, se realizóa una nueva extracción a este con 1000 mL de acetato de
etilo-etanol 80:20 (v/v) por 3 horas, inicialmente también diluyendo con ayuda de
ultrasonido durante 5 min, luego de las 3 horas se filtróa y se concentraó el líquido en
rotaevaporador heildolph 1, y el concentrado se secóa en estufa a 45°C; el residuo final
se dejóa secando en estufa por 48 horas. Para el cálculo de rendimiento de este proceso
se realizóa el mismo procedimiento con tres muestras de extracto de 5g cada una,
conservando la relación masa de muestra-volumen de disolvente 1:10.
8.2.3.[8.6.3.] Fraccionamiento de extracto de la empresa Naturalcos S.A.
Para realizar además una comparación con el extracto obtenido por la empresa
Naturalcos S.A., se realizóa el mismo procedimiento de fraccionamiento (Sección
8.4.2.), por triplicado, al extracto que se liofilizó anteriormente (UGNAT).
8.2.4.[8.6.4.] Realización de pruebas fitoquímicas preliminares
Se realizóa las pruebas fitoquímicas preliminares a las diferentes fracciones

extractos obtenidaos, para determinar los metabolitos secundarios de interés que
pudieran estar presentes en estos.
Se empleóa el método de cribado fitoquímico de Dominguez 1973 (Domínguez X.

A., 1973), modificado por Martinez et al. 2008 (Martínez, Valencia, Jiménez, Mesa, &
Galeano, 2008). Se realizaron los siguientes ensayos y procedimientos por duplicado. En
los siguientes apartados se describen las pruebas utilizadas para la determinación de los
tipos de metabolitos secundarios especificados.
8.2.4.1.[8.6.4.1.] Reconocimiento de alcaloides

Una porción de extracto, una punta de espátula, se disuelve en 2 mL de ácido
clorhídrico al 50%, se agita y se filltra, hasta que el filtrado sea transparente, se toma
alícuotas del filtrado para cada ensayo. Colocar en tubos de ensayo 2 ml de filtrado
35
ácido frío. Añadir a cada uno 2 gotas de los reactivos de Dragendorff, Mayer, Wagner y
Hager. Si se observa turbidez o precipitados en por lo menos 3 tubos, se considera que la
muestra contiene alcaloides. Nota: antes de realizar el ensayo con el extracto, se ensaya
con un estándar de cafeína
Preparado de reactivos:
Reactivo Ddragendorff: En un matraz Erlenmeyer de 125 mL disolver 8 g de

nitrato de bismuto pentahidratado con 20 mL de ácido nítrico (cuya densidad sea
1.18g/mL, al 30%). En otro matraz colocar 27.2g de yoduro de potasio con 50 mL de
agua. Mezclar las dos soluciones y dejarlas en reposo durante 24 horas. -decantar la
solución (para separar los residuos de cristales de nitrato de potasio) y aforar con agua a
100mL.
Reactivo de Mayer: En un matraz Erlenmeyer de 125mL, disolver 1.36g de cloruro

mercúrico con 60mL de agua. En otro matraz de la misma capacidad, disolver en agua
5g de yoduro de potasio. Mezclar las soluciones y aforar a 100mL con agua destilada.
Reactivo de Wagner: En un matraz volumétrico de 100mL, disolver 1.27g de yodo

(resublimado) y 2g de yoduro de potasio en 20mL de agua; aforar la solución con 100
mL de agua.
Reactivo de Hager: Solución saturada de ácido pícrico en agua.
8.2.4.2.[8.6.4.2.] Reconocimiento de taninos y compuestos fenólicos

Se disuelve en agua una porción del extracto, se filtra o centrifuga, y se toman
alícuotas de 1mL para las pruebas.
Reacción del FeCl3: A 1 ml de la muestra se le agregan 3 gotas de FeCl3 al 1 %

acuoso. la aparición de colores o precipitados verdes, azules o negros es prueba positiva
de la presencia de compuestos fenólicos y/o taninos en la muestra.
Reacción con gelatina: A 1 ml de la muestra se le agregan 10 gotas de una

solución acuosa de gelatina al 0,5 %, en caliente. La formación de precipitado al agregar
el reactivo de gelatina es prueba positiva de la presencia de taninos en la muestra.
Reacción con acetato de plomo: A unos 2 ml del extracto se adiciona, gota a gota,
solución de acetato de plomo al 10%; aparece un precipitado de color gris claro. Esta
36
reacción nos indica que pueden estar presentes: ácidos orgánicos, tanoides, proteínas y
mucinas que precipitan con el acetato. Turbidez o precipitado blanco de taninos.
8.2.4.3.[8.6.4.3.] Reconocimiento de flavonoides

Reacción con vapores de amoniaco: Una porción del extracto de 10mg se diluye
con suficiente etanol hasta verse transparente. Se impregna en una tira de papel filtro con
el extracto diluido y se deja secar a temperatura ambiente, posteriormente a la acción de
vapores de amoniaco durante 2 minutos. La aparición de una coloración amarilla ocre se
considera positiva.
Reacción de Shinoda: A un tubo con 1mL de extracto diluido se le agrega un

trocito de viruta de magnesio amalgamado y cinco gotas de ácido clorhídrico
concentrado. L a aparición de colores que van del rojo a magenta indica la presencia de
una flavona o dihidroflavonol.
Reacción de Pew´s: A un tubo con el extracto diluido se le agrega polvo de zinc y

unas gotas de ácido clorhídrico 5N. sólo los dihidroflavonoles reaccionan para dar
colores que van del rojo purpura al rojo cereza. Flavononas, dihidrochalconas y otros
flavonoides dan coloración rosa o café.
[8.6.4.4.] Ensayo para lLeucoantocianidinas

Colocar unos 2 ml del filtrado en un tubo de ensayo. Añadir 1 ml de ácido
clorhídrico concentrado. Calentar en baño de agua hirviendo durante 15 minutos. La
aparición de coloraciones rojas es prueba positiva de la existencia de
leucoantocianidinas en la muestra.
[8.6.4.5.] Ensayo para cCardiotónicos

Reacción de Kedde: En un tubo de ensayo colocar 1 ml de extracto diluido. Añadir
0.5 ml de Reactivo de Kedde (mezclar 1 ml de solución A con 1 ml de solución B para
preparar este reactivo antes de su uso). La aparición de coloraciones violetas o púrpuras
es prueba positiva de la existencia de cardiotónicos en la muestra.
Reactivo de Kedde: A) 5ml de solución etanólica de ácido 3,5-dinitrobemzoico al

3% preparado recientemente. B) 5ml de NaOH 2 M.
37
8.2.4.4.[8.6.4.6.] Reconocimiento de Antocianinas
En un tubo de ensayo colocar 2 ml de filtrado acuoso. Añadir 1 ml de NaOH
diluido. Observar el color formado. En otro tubo de ensayo colocar otros 2 ml de
filtrado. Añadir unas 6 gotas de un ácido mineral diluido. Observar el color formado. -
Las antocianinas se reconocen por producir diferentes colores a diferentes pH.
8.2.4.5.[8.6.4.7.] Ensayo para saponinas

Ensayo de Espuma: A una porción de extracto en un tubo de ensayo,
aproximadamente 10 mg, se disuelve con agua caliente, a 40ºC, dejamos reposar por 15
a 30 min, luego agitar manualmente por 1 o 2min. La formación de una espuma
abundante y estable es prueba presuntiva de la presencia de saponinas en la muestra.
8.2.4.6.[8.6.4.8.] Ensayo para Triterpenoides y/o esteroides

En un tubo de ensayo limpio y completamente seco, colocar 1 ml de filtrado
orgánico (Acetato de etilo). Añadir 1 ml de anhídrido acético. Por la pared del tubo y
con mucha precaución, dejar resbalar 1-2 gotas de ácido sulfúrico concentrado. La
formación de colores azules, violetas, rojos o verdes es prueba positiva de que la
muestra contiene Esteroides y/o Triterpenoides.
8.2.4.7.[8.6.4.9.] Ensayo para Azucares reductores

Prueba de Fehling: Se coloca en un tubo de ensayo iguales volúmenes una
solución A (8.66 g de sulfato de cobre pentahidratado disuelto en agua y aforado a 125
mL) y de una solución B (15 g de NaOH y 43.25 g de tartrato de sodio- potasio disueltos
en agua y aforado a 125 mL). Agitar y calentar a ebullición (aproximadamente 1 min).
Se agrega el compuesto, se calienta 10 minutos y si precipita primero el cobre el
compuesto es reductor (se reduce el cobre se forma un precipitado de Cu2O de color
rojizo), la prueba se considera positiva.
[8.6.4.10.] Proteínas-aminogrupos amino

2 gotas de solución de ninhidrina (1 g de ninhidrina en 10 ml de acetona), son
añadidos a 2 mL de filtrado acuoso. Un color purpura indica la presencia de
aminoácidos.
38
Para cada una de las pruebas la calificación asignada al término de cada prueba fue
la siguiente:
+ + +: Reacción muy evidente.

+ +: Reacción evidente.
+: Reacción poco evidente pero aceptable.
-: No hubo reacción, reacción negativa.
Para realizar un análisis y determinación de la mejor fracción, ricao en compuestos

fenólicos, además se realizóa placas cromatográficas en capa fina, con los mismos
procedimientos de la sección 8.2.3.
[8.7.] CROMATOGRAFÍA POR EXCLUSIÓN CON SEPHADEX® LH-20
De acuerdo al análisis de compuestos fenólicos realizado, la fracción con mayor

contenido de compuestos fenólicos fue la fracción de acetato de etilo obtenida de
UG7048. A laCon esta fracción de acetato de etilo obtenida de UG7048, se realizóa una
columna cromatográfica por exclusión molecular Sephadex LH-20, con el fin de
establecer una mejor caracterización de los constituyentes de esta fracción.
200mg de extracto, fracción acetato de etilo de UG7048, son disueltos en 4 mL de

etanol, con ultrasonido y temperatura de 40 ºC por 10 min, y filtrada con filtro para
jeringas PTFE de 0,2µm de tamaño de poro; El extracto filtrado es sembradao en la
columna de vidrio que contiene Ssephadex LH 20 de 80 cm de longitud por 2,3 cm de
diámetro, La elución se realizó con 500mL de etanol.
8.3.[8.8.] ANÁLISIS POR CROMATOGRAFÍA DE ALTA RESOLUCIÓN

(HPLC)
Las fracciones obtenidas de la columna sephadex realizada, denominadas: FA-S1,

FA-S2, FA-S3 y FA-S4 respectivamente; fueron analizadas por Cromatógrafo Líquido
de Alta Resolución (HPLC), Agilent 1100 series, que comprende de un desgasificador
(G1322), un sistema de bomba cuaternario (Quat PumpG1311A), un horno de columna
(Colcom-G1316A), columna eclipse de fase reversa Agilent plus C18 (250 x 4.6 mm) 5
39
µm protegida por una precolumna de 10 mm, detector DAD (190-950 nm). La fase
móvil se preparó a partir de metanol de calidad HPLC y agua desionizada, acidificada
con ácido fórmico al 0.1%, después de filtrar en una membrana de éster de celulosa y se
colocó en un baño desgasificador durante 15 minutos. El método cromatográfico
considera el acondicionamiento previo de la columna con 15% MeOH durante 20
minutos y la elución de las muestras con MeOH / H2O (H2O; HCOOH) en modo
gradiente (15-30% MeOH durante 15 minutos, 30-45% MeOH durante 20 minutos,
MeOH al 45-90% durante 15 minutos, MeOH al 900-100% durante 10 minutos y MeOH
al 100- 15% durante 5 minutos durante un total de 65 minutos). Entre los análisis, se
utilizó un período de equilibrio de 15 minutos con MeOH al 15%. El flujo fue de 1,0
ml / minuto, el volumen de inyección fue de 10 μl y la temperatura del horno fue de 25
ºC. El detector de red de diodos se programó para adquirir datos en el rango de longitud
de onda de 190 a 600 nm y 88 barridos / s. La monitorización se realizó a 280 nm (canal
A) y 320 nm (canal B).
Las muestras se diluyeron adecuadamente con metanol (grado HPLC filtrado), con
el objetivo de obtener concentraciones finales de 10.0 mg / mL, todas las muestras se
llevaron al baño de ultrasonidos durante 10 minutos y se filtraron a través de filtros para
jeringas PTFE de 0,2µm de tamaño de poro, antes de ser inyectadas.
Para la verificación de compuestos fenólicos, se realizó cromatografía de dos

compuestos estándar, epicatequina y ácido cafeico, preparados a una concentración de
0,2mg/mL en metanol, estos se llevaron al baño de ultrasonidos hasta su completa
disolución y se filtró a través de filtros de jeringa PTFE de 0,2µm de tamaño de poro
antes de ser inyectados.
8.4.[8.9.] DETERMINACIÓN DE LA CONCENTRACIÓN DE

EQUIVALENTES DE EPICATEQUINA EN LOS EXTRACTOS
MEDIANTE ESPECTROFOTOMETRIA UV-VIS.
CODIGO MUESTRA
UG-NAT Extracto de Naturalcos S.A.
UG-7048 Extracto obtenido con etanol al 70%, en 48 horas.
UG-50 Extracto obtenido con etanol 50%, en 48 horas.
UG-30 Extracto obtenido con etanol 30%, en 48 horas.
40
UG-AC Extracto Acuoso, en 48 horas.
UG-96 Extracto Etanólico 96º, en 48 horas.
UG-3h Extracto obtenido en 3 horas de maceración con etanol al 70%
NAT-FA Fracción con Acetato de Etilo de extracto Naturalcos S.A.
Fracción con Acetato de Etilo – Etanol (80:20) de extracto
NAT-FAE Naturalcos S.A.
NAT-RES Fracción Residuo de extracto Naturalcos S.A.
FA Fracción con Acetato de Etilo de UG-7048
FAE Fracción con Acetato de Etilo – Etanol (80:20) de UG-7048
FR Fracción Residuo de UG-7048
FA-S1 Fracción 1 Acetato de Etilo-Sephadex
TABLA 1 Códigos de extractos y fracciones de Uncaria tomentosa, obtenidas.
Para la medición de la concentración de equivalentes de epicatequina actividad, se

preparó los extractos y fracciones UG-NAT, UG-7048, UG-50, UG-30, UG-AC, UG-96,
UG-3h, UG-12h, UG-24h, UG-48h, UG-72h, NAT-FA, NAT-FAE NAT-FR, FA, FAE y
FR una concentración 2.5 mg/mL en Etanol 96º y las fracciones FA-S1, FA-S2, FA-S3 y
FA-S4 a una concentración de 1.0 mg/mL (códigos de extractos y fracciones según tabla
1); de las primeras se toma una alícuota de 100 µL y son aforados en matraz de 5mL con
etanol 96º, y de las soluciones de FA-S1, FA-S2, FA-S3 y FA-S4 se toman alícuotas de
250 µL y son aforados en matraz de 5mL con etanol 96º.
Las muestras diluidas a 50 mg/L, se midieron la absorbancia a 278 nm en

Espectrofotómetro UV-Vis Spectroquant® Pharo 300 M. Los análisis se realizaron por
duplicado y el resultado se expresó como valores promedio y su desviación estándar
(DS). La concentración se reportó como mg Equivalentes de Epicatequina/g de extracto
(mgEE/g).
Para la determinación de la concentración de Equivalentes de Epicatequina se

construyó una curva del estándar de epicatequina a diferentes concentraciones: 10.0
mg/L, 20.0 mg/L, 25.0 mg/L, 30.0 mg/L y 40.0 mg/L en las mismas condiciones
mencionado anteriormente, por triplicado. La curva elaborada sigue la ecuación y =
41
0.0185x – 0.0265 (R2=0.9912), el coeficiente de correlación muestra una buena
linealidad.
La concentración de Equivalentes de Epicatequina se estimó a partir de la curva de

calibración del estándar de epicatequina.
y = 0.0185x - 0.0265
Donde:
y = Absorbancia a 765 nm
x = Concentración de Equivalentes de Epicatequina (EE)
A partir de la ecuación se determinó EE, con la siguiente fórmula:
y +0.0265
x=
0.0185
FIGURA 25 Concentración (mg/L) de Epicatequina vs Absorbancia
0.8
0.7
f(x) = 0.0184733333333333 x − 0.0264999999999996
0.6 R² = 0.991205588797877
0.5
Absorbancia
0.4
0.3
0.2
0.1
0
5 10 15 20 25 30 35 40 45
Concentración de Epicatequina
[mg/L]
8.5.[8.10.] DETERMINACIÓN DEL CONTENIDO FENÓLICO TOTAL POR

FOLIN CIOCALTEU DE LOS EXTRACTOS Y FRACCIONES
El contenido fenólico total de las muestras UGNAT, UG-7048, UG-50, UG-30,

UG-AC, UG-96, FA, FAE, FR, FA-S1, FA-S2 y FA-S3, se determinó
colorimétricamente mediante el método de Folin-Ciocalteu con ligeras modificaciones
42
en base a la metodología de Ikumawoyi, V. et al. (2017) (Ikumawoyi, Agbaje, &
Awodele, 2017).
Las muestras se pesaron y se disolvieron en etanol (1.0 mg/mL de UGNAT, UG-

7048, UG-50, UG-30, UG-AC, UG-96, FR, FA-S1, 1.2 mg/mL para las muestras FA,
FAE, FA-S2 y 3.1 mg/mL para la muestra FA-S3). Se mezcló 0.5 mL de muestra diluida
(0.25 mL de las muestras UG-NAT, UG-7048, UG-50, UG-30, UG-AC, UG-96, FA,
FAE, FR, FA-S1, FA-S2 y 0.10 mL de la muestra FA-S3, se completó cada muestra con
etanol a un volumen de 0.5 mL) con 2.5 mL de reactivo de Folin-Ciocalteu (2N, 1:10
v/v) y 2.0 mL de solución de carbonato de sodio al 7.5 % (m/v). Se agitaron las muestras
en vórtex durante 15 s y se incubó durante 30 min a 40°C para el desarrollo del color.
Luego se midió la absorbancia a 765 nm. Los análisis se realizaron por triplicado y el
resultado se expresó como valores promedio y su desviación estándar (DS). Los
resultados se expresan como mg de equivalentes de ácido gálico/g de extracto seco
(mgEAG/g). Para la determinación del contenido fenólico total, se construyó una curva
de calibración con ácido gálico a diferentes concentraciones: 5, 10, 20, 30, 40, 50, 60, 70
y 80 mg/L en las mismas condiciones mencionados anteriormente. La curva elaborada
(Figura 13.) sigue la ecuación y = 0.0116x + 0.0008 (R2 =0.9998), el coeficiente de
correlación muestra una buena linealidad.
FIGURA 13 Curva de calibración del Ácido gálico
1
0.9
f(x) = 0.0115586964683797 x + 0.000842578904141578
0.8 R² = 0.999776067518415
0.7
Absorbancia
0.6
0.5
0.4
0.3
0.2
0.1
0
0.0 10.0 20.0 30.0 40.0 50.0 60.0 70.0 80.0 90.0
Concentración
Ácido gálico (mg/L)
Se estimó el contenido fenólico total a partir de la curva de calibración de ácido

gálico.
43
y = 0.0116x + 0.0008
Donde:
y = Absorbancia a 765 nm
x = mg EAG (Equivalentes de ácido gálico) /L de muestra
A partir de la ecuación se determinó los mg EGA, con la siguiente fórmula:
y−0.0008
x=
0.0116
8.6.[8.11.] DETERMINACIÓN DE LA ACTIVIDAD ANTIOXIDANTE POR

EL MÉTODO ABTS DE LOS EXTRACTOS Y FRACCIONES
La metodología empleada se basó en lo descrito por Arituluk et al. (2016)

(Arituluk, Çankaya, & Özkan, 2016) y Shivashankar et al. (2015) (Shivashankar,
Rajeshwari, Nagananda, Rajath, & Chandan, 2015) con ligeras modificaciones. El
radical catión ABTS •+¿¿ se obtiene tras la reacción de ABTS (7 mM) con persulfato (2.45
mM), se almacenó en oscuridad a temperatura ambiente durante 12-16 h. El día del
análisis, la solución ABTS •+¿¿ se diluyó con etanol a una absorbancia de 0.70 (± 0.02) a
734 nm.
Para la medición de la actividad antioxidante, se preparó los extractos y fracciones

a diferentes concentraciones (1.0 mg/mL de UG-NAT, UG-7048, UG-50, UG-30, UG-
AC, UG-96, FR, FA-S1, 1.2 mg/mL para las muestras FA, FAE, FA-S2 y 3.1 mg/mL
para la muestra FA-S3), se agitaron 0.833 mL de muestras diluidas (0.050 mL de cada
muestra y el volumen se ajustó con etanol a 0.833 mL) con 4.167 mL de la solución de
•+¿¿
ABTS , se agitó durante 15 s en un vórtex y se dejó reposar en oscuridad durante 30
min a temperatura ambiente. Se registró la absorbancia a 734 nm. Los análisis se
realizaron por triplicado y el resultado se expresó como valores promedio y su
desviación estándar (DS). La capacidad antioxidante se reportó como equivalentes µM
Trolox/g de extracto (ET/g).
Para la determinación de la actividad antioxidante equivalente de Trolox, se

construyó una curva estándar del antioxidante de referencia, Trolox, a diferentes
concentraciones: 10, 20, 30, 40, 50, 60, 70, 80, 90 y 100 µM en las mismas condiciones
44
mencionado anteriormente. La curva elaborada sigue la ecuación y = 0.9688x – 1.3232
(R2=0.9994), el coeficiente de correlación muestra una buena linealidad.
FIGURA 14 Concentración (µM) vs % de Inhibición del trolox por el método ABTS
100.0
90.0 f(x) = 0.968839301244937 x − 1.32321149019706
R² = 0.999404859305038
80.0
70.0
% de Inhibición
60.0
50.0
40.0
30.0
20.0
10.0
0.0
0.0 20.0 40.0 60.0 80.0 100.0 120.0
Concentración
Trolox (µM)
El porcentaje de inhibición se calculó utilizando la siguiente fórmula:
( A blanco− A muestra)
% de Inhibición= × 100
A blanco
Donde:
Ablanco = Absorbancia del blanco (etanol en lugar de la muestra)

Amuestra = Absorbancia de las muestras (extractos o fracciones)
Se estimó la cantidad Trolox a partir de la curva estándar de Trolox.
y = 0.9688x – 1.3232
Donde:
y = Porcentaje de Inhibición
x = μmol (µM) ET (Equivalente de Trolox)
A partir de la ecuación se determinó los µmol ET, con la siguiente fórmula:
y +1.3232
x=
0.9688
45
[9.] RESULTADOS Y DISCUSCIONES
8.7.[9.1.] DETERMINACIÓN DEL MEJOR SOLVENTE DE EXTRACCIÓN
8.7.1.[9.1.1.] Rendimiento en masa del Extracto de Naturalcos S.A.
A partir de 5L de extracto hidro alcohólico, proporcionados por la empresa

Naturalcos S.A. (extraído por maceración con etanol al 70%, 180 días y una relación en
peso 50% sólido y 50% líquido), rinden en total 178.8 g de extracto liofilizado. Las
masas finales de las alícuotas de 100 mL son: de 3.6 g, 3.1 g y 3.6 g; el segundo dato se
omite para los cálculos, pues al concentrar este sufrió pérdidas por la efervescencia en el
rotaevaporador.
Entonces a partir de las alícuotas:
100 mL ----------→ 3.6 g
5000 mL ------------→ x
5000 mL x 3.6 g
X= =180 g
100 mL
Lo cual se aproxima con la cantidad de extracto seco total obtenido (178.8g).
Podemos enunciar el rendimiento en masa, tomando en cuenta que la relación de la

extracción fue 50% sólido y 50% líquido y la densidad de la solución de etanol al 70%
(0.848 g/mL), aproximando que se recupera el total de fase líquida de la extracción.
Podemos calcular que la masa de corteza utilizada para obtener 5 litros de extracto
es:
1 mL ---------→ 0.848 g
5000 mL ---------→ X
5000 mL x 0,848 g
X= =4240 g
1 mL
46
4240g de solución de etanol 70% que, según el proceso es igual a la masa de
muestra (corteza) utilizada.
Si, de los 5L se obtuvo 178.8 g de extracto, el rendimiento es:
178.8 g de extracto
×100=4.22 %
4240 g de corteza
8.7.2.[9.1.2.] Rendimiento de las extracciones con variación de solventes
Mediante las extracciones realizadas variando el solvente se obtiene los siguientes

resultados mostrados en la tabla 2, el rendimiento de las extracciones realizadas en
laboratorio se calculó en base a la masa promedio de extracto obtenido con relación a la
masa de corteza utilizada.
TABLA 2 Rendimientos de extracción en corteza de U.ncaria tomentosa con diferentes solventes.
Solventes Masa de muestra ( Volumen Masas de Promedio de Rendimiento

utilizados Corteza) de extractos masa de de extracción
[g] extracto obtenidas extracto en base a la
obtenido [g] [g]obtenido corteza
[mL]
Etanol a 10,00.0000 71 0.8532 0.8152 ± 8.152
70% 64 0.7637 0.05463 %
69 0.83288
Etanol a 10,.0000 66 0.7452 0.7377 ± 7.377
50% 68 0.7651 0.0319 %
63 0.7027
Etanol a 10,.0000 68 0.5420 0.5271± 5.271
30% 66 0.5291 0.0160 %
64 0.5101
Agua 10.0000 70 0.4698 0.4513 ± 4.513
63 0.4208 0.0266 %
69 0.4632
Etanol 96º 10.0000 70 0.7290 0.7101± 7.101
GL 65 0.6732 0.0319 %
69 0.7280
Extracto 84.8 g* 100 3.60 3.60 4.25%
de 100 3.60
Naturalcos
S.A.
TABLA 3 Rendimientos de extracción en corteza de Uncaria tomentosa con diferentes solventes.
47
En la tabla 2 se puede observar claramente que el solvente que proporciona un
mejor rendimiento de extracción es de etanol al 70%, que tiene la mejor proporción entre
etanol y agua para extraer los metabolitos de la corteza de U.Uncaria tomentosa, y el
extracto de la empresa Naturalcos tiene el más bajo rendimiento, aunque en este caso, el
solvente utilizado es de la misma naturaleza (Etanol al 70%), la relación masa de
muestra-solvente es 1:1 (p/p), mientras que la de la extracción en laboratorio es 1:10
(p/v), por lo tanto utilizando más volumen de solvente el rendimiento es mayor.
También cabe señalar que el rendimiento de extracción de la empresa Naturalcos S.A. se
realizó tomando alícuotas de 100mL de extracto líquido, mientras que los demás
procesos implican 100mL de solvente para extracción de 10 g de corteza, luego el
filtrado obtenido es de 60 a 70 ml como se observa en la tabla 2.
8.7.3.[9.1.3.] Pruebas fitoquímicas preliminares
Para comprobar la presencia de los metabolitos de interés se realiza pruebas

fitoquímicas preliminares, específicamente las pruebas de Shinoda y cloruro férrico, los
cuales son reacciones para flavonoides y fenólicos respectivamente, con los siguientes
resultados:
Tabla 4. Pruebas fitoquímicas para compuestos fenólicos a extractos de corteza de Uncaria
tomentosa obtenidos con diferentes solventes.
Extractos Prueba de Shinoda Prueba de Cloruro

FérricoFeCl3
Con etanol a 70% ++ +++
48
Con agua ++ +++
Con etanol 96º GL ++ +++
De Naturalcos SA. ++ +++
TABLA 5 Pruebas fitoquímicas para compuestos fenólicos a extractos de corteza de Uncaria tomentosa
obtenidos con diferentes solventes.
Estas pruebas se realizaros todos a la misma concentración, y como se observa

todos los extractos presentan compuestos flavonoidicos y fenólicos aproximadamente en
la misma proporción.
[9.1.4.] Cromatografía en capa fina (TLC)
Para verificar cualitativa y semi-cuantitativamente la composición de los extractos

se realizó las siguientes placas cromatográficas:
Tabla 4.FIGURA 26 Placas cromatográficas de extractos de Uncaria tTomentosa sembrados a la
concentración de 3000ppm.
Eluyente Vista de Vista de Placa Placa Placa

la placa en UV la placa en UV revelada con revelada con revelada con
(254nm) (365nm) H2SO4 10% FeCl3 5%
Reactivo
Dargendorff
Acetato de
etilo-
metanol
90:10
49
Acetato de
etilo- Ac.
fórmico-
Ác. acético
-Agua
(100:11:11:
26)
1. Extracto etanólico 96º GL.

2. Extracto etanólico 70%, proporcionado por la empresa.
3. Extracto etanólico 70%
6. Extracto acuoso
C. Muestra estándar cafeína
FIGURA 27 Placas cromatográficas de extractos de Uncaria Tomentosa sembrados a la concentración de
3000ppm.
Se observa en la figura 14Tabla 4, que el mejor eluyente para cromatografía en

capa fina para extractos de Uncaria tomentosa es el propuesto por Wagner y Bladt,
1996, acetato de etilo-ácido fórmico-ácido acético glacial-agua (100: 11: 11: 26). En la
observación con luz UV-254nm se detectan una gran variedad de zonas
extintascompuestos de fluorescencia, lo que nos indica que contiene muchos compuestos
con dobles enlaces conjugados, entre ellos probablemente compuestos fenólicos. Con
UV-365nm se detectan zonas fluorescentes que nos indican probablemente la presencia
de antraglucósidos, cumarinas, flavonoides, ácidos fenolcarboxílicos y algunos tipos de
alcaloides, pero en poca cantidad. En el revelado con Ácido sulfúrico también nos
muestran una amplia variedad de compuestos entre ellos compuestos fenólicos, que se
muestran de color amarillo a café generalmente. Más claramente se observan los
compuestos fenólicos en el revelado con cloruro férrico, que son relativamente polares,
pues con la fase móvil acetato de etilo-metanol 90:10, no llegan a desplazarse, entre
estos se observa dos compuestos mayoritarios. En el revelado con reactivo Dragendorff
no se logra distinguir compuestos alcaloides, solo se observa el estándar de cafeína
sembrado como referencia, se utilizó este compuesto como referencia porque de acuerdo
a datos bibliográficos puede estar presente en la Uña de Gato.
En estas placas cormatograficascromatográficas (figura 14Tabla 4), sembradas a

igual cantidad y concentración, se observa que los extractos son muy similares en su
50
composición y concentración, a excepción del extracto acuoso, que contienen en mayor
proporción compuestos polares que se queda en la parte inferior, también el extracto de
Naturalcos S.A. presenta una mayor cantidad de compuestos polares que se queda en la
parte inferior, que probablemente contengan mayor cantidad de taninos y compuestos
feólicos glicosilados, que también se revelan en cloruro férrico.
En cuanto a la variedad de compuestos que se logra desplazar en la placa, todos

son similares con excepción del extracto acuoso, en el cual se aprecia que la variedad de
compuestos que eluyen se encuentran en baja concentración y existe más concentración
de compuestos polares que quedan en la base.
8.8.[9.2.] DETERMINACIÓN DEL MEJOR TIEMPO DE EXTRACCIÓN
8.8.1.[9.2.1.] Rendimiento de las extracciones con variación de tiempo
Tabla 5.6 Rendimientos de extracción en corteza de U.ncaria tomentosa a diferentes tiempos.
Tiempos Masa de Volumen de Masas de Promedio de Rendimiento

de muestra extracto extractos masa de extracto de extracción
extracción (Corteza) obtenido obtenidas obtenido [g] en base a la
[g] [mL] [g] corteza
3 horas 10.0000 64 0.7524 0.7443 ± 0.0227 7.443%
63 0.7187
64 0.7619
12 horas 10.0000 67 0.7409 0.7767± 0.0311 7.767%
69 0.7958
70 0.7935
24 horas 10.0000 67 0,8048 0.8111± 0.0543 8.111%

68 0,8682
66 0,7601
48 horas 10.0000 71 0.8532 0.8152 ± 0.0463 8.152%
64 0.7637
69 0.8288
72 horas 10.0000 65 0.7930 0.8135± 0.0602 8.135%
63 0.7663
66 0.8813
TABLA 7 Rendimientos de extracción en corteza de Uncaria tomentosa a diferentes tiempos.
51
En la tabla 5 se puede observar una clara diferencia en los rendimientos de
extracción entre 12 y 24 horas, siendo mayor a partir de 24 horas. Por otra parte,
prácticamente no existe diferencia en el rendimiento de extracción entre 24 a 72 horas.
8.8.2.[9.2.2.] Pruebas fitoquímicas preliminares
En las pruebas para la detección de compuestos fenólicos realizadas a los extractos

obtenidos con variación de tiempo de extracción, se observa la presencia de este tipo de
compuestos en todas las muestras.
Tabla 86. Pruebas fitoquímicas para compuestos fenólicos a extractos de corteza de Uncaria
tomentosa obtenidos en diferentes tiempos de maceración.
Extractos Prueba de Shinoda Prueba de Cloruro Férrico
Extracto de 3 +++ +++

horas

horas

horas

horas

horas
TABLA 9 Pruebas fitoquímicas para compuestos fenólicos a extractos de corteza de Uncaria tomentosa
obtenidos en diferentes tiempos de maceración.
Según la tabla 65, se observa reacciones muy evidentes, tanto la prueba de

Shinoda para compuestos flavonoides y la prueba con cloruro férrico para la detección
de compuestos fenólicos en general; en todas las muestras.
52
8.8.3.[9.2.3.] Cromatografía en capa fina (TLC)
Tabla 7. FIGURA 28 Placas cromatográficas de extractos de U.ncaria tomentosa obtenidos a

diferentes tiempos.

(254nm) (365nm) H2SO4 10% FeCl3 5%
Reactivo
Dragendorff
Acetato de
etilo-
metanol
90:10
Acetato de
etilo- Ac.
fórmico-
Ác. acético
-Agua
(100:11:11:
26)
1. Extracto con un tiempo de 3 horas

FIGURA 29 Placas cromatográficas de extractos de Uncaria tomentosa obtenidos a diferentes tiempos.
En la observación con luz UV-254nm (Figura 15Tabla 7) se ve que todas las

muestras contienen muchos compuestos con dobles enlaces conjugados, entre ellos
probablemente compuestos fenólicos. Con luz UV-365nm se observan zonas
fluorescentes que nos indican probablemente la presencia de antraglucósidos, cumarinas,
flavonoides, ácidos fenolcarboxílicos y algunos tipos de alcaloides, aproximadamente la
misma concentración en todas las muestras. En el revelado con Ácido sulfúrico, se
53
observan una gran variedad de compuestos que relativamente se puede ver en mayor
concentración en las muestras 4 y 5 (extractos de 48 y 72 horas). En el revelado con
cloruro férrico se observa una variedad de compuestos fenólicos, que se desplazan con el
eluyente propuesto por Wagner & Bladt, 1996, las concentraciones de éstos son,
aproximadamente, iguales en todas las muestras. En el revelado con reactivo
Dragendorff no se logra distinguir compuestos alcaloides, solo se observa el estándar de
cafeína sembrado como referencia.
Por tanto, se puede tomar en cuenta una extracción durante 48 horas de

maceración como óptimo por su rendimiento y para lograr extraer más variedad de
compuestos, entre estos, compuestos fenólicos.
[9.3.] OBTENCIÓN DE FRACCIONES MAS CONCENTRADAS EN

COMPUESTOS FENÓLICOS.
Para la obtención de fracciones con mayor concentración de compuestos fenólicos,

del mejor extracto, obtenido con solvente y tiempo optimizado (etanol al 70%, tiempo de
maceración 48 horas), se realizó un fraccionamiento, mediante extracciones solido-
líquido sucesivas, con solventes de diferente polaridad: Eter de Petróleo 20-40, Acetato
de Etilo y Acetato de Etilo: Etanol 80:20
[9.3.1.] Rendimiento de las extracciones de fraccionamiento.
Tabla 108. Rendimientos de extracción de fraccionamiento con diferentes solventes, del extracto
hidroalcohólico 70% de U.ncaria tomentosa.
Solventes Masa de Volúmenes Masas de Promedio de Rendimiento

utilizados muestra de extracto extractos masa de de extracción
[g] obtenido obtenidas extracto
[mL] [mg] obtenido [mg]
Éter de 5.0000 34 0.0041 0.0051 ± 0.0010 0.102%
petróleo 20- 36 0.0052
40 36 0.0060
Acetato de 5.0000 39 0.4750 0.4917 ± 0.0144 9.834%
etilo 40 0.500
40 0.500
54
acetato de 5.0000 41 0.3142 0.3786± 0.0722 7.572%
etilo-etanol 46 0.4567
80:20 45 0.3649
5.0000 4.1178 3.9990 ± 0.1456 79.98%
3.8365
4.0426
TABLA 11 Rendimientos de extracción de fraccionamiento con diferentes solventes, de extracto
hidroalcohólico 70% de Uncaria tomentosa.
Comparando los rendimientos de extracción para del fraccionamiento con

diferentes solventes del extracto optimizado (Extracto obtenido con etanol al 70%,
tiempo de maceración 48 horas), mostrados en la tabla 86, se observa que la fracción con
éter de petróleo es prácticamente insignificante, mientras que el rendimiento de la
fracción obtenida con acetato de etilo es mayor que la fracción de acetato de etilo-etanol
80:20. Por otra parte, el residuo, que contiene compuestos de mayor polaridad,
probablemente taninos y compuestos glicosilados se encuentra en una mayor proporción
(79.98%), lo cual es característico de los extractos hidroalcohólicos.
Tabla 129 Rendimientos de extracción de fraccionamiento con diferentes solventes, de extracto de

Uncaria tomentosa proporcionado por Naturalcos SA.
Solventes Masa de Volúmenes Masas de Promedio de Rendimiento

utilizados muestra de extracto extractos masa de de extracción
[g] obtenido obtenidas extracto
[mL] [mg] obtenido [mg]
Éter de 5.0000 35 0.0009 0.0021 ± 0.0018 0.042%
petróleo 20- 34 0.0042
40 35 0.0012
Acetato de 5.0000 43 0.1416 0.1299 ± 0.0104 2.598%
etilo 42 0.1218
43 0.1263
acetato de 5.0000 41 0.3765 0.3161± 0.0739 6.322%
etilo-etanol 39 0.2637
80:20 40 0.3381
5.0000 4.1178 4.1804 ± 0.1977 83.61%
3.8365
4.0426
TABLA 13 Rendimientos de extracción de fraccionamiento con diferentes solventes, de extracto de Uncaria
tomentosa proporcionado por Naturalcos SA.
55
Comparando los rendimientos de extracción para fraccionamiento con diferentes
solventes del extracto elaborado por Naturalcos S.A. (tabla 97), la fracción con éter de
petróleo es prácticamente insignificante, mientras que el rendimiento de la fracción
obtenida con acetato de etilo-etanol 80:20 es mayor que la fracción obtenida con acetato
de etilo, pero la fracción que queda como residuo de las extracciones es mayor que el
residuo obtenido del extracto optimizado (tabla 6), esto se puede deber a que la
extracción a mayor tiempo que se realizó por la empresa, el cual podemos decir que
tieneextrajo mayor proporción de compuestos polares, que probablemente son
compuestos glicosilados y taninos. Realización de pruebas fitoquímicas preliminares en
fracciones de extractos
8.8.4.[9.3.2.] Pruebas Fitoquímicas preliminares del extracto optimizado, de

Naturalcos S.A. y sus fracciones
Se realizaron las siguientes pruebas:
Tabla 1410 Pruebas fitoquímicas preliminares de fracciones del extracto Hidroalcohólico

optimizadocon diferentes solventes.
Tipo de metabolito Ensayo Fracción Fracción Fracción RFracción

de Éter de de acetato de acetato de residuo
petróleo de etilo de etilo-
20-40 etanol
80:20
Alcaloides Dragendorff - + + -
- + + -
Mayer - - - -
- - - -
Wagner + ++ + ++
+ ++ + +
Hager ++ ++ ++ ++
++ +++ +++ ++
Taninos y FeCl3 ++ +++ ++ +++
compuestos ++ +++ ++ +++
fenólicos Gelatina +++ - ++ +++
+++ - ++ +++
Acetato de +++ ++ ++ +++
plomo +++ ++ ++ +++
Flavonoides Vapores de +++ +++ ++ -
amoniaco ++ +++ +++ +
Shinoda ++ +++ +++ +
++ +++ ++ +
56
Pew`s + ++ ++ ++
+ ++ ++ +
Leucoantocianidin Ácido +++ +++ +++ +++
as clorhídrico +++ +++ +++ +++
Cardiotónicos Kedde + ++ + +
+ ++ + +
Antocianinas Acido-base ++ ++ ++ ++
++ ++ ++ ++
Saponinas Espuma +++ +++ +++ +++
+++ +++ +++ +++
Triterpenoides y/o Liebermann- ++ +++ + ++
esteroides Burchard ++ +++ + +
Azucares Fehling +++ ++ ++ ++
reductores ++ +++ ++ ++
Proteínas- Ninhidrina - + - +
aminogrupos - - - -
TABLA 15 Pruebas fitoquímicas preliminares de fracciones del extracto Hidroalcohólico optimizado.
Tabla 11.16 Pruebas fitoquímicas preliminares de fracciones del extracto Hidroalcohólico de

Naturalcos S.A.
Tipo de metabolito Ensayo Fracción Fracción Fracción RFracción

de Éter de de acetato de acetato de residuo
petróleo de etilo de etilo-
20-40 etanol
80:20
Alcaloides Dragendorff
- + + -
- + + -
Mayer - - + -
- - + -
Wagner ++ + ++ -
++ + ++ -
Hager ++ +++ +++ +
++ +++ +++ ++
Taninos y FeCl3 ++ ++ ++ +++
compuestos fenólicos ++ +++ ++ +++
Gelatina + - - +
++ + - +
Acetato de + ++ + +
plomo ++ ++ + +
Flavonoides Vapores de ++ +++ +++ ++
amoniaco ++ ++ +++ ++
Shinoda + + + ++
+ + ++ +
Pew`s + + + +
+ + + +
Leucoantocianidinas Ácido ++ + ++ ++
clorhídrico ++ + ++ ++
Cardiotónicos Kedde + + + +
57
+ + ++ -
Antocianinas Acido-base ++ ++ ++ ++
++ ++ + ++
Saponinas Espuma ++ +++ +++ +++
+++ ++ +++ +++
Triterpenoides y/o Liebermann- + ++ +++ ++
esteroides Burchard ++ +++ ++ +
Azucares reductores Fehling ++ ++ ++ ++
++ ++ +++ ++
Proteínas- Ninhidrina - - - -
aminogrupos - - - -
TABLA 17 Pruebas fitoquímicas preliminares de fracciones del extracto Hidroalcohólico de Naturalcos S.A.
Mediante estas pruebas podemos observar (Tablas 108 y 911), especialmente con el
ensayo de FeCl3, la presencia de compuestos fenólicos en todas las fracciones, y más
evidentemente en las fracciones con acetato de etilo y el residuo que queda después de
las extracciones sucesivas, tanto en el extracto optimizado como en el de Naturalcos
S.A. Los taninos se encuentran presentes sobre todo en las fracciones residuo, como
muestra el ensayo con gelatina. Los ácidos fenólicos se encuentran en todas las
fracciones, como muestra la reacción con acetato de plomo. Los flavonoides también se
encuentran en todas las fracciones, más evidentemente en las fracciones de acetato de
etilo y acetato de etilo etanol 80:20, según muestran las pruebas con vapores de
amoniaco, Shinoda y Pew`s. Tenemos la presencia de leucoantocianidinas en todas las
fracciones, con más evidencia en la fracción con acetato de etilo-etanol 80:20 del
extracto de Naturalcos S.A. Las Antocianinas también presente en todas las fracciones,
como muestra los ensayos acido-base.
Esta presencia compuestos fenólicos en las diferentes fracciones se atribuye a que

probablemente son de diferente naturaleza o se encuentran asociados a azucares, que
contribuyen a su solubilidad en solventes más polares, cuya presencia de estos azúcares
se evidencia en la prueba de Fehling. Sin embargo, en general podemos observar mayor
presencia de compuestos fenólicos en las fracciones de acetato de etilo y acetato de
etilo-etanol 80:20.
58
FIGURA 30Tabla 12 Placas cromatográficas de fracciones de extracto hidroalcoholico

optimizadocon diferentes solventes UG7048

(254nm) (365nm) H2SO4 10% FeCl3 5%
Reactivo
Dragendorff
Acetato de
etilo-
metanol
90:10
Acetato de
etilo- Ac.
fórmico-
Ác. acético
-Agua
(100:11:11:
26)
[1.] Extracto UG-7048optimizado inicial UG-7048

1.[2.] Fracción extraída con éter de petróleo 20-40 de UG-7048
2.[3.] Fracción extraída con acetato de etilo de UG-7048
3.[4.] Fracción extraída con acetato de etilo-etanol 80:20 de UG-7048
[5.] Residuo Fracción que queda de residuo después de las extracciones sucesivas.
En el extracto optimizado se evidencia que los compuestos fenólicos sobre todo

son de naturaleza polar, como se evidencia en las placas cromatográficas obtenidas con
eluyente acetato de etilo-etanol 90:10 (figura 16Tabla 12), pues se quedan en la base o
cerca de la base, como se ve específicamente en la placa revelada con cloruro férrico. En
la elución de las placas con la mezcla ácida se observa que, los compuestos fenólicos
están en mejor variedadmayor variedad de compuestos en la fracción de acetato de etilo,
entre ellos los compuestos fenólicos vistos más específico en el revelado con cloruro
59
férrico. Por otra parte, según las placas reveladas con reactivo Dragendorff, en la
fracción de acetato de etilo también tenemos la presencia de alcaloides; y en las
fracciones de acetato de etilo-etanol 80:20 y residuo, se tiene compuestos que absorben
luz UV a 365 nm, que probablemente son antraglucósidos, cumarinas, flavonoides,
ácidos fenolcarboxílicos o algunos tipos de alcaloides.
FIGURA 31Tabla 13. Placas cromatográficas de fracciones del extracto hidroalcohólico optimizado de la
empresa UG-NAT

(254nm) (365nm) H2SO4 10% FeCl3 5% Reactivo
Dragendorff
Acetato de
etilo-
metanol
90:10
Acetato de
etilo- Ac.
fórmico-
Ác. acético
-Agua
(100:11:11:
26)
1. Extracto UG-NAT
2. Fracción extraída con acetato de etilo de UG-NAT
3. Fracción extraída con acetato de etilo-etanol 80:20 de UG-NAT
4. Fracción que queda de residuo después de las extracciones sucesivas
5. Fracción extraída con éter de petróleo 20-40 de UG-NAT
En las fracciones realizadas al extracto de Naturalcos S.A. (figura 17Tabla 13 ), a

diferencia del las fracciones del extracto optimizado, solo se observa los compuestos
fenólicos más polares compuestos fenólicos (Rf= 0.33, 0.38, 0.47 y 0.53) además de los
que se quedan en la base, en las fracciones de acetato de etilo y acetato de etilo etanol
60
80:20, visto en las placas reveladas con cloruro férrico, probablemente por la extracción
más exaustiva que se da en la obtención del extracto de la empresa, pues aumenta la
proporción de algunos compuestos, especialmente polares, entre ellos compuestos
fenólicos más polares, que hace que los otros, de menor polaridad, queden en menor
proporción y sean indetectables en estas placas, lo mismo que ocurre con los compuestos
alcaloides vistos en el extracto optimizado anteriormente (figura 16Tabla 12 ), que no se
logran detectar en estas fracciones del extrtacto de Naturalcos S.A.
[9.4.] CROMATOGRAFÍA POR EXCLUSIÓN CON SEPHADEX® LH-20
Para la obtención de fracciones más ricas en compuestos fenólicos y mejor

separación de estos compuestos de los otros tipos de compuestos, se realizó una columna
con Sephadex LH-20, donde los compuestos más grandes salen inicialmente y los más
pequeños posteriormente. Así, se trabajó con 200 mg de la fracción de acetato de etilo
obtenida de del extracto optimizado (UG7048). Se obtuvo 12 fracciones de
aproximadamente 30 mL, de los cuales, realizado placas cromatográficas, se reunieron
las fracciones 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9 y 10; por otra parte 11 y 12 por presentarque presentaban
una composición similar, se obtuvosimilar, obteniéndose finalmente las siguientes cuatro
fracciones siguientes:
Tabla 1814 Masas de fracciones de columna Sephadex LH-20 de 200 mg de la fracción de AcOEt
Fracción de columna Sephadex LH-20 Masa obtenida [mg]

FA-S1 (primera fracción) 116,3
FA-S2 (segunda fracción) 15,5
FA-S3 (tercera fracción) 14,2
FA-S4 (cuarta fracción) 8,7
TABLA 19 Masas de fracciones de columna Sephadex
FIGURA 32Tabla 15 Placas cromatográficas de fracciones obtenidas en columna Sephadex de la

fracción de AcOEtde UG-7048
Eluyente Vista Vista Placa Placa Placa

de la placa de la placa revelada con revelada con revelada con
61
en UV en UV H2SO4 10% FeCl3 5% Reactivo
(254nm) (365nm) Dragendorff
Acetato de
etilo-
metanol
90:10
Acetato de
etilo- Ac.
fórmico-
Ác. acético
-Agua
(100:11:11
:26)
P. Extracto UG7048
1. S1 (primera fracción)
2. S2 (segunda fracción)
3. S3 (tercera fracción)
4. S4 (cuarta fracción)
C. Muestra estándar cafeína.
En las placas cromatográficas (figura 18Tabla 15) se observa en en la placa

revelada con ácido sulfurico al 10% de la primera fracción (S1), la presencia de varios
compuestos como se observa en la placa revelada con ácido sulfurico al 10%, entre
estos, talvez cumarinas, visto en UV a 365 nm, también algún compuesto fenólico a Rf =
0.36., Een eluyente Acetato de etilo-Acido fórmico-Acido acético-agua 100:11:11:26,
visto en placa revelada con cloruro férrico; y alcaloides, visto en placas cromatográficas
revelada con reactivo Dragendorff. eEn la segunda fracción tenemos compuestos
fenólicos a Rf = 0.30 en eluyente Acetato de etilo-Acido fórmico-Acido acético-agua
100:11:11:26. En la tercera fracción se observa un compuesto fenólico a Rf = 0.50 en
eluyente Acetato de etilo-Ácido fórmico-Ácido acético-agua 100:11:11:26. La cuarta
fracción no presenta compuestos fenólicos según la placa revelada con cloruro férrico,
62
pero se observa un compuesto que emite fluorescencia con luz UV a 365 nm,
probablemente cumarico.
Cabe destacar que las fracciones S2 y S3, contienen casi exclusivamente

compuestos fenólicos, según se observa comparando las placas cromatográficas
reveladas con ácido sulfúrico y cloruro férrico. Lo cual está de acuerdo con el hecho de
que los compuestos fenólicos son más pequeños por lo que salen normalmente en las
últimas fracciones de Sephadex LH-20.
8.9.[9.5.] ANÁLSIS POR CROMATOGRAFÍA DE ALTA RESOLUCIÓN

(HPLC)
Mediante el método mencionado (sección 8.6), inicialmente se realizó los

cromatogramas de patrones de epicatequina y ácido cafeico, porque estos compuestos
probablemente están en los extractos y fracciones de acuerdo a bibliografía (poner ref),
obteniéndose también además sus espectros UV-Vis (Figuras 19 y 20).
Se determina que la epicatequina tiene un tiempo de retención de 18.067 min con

el método empleado y tiene un máximo de absorbancia típico de los compuestos
fenólicos en 280 nm (Figura XX19).
Figura 33 Resultados del HPLC: a) Cromatograma del estándar de epicatequina a 280 nm, b)
Espectro UV-Vis del estándar de epicatequina.
DAD1 D, Sig=280,16 Ref=450,100 (UNCARIAT\UT000051.D)
Norm.
52.658
120
100
80
60
18.067
40
20
54.362
0 10 20 30 40 50 60 min
a) b)
Figura Xx Resultados del HPLC: a) Cromatograma del estándar de epicatequina a 280 nm, b)
Espectro UV-Vis del estándar de epicatequina.
63
El estándar de ácido cafeico tiene un tiempo de retención de 16.795 min y según
su espectro UV-Vis una absorbancia máxima a 320nm, aunque también tiene
absorbancia relativamente menor a 280 nm (figura XX20).
FIGURA 34 Resultados del HPLC: a) Cromatograma del estándar de ácido cafeico a 280 nm, b) Espectro
UV-Vis del estándar de epicatequina, c) Cromatograma del estándar de ácido cafeico a 320nm.
D A D 1 , 1 6 .8 0 8 (2 3 0 m A U , - ) o f U T 0 0 0 0 4 5 .D
Norm.
m AU
52.660
160
140
120 0
100
-5 0
80
60
-1 0 0
16.795
40
20 -1 5 0
54.377
49.963
17.276
0 10 20 30 40 50 min 250 300 350 nm
a) b)
DAD1 C, Sig=320,8 Ref=450,100 (UNCARIAT\UT000045.D)
Norm.
16.795
50
40
30
20
10
17.275
0 10 20 30 40 50 min
c)
Figura 35 Resultados del HPLC: a) Cromatograma del estándar de ácido cafeico a 280 nm, b)
Espectro UV-Vis del estándar de epicatequina, c) Cromatograma del estándar de ácido cafeico a 320nm.
Luego, Sse analizóa la presencia de estos compuestos (epicatequina y ácido

cafeico) en las fracciones de columna Sephadex S1, S2, S3 y S4, realizando los
cromatogramas a 280 nm y 320 nm, según el procedimiento descrito en la sección 8.6.
64
FIGURA 36 a) Cromatograma de fracción Sephadex S1 a 280 nm, b) Cromatograma de fracción Sephadex
S1 a 320 nm.

mAU
52.670
160
140
120
100
80
60
40
53.651
31.399
60.999
53.850
53.961
50.019
54.384
58.181
63.368
16.207
18.117
20
2.874
0 10 20 30 40 50 60 min
a)
mAU
31.388
4
47.949
48.719
63.362
2
3.061
0 10 20 30 40 50 60 min
b)
Figura XX. a) Cromatograma de fracción Sephadex S1 a 280 nm, b) a 320 nm.
En la fracción S1 se tiene la presencia del compuesto epicatequina en mínima

proporción como muestra la figura 21a, a 18.117 min, y como lo corrobora e espectro
UV-Vis de este pico (figura 21a). En el cromatograma a 320 nm no se observa el ácido
cafeico, pero sí un compuesto que absorbe mayoritariamente a esta longitud de onda a
un tiempo de retención de 31.388 min, que por la forma de su espectro (figura 21b),
probablemente se trate de un alcaloideflavonoide por las dos bandas características cerca
de 270 y 360 nm.
65
S2 a 320 nm.

mAU
8.727
52.657
140
120
100
80
27.571
27.328
60
30.70231.153
38.987 39.496
60.950
40.180 40.641
40
2.862
14.463
14.192
42.150
53.923
52.888
32.512
34.179
43.286
37.935
32.124
11.151
44.212
56.781
54.396
42.846
43.829
20
35.761
53.100
18.035
49.976
63.352
16.160
0 10 20 30 40 50 60 min
a)
mAU
27.327
27.571
60
40.641
31.149
50
39.496
40
30.704
30
14.463
14.193
20
8.729
2.863
32.122
37.939
38.982
34.211
43.285
42.140
11.152
17.634
18.033
43.508
10
43.838
44.214
43.065
20.701
25.470
15.249
16.871
19.160
23.314
63.337
0 10 20 30 40 50 60 min
b)
Figura XX.38 a) Cromatograma de fracción Sephadex S2 a 280 nm, b) Cromatograma de fracción

Sephadex S2 a 320 nm.
La fracción S2 presenta el compuesto epicatequina en mínima cantidad como se

observa en el cromatograma (figura 22a) a 280 nm, corroborada por su espectro UV-Vis,
de dicho compuesto a un tiempo de retención de 18.035 min; también se observa a esta
longitud de onda, en el cromatograma un compuesto que absorbe mayoritariamente a un
66
tiempo de retención de 8.127 min, talvez un derivado de ácido cinámico, por sus picos
cerca de 269 y 300 nm. Por otra parte, no se observa la presencia de ácido cafeico,
debido a que no existe los picos correspondientes a 280 y 320 nm., Ssin embargo, a 320
nm se observa compuestos que absorben mayoritariamente a 27.327, 31.149, 39.496 y
40.641 min. De acuerdo a sus espectros UV, los tres primeros son flavonoides por las
dos bandas características cerca de 260 y 360 nm y la última señal (40.641 min)
probablemente sea la mezcla de 2 compuestos un flavonoide y un derivado de ácido
cinámico.
S3 a 320 nm.

mAU
42.480
52.636
60.964
120
43.593
100
80
34.323
60
40.224 39.615
38.072
40
45.506
42.960
36.178
41.569
53.913
44.508
2.869
41.000
56.791
14.410
42.191
14.140
54.392
44.237
43.929
26.945
20
27.629
45.904
45.058
8.780
49.923
9.104
55.632
31.312
17.562
60.335
46.286
17.968
49.487
54.691
51.589
50.419
0 63.366
0 10 20 30 40 50 60 min
a)
mAU
42.481
175
43.594
150
125
100
75
34.323
40.224 39.614
38.072
36.179
50
41.548
45.06545.506
14.410
44.507
42.961
14.138
40.942
43.931
44.233
26.937
25
31.306
33.275
27.628
45.898
55.632
17.588
37.411
46.287
63.352
2.875
0 10 20 30 40 50 60 min
67
b)
Figura XX40. Cromatogramas de fracción Sephadex S3 a) Cromatograma de fracción Sephadex S3 a
280 nm, b) Cromatograma de fracción Sephadex S3 a 320 nm.
En la fracción S3, no se observa la presencia de los compuestos epicatequina y

acidoácido cafeico (figura XX23), pero si muchos compuestos que absorben
mayoritariamente a 280 y 320 nm, a tiempos de retención de 34.323, 42.481 y 43.594
nm, entre otros, Saunque según sus espectros UV-Vis, sus máximo de absorbancias a
260 y cerca de 350 nm, se trata de flavonoides que también son compuestos fenólicos,
de tamaño pequeño, lo cual esta de acuerdo con el proceso de separación realizado para
llegar a estas fracciones. a están aproximadamente a 360 nm, que es típico de los
compuestos alcaloides, por tanto, probablemente se trate de este tipo de compuestos.
También en el cromatograma realizado a 280 nm, se puede observar la presencia de un
compuesto que absorbe mayoritariamente a 60.964 min, que por la forma de su espectro
UV-Vis, probablemente se trate de un compuesto fenólico simple.
FIGURA 41a) Cromatograma de fracción Sephadex S4 a 280 nm, b) Cromatograma de fracción Sephadex S4
a 320 nm.

mAU
60.960
140
52.647
120
100
80
60
40
53.916
54.379
56.799
54.677
20
2.877
45.793
0 10 20 30 40 50 60 min
a)
68
mAU
45.791
60.571
2.5
42.442
2
1.5
2.893
1
0.5 3.069
-0.5
-1
-1.5
0 10 20 30 40 50 60 min
b)
Figura XX42 a) Cromatograma de fracción Sephadex S4 a 280 nm, b) Cromatograma de fracción

Sephadex S4 a 320 nm.
En la fracción S4, se observa la absorción de un compuesto mayoritario en el
cromatograma a 280 nm a un tiempo de retención de 60.980 min, que por la forma de su
espectro UV-Vis probablemente se trate de un compuesto fenólico (figura 24a). A 320
nm no se observan picos de relevancia y las absorbancias son mínimasse observan
muchos compuestos no distinguiéndose claramente mayoriatorios y sus absorbancias son
pequeñas.
Por lo tanto, de acuerdo al análisis de las fracciones S1, S2, S3 y S4 por HPLC, las
fracciones con mayor cantidad de compuestos fenólicos, son las fracciones S2 y S3,
existiendo en estas diversos tipos de compuestos fenólicos, principalmente compuestos
fenólicos simples, derivados de ácido cinámico y flavonoides, de acuerdo a su análisis
por HPLC.
8.10.[9.6.] ANÁLISIS POR ESPECTROSCOPIA UV-VIS.
Para tener otro valor cuantitativo de referencia de compuestos fenólicos en los

diferentes extractos y fracciones obtenidas, se realizó un estudio por espectroscopía
UV/Vis respecto a la epicatequina, compuesto presente en la Uña de Gato, de acuerdo a
referencias bibliográficas (ref)
Tabla Xx20 Equivalentes de epicatequina en extractos y fracciones de Unacaria tomentosa.
69
Muestra Descripción de la muestra mg Equivalentes de
Epicatequina/g de extracto
(mgEE/g).
UG-NAT Extracto de la Empresa Naturalcos 618,38
UG-7048 661,62
UG-50 554,59
UG-30 564,32
UG-AC 518,38
UG-96 526,49
UG-3h 526,49
UG-12h 525,95
UG-24h 543,24
UG-72h 502,16
UGNAT-FA 346,49
UGNAT-FAE 348,65
UGNAT-RES 650,27
UG7048-FA 403,24
UG7048-FAE 593,51
UG7048-RES 601,08
FA- S1 124,86
FA- S2 477,30
FA-S3 555,68
FA-S4 131,89
TABLA 21 Equivalentes de epicatequina en extractos y fracciones de Unacaria tomentosa.
EnSe observa, en la Ttabla XX11, se observa que Lla mayor concentración de

miligramos equivalentes de epicatequina, corresponde al extracto optimizado en
variación de solvente y tiempo, el cual contiene 661.2 mg de EE/g de extracto, seguido
del extracto elaborado por la Empresa Naturalcos S.A. En cuanto a las fracciones
realizadas de estos dos extractos, cabe destacar que el residuo que queda después de las
extracciones sucesivas con solventes de diferente polaridad, tienen mayores
concentraciones de EE, esto debido probablemente a que la mayor cantidad de
compuestos fenólicos tipo epicatequina se encuentran gliucosilados, por lo que son muy
70
polares y taninos que quedan des pues de la extracción con solventes orgánicos. En
cuanto a las fracciones de la columna Sephadex, el cual se encuentra libre de
compuestos tanoides, la fracción S3 presenta buena concentración de Equivalentes de
Epicatequina, seguida de la fracción S2. Es importante resaltar que en esta prueba no se
van a determinar flavonoides, que son compuestos mayoritarios en las fracciones S2 y
S3, de acuerdo al análisis HPLC.
8.11.[9.7.] DETERMINACIÓN DEL CONTENIDO FENÓLICO TOTAL POR

FOLIN CIOCALTEAU Y ACTIVIDAD ANTIOXIDANTE POR EL
MÉTODO ABTS DE LOS EXTRACTOS Y FRACCIONES
Para determinar la actividad antioxidante, que normalmente esta relacionada al

contenido de compuestos fenólicos, se realizó Los resultados de la cuantificación de
fenoles totales por Folin Ciocalteau y actividad antioxidante en extractos y fracciones
fueron las siguientesla determinación de compuestos antiradicalarios por el método
ABTS. :
8.11.1.[9.7.1.] Determinación del contenido fenólico total por Folin Ciocalteu

y actividad antioxidante por el método ABTS de los extractos obtenidos
con diferentes solventes
Tabla Xx22 Contenido Fenólico Total por Folin Ciocalteau y actividad antiradicalaria por ABTS
de los extractos obtenidos con diferentes solventes
Muestra Contenido Fenólico Total ABTS

(mg EAG/g extracto seco)* (µM ET/g extracto seco)*
UG-NAT 309.2 ± 0.2 613.0 ± 0.3
UG-7048 368.9 ± 0.2 731.4 ± 0.7
UG-50 255.8 ± 0.2 504.4 ± 0.6
UG-30 322.7 ± 0.2 640.8 ± 0.3
UG-AC 287.7 ± 0.2 570.7 ± 0.7
UG-96 345.0 ± 0.2 686.8 ± 0.9
71
* Promedio ± DS, N = 3
TABLA 23 Contenido Fenólico Total y ABTS de los extractos obtenidos con diferentes solventes
FIGURA 43 Contenido fenólico Total en extractos obtenidos con diferentes solventes
400.0
Contenido Fenólico Total (mg EAG/g
350.0
300.0
extracto seco)
250.0
200.0 Series1
150.0
100.0
50.0
0.0
EN EE-70 EE-50 EE-30 EA EE
Figura Xx44 Contenido fenólico Total en extractos obtenidos con diferentes solventes
FIGURA 45 Actividad antioxidante ABTS de extractos obtenidos con diferentes solventes
800.0
ABTS (µM ET /g extracto seco)
700.0
600.0
500.0
400.0
Series1
300.0
200.0
100.0
0.0
EN EE-70 EE-50 EE-30 EA EE
72
Figura Xx46 Actividad antioxidante ABTS de extractos obtenidos con diferentes solventes
Como se observa en la tabla XX12 y en las figuras XX25 y XX26 existe una
correlación entre el contenido de fenoles totales y la actividad antioxidante, y el extracto
optimizado (extracto hidroalcohólico al 70%, macerado por 48 horas en una relación
1:10 masa de corteza-volumen de solvente) tiene más concentración de compuestos
fenólicos 368.9 mg EAG/g extracto seco y correspondientemente la mayor actividad
antioxidante 731.4 µM ET/g extracto seco . Por otra parte, el extracto de Naturalcos S.A.
tiene menos concentración de compuestos fenólicos que los extractos Hidroalcohólicos
al 70%, al 30% y Etanólico, 309.2 mg EAG/g extracto seco y correspondientemente
menor actividad antioxidante 613.0 µM ET/g extracto seco, que dichos extractos. Esto
probablemente debido a que por el tiempo de extracción extrae muchos otros
compuestos, no fenolicos, lo que hace que la concentración de los mismos disminuya.
[9.7.2.] Determinación del contenido fenólico total por Ffolin Cciocalteu y

actividad antioxidante por el método ABTS de las fracciones obtenidas
con diferentes solventes del extracto optimizado UG-7048
TABLA 24 Contenido Fenólico Total y ABTS de las fracciones del extracto optimizado

FA 308.7 ± 0.2 607.7 ± 0.7
FAE 339.0 ± 0.2 671.2 ± 0.3
FR 317.1 ± 0.2 624.8 ± 0.2
TABLA 25 Contenido Fenólico Total y ABTS de las fracciones del extracto optimizado
73
FIGURA 47 Contenido de fenoles totales de fracciones de extracto optimizado
350.0

340.0
330.0
extracto seco)
Se-
ries1
320.0
310.0
300.0
290.0
FA FAE FR
FIGURA 48 Actividad antioxidante de fracciones obtenidas del extracto optimizado

680.0
660.0
640.0
620.0 Se-
ries1
600.0
580.0
560.0
FA FAE FR
Como se muestra en la tabla XX13 y en las figuras XX27 y 28XX existe una
correlación entre el contenido de fenoles totales y la actividad antioxidante de las
fracciones. La fracción obtenida por extracción con Acetato de etilo-Etanol 80:20, a
partir del extracto optimizado es el que presenta mayor concentración de fenoles totales
339.0 mg EAG/g extracto seco y correspondientemente la mayor actividad antioxidante
671.2 µM ET/g extracto seco, pero su concentración de fenoles totales no sobrepasa la
concentración del extracto optimizado integro (368.9 mg EAG/g extracto seco) y
tampoco su actividad antioxidante (731.4 µM ET/g extracto seco).
74
8.11.2.[9.7.3.] Determinación del contenido fenólico total por Folin Ciocalteu
y actividad antioxidante por el método ABTS de las fracciones
obtenidas en Cromatografía Sephadex LH-20 de la fracción con
Acetato de Etilo

FA-S1 30.1 ± 0.1 50.7 ± 0.5
FA-S2 174.1 ± 0.2 321.8 ± 1.0
FA-S3 222.2 ± 0.2 440.9 ± 0.3
TABLA 26 Contenido Fenólico Total y ABTS de las fracciones de Columna Sephadex LH-20 de FA
FIGURA 49 Contenido de fenoles totales de fracciones de columna Sephadex de FA
250.0
200.0
Series1
extracto seco)
150.0
100.0
50.0
0.0
FA-S1 FA-S2 FA-S3
75
FIGURA 50 Actividad antioxidante de fracciones de columna Sephadex LH-20 de FA
500.0

450.0
400.0
350.0
300.0
Se-
250.0 ries1
200.0
150.0
100.0
50.0
0.0
FA-S1 FA-S2 FA-S3
Como se observa en la tabla 14 y en las figuras 29 y 30, las fracciones de la

columna Sephadex S2 y S3, tienen mucho mayor contenido de fenoles totales y
actividad antioxidante que la fracción S1, a pesar de que esta última resultó en mayor
diversidad de compuestos y cantidad de extracto, como resultó se muestra en la sección
9.4. Y como se observó en dicha sección este constalas fracciones S2 y S3 muestran
casi exclusivamente de compuestos fenólicos de mediana polaridad, principalmente,
compuestos fenolicos simples, derivados de ácido cinámico y más probablemente
flavonoides o antocianidinas.
9.[10.] CONCLUSIONES
 Mediante las extracciones realizadas con soluciones solventes hidroalcohólicoas,

acuosoa y etanólicoa, en diferentes proporciones, por ende, de diferente
polaridad; y variando los tiempos de extracción por maceración desde 3 horas a
72 horas, se logra un mejor rendimiento de masa de extractose determinó que las
mejores condiciones de extracción son, realizando la maceración con
Eetanol:H2O al 70%, durante 48 horas. Además, se comprobó que este extracto
contiene variedad de compuestos fenólicos.
76

 Mediante el fraccionamiento con solventes de diferente polaridad: : Eter de

Petróleo 20-40, Acetato de Etilo y Acetato de Etilo: Etanol 80:20 al extracto
optimizado EtOH:H2O al 70% se obtiene determinó que el extracto con acetato
de etilo, que muestra mayor variedad de compuestos fenólicos y con mayor
rendimiento, a excepción delaunque el residuo polar que es eltiene un
rendimiento del 79.98% del extracto.
 Mediante columna Sephadex, realizada a la fracción de acetato de etilo del

extracto optimizadoEtOH:H2O al 70%, se logra obtener dos fracciones (S21 y
S32) que contienen casi exclusivamente compuestos fenólicos, destacando que al
ser fracciones de columna Sephadex separa los compuestos por tamaños, y que
en estas fracciones quedaron los compuestos pequeñosno contiene taninos. El
análisis por cromatografía HPLC y espectroscopía UV/Vis confirmó que las
fracciones S2 y S3 contienen principalmente compuestos fenólicos, siendo éstos
compuestos fenólicos simples, derivados de ácido cinámico y mayoritariamente
flavonoides. Adicionalmente mediante el análisis pro HPLC, se pudo determinar
que Y medinte HPLC, se puede identificar al compuesto la epicatequina está
presente en mínima cantidad en las fracciones de Sephadex FA-S1 y FA-S2,
mientras que no se detectóa el ácido cafeico, en ninguna de estas fracciones de
Sephadex.
 LRealizada la cuantificación de Equivalentes de Epicatequina por espectroscopía

UV/Vis ena todos los extrtactos y fracciones obtenidoas, se evidencia una mayor
concentración en el extracto EtOH:H2O al 70%,optimizado, así como en el
residuo de las fracciones realizadas a dicho extracto, sin embargo, este residuo
contiene compuestos muy polares, probablemente glicosilados y compuestos
tanoides. Las fracciones S2 y S3 de Sephadex también muestran una buena
cantidad de equivalentes de epicatequina pero menor al del extracto EtOH:H2O
al 70%, esto se puede deber a dos razones, primero que el extracto tiene una
mayor cantidad de compuestos tipo epicatequina polares (glicosilados) que
77
quedaron en el residuo del fraccionamiento y segundo, que el ensayo utilizado no
detecta flavonoides, que son compuestos fenolicos mayoritarios en S2 y S3.
 En las pruebas de fenoles totales y actividad antioxidante se observo que los

extractos y fracciones con mayor contenido de fenoles totales muestran una
mayor actividad antioxidante por ABTS. aL también la mayor concentración y
actividad antioxidante fue del extracto EtOH:H2O al 70%,optimizado, masmás
aún que su fracción de acetato de etilo-etanol 80:20, que es la que más
concentración de fenoles totales y actividad antioxidante tiene, entra las
fracciones realizadas, esto probablemente debido a lo ya mencionado, que el
extracto tiene una mayor cantidad de compuestos tipo epicatequina polares
(glicosilados) que quedaron en el residuo del fraccionamiento. Y
observandoAnalizando las fracciones de Sephadex realizadasobtenidas, que están
libres de taninos y otros compuestos, la fracción FA-S3 es la que tiene mayor
concentración de fenoles totales y actividad antioxidante.
 Por tanto, seSe concluye, que el extracto optimizado, extraídoobtenido con etanol
al 70% durante 48 horas presenta mayor concentración de Equivalentes de
epicatequina, Fenoles totales equivalentes a ácido gálico y mejor actividad
antioxidante, inclusive mejor que sus fracciones con solventes y sus fracciones
con sephadex, sin embargoesto probablemente debido a que presenta una gran
proporción de compuestos polares (79.98%), dentro los cuales se encuentra
taninos y compuestos fenólicos glicosilados.
 En caso de requerir un extracto libre de taninosLos compuestos no glicosilados

son normalmente más fáciles de trabajar y también muestran importantes
propiedades farmacológicas, por lo que para para una formulación
fitofarmaceútica, y estos fitoquímicos más profundos se debería considerar las
fraciones S2 y S3 tercera fracción obtenidas mediante Sephadex, inclusive se
puede unir ambasdel extracto de acetato de etilo, obtenido este último del
extracto optimizado, sería el de mejor concentración de Equivalentes de
Epicatequina, fenoles totales (equivalentes de ácido gálico) y mejor actividad
antioxidantelas cuales muestran una interesante composición de compuestos
78
fenólicos simples, derivados de ácido cinámico y flavonoides, con una
importante actividad antioxidante .
10.[11.] RECOMENDACIONES
 Realizar métodos de control, del extracto estandarizado, mediante HPLC y/o

UV-Vis.
 Para una mayor concentración de Flavonoides, antocianinas y otros compuestos

fenólicos simples, realizar una hidrolisis controlada y/o eliminación de
compuestos tanoides, que además tienen propiedades astringentes.
 El compuesto epicatequina no es un compuesto mayoritario en el extracto, por lo

que se sugiere buscar otro, para patrón de cuantificación y control.
11.[12.] BIBLIOGRAFÍA
Agüero, C. A., Sánchez, O., Stilke, R., & de Ugaz, O. L. (1988). Algunos constituyentes
de Uncaria guianensis. Revista de Química, 2(2), 99-104.
Alves Pereira, R., & Marques Lopes, J. V. (2006). Aspectos Botânicos, Etnobotânicos,
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CARACTERIZACIÓN DE DOS ESPECIES DEL GÉNERO UNCARIA.
Ecología Aplicada, 9, 19-30.
87
88
12.[13.] ANEXOS
ANEXO 1Distribución geográfica de Uncaria Tomentosa. Fuente (Zevallos-Pollito & Tomazello Filho, 2010).
ANEXO 2 Ensayo Ensayo Folin Ciolcalteu en muestras (extractos y fracciones)
ANEXO 3 Ensayo ABTS en muestras (extractos y fracciones)
¿Qué anexos puedo colocar?

Trabajo Obtencion de Un Extracto Rico en Fenoles de Uncaria Tomentosa

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UNIVERSIDAD MAYOR DE SAN ANDRÉS

FACULTAD DE CIENCIAS PURAS Y NATURALES

TRABAJO PARA OPTAR AL GRADO DE LICENCIADO EN

Obtención de un extracto rico en compuestos fenólicos de la

PORPostulante: OSCAR MAMANI ROCHA

TUTORES: PhD. GIOVANNA ROCIO ALMANZA VEGA

A inicios de los años noventa, la Organización Mundial de la Salud identificó que

Una de las plantas, de gran uso tradicional y bastante estudiadas en el mundo es la

Los estudios de actividad antioxidante de extractos brutos y parciales de Uncaria

En el presente trabajo se espera quiere obtener un extracto rico en compuestos

2.1. EL GÉNERO UNCARIA

El género Uncaria, pertenece a la familia Rubiaceae. Comprende alrededor de 60

Clasificación taxonómica (Obregón, 1995).

Descripción botánica: liana leñosa, enredadera o, en ocasiones, arbusto

FiguraIGURA 2. U. tomentosa: a. inflorescencia de rama terminal y capítulo; B. espina; C. flor;

Distribución geográfica: Ees muy amplia en la Amazonía y Centroamérica,

2.2.[2.3.] USOS TRADICIONALES DE U. TOMENTOSA (UÑA DE GATO)

Su empleo en la medicina tradicional es de larga data. Son muchos los usos

La uña de gato se prepara generalmente en la medicina tradicional en forma de

Específicamente en Bolivia, los Tacanas administran decocción concentrada de

En la medicina tradicional Tikuna la efectividad del remedio no solo se da por su

[2.4.] FITOQUIMICAANTECEDENTES QUÍMICOS DEL GÉNERO

De los estudios fitoquímicos realizados en algunas especies del género Uncaria, se

Dentro de su composición de alcaloides, se tiene, indólicos pentaciclicos

Se han encontrado triterpenos polihidroxilados (ácido uncarico, ácido florídico),

Navarro et al. 2019, identifico 25 compuestos fenólicos, incluidos los ácidos

FiguraIGURA 4. Principales compuestos polifenólicos informados en las cortezas de Uncaria

[2.5.] ASPECTOS ANTECEDENTES ETNOFARMACOLÓGICOS Y

Estudios sugieren que los alcaloides pentacíclicos de oxindol son probablemente

Por otro lado, en un estudio se informa la actividad inmunoestimulante dada por,

Los extractos etanólicos y acuosos de Uncaria tomentosa mostraron actividades

El uso de uña de gato está contraindicado en caso de úlcera péptica y gastritis, ya

Existe una gran cantidad de información, acerca de la especie Uncaria tomentosa

En la industria nacional, como la empresa nacional Naturalcos SA., se desarrollan

La especie Uncaria tomentosa, conocida tradicionalmente como “uña de gato”,

5.1. OBJETIVO GENERAL

Obtener un extracto rico en compuestos fenólicos a partir de la corteza de Uncaria

• Preparar extractos hidro-alcohólicos, de la corteza de Uncaria tomentosa,

• Analizar los grupos de metabolitos secundarios en los extractos obtenidos,

• Obtener fracciones ricas en compuestos fenólicos, de un extracto seleccionado

• Analizar los compuestos fenólicos, en los extractos y fracciones obtenidas

• Realizar pruebas de actividad antioxidante a los extractos y fracciones

La medicina tradicional se utiliza ampliamente y es un sistema sanitario que está

Bolivia, como algunos de los países suramericanos y de centroamericanos, posee

Una de las plantas, de gran uso tradicional y bastante estudiadas en el mundo es la

Mediante este proyecto, concretamente se plantea dar apoyo a la industria

7.1. LOS COMPUESTOS FENÓLICOS

7.2. CLASIFICACIÓN DE LOS COMPUESTOS FENÓLICOS

Desde un punto de vista analítico los compuestos fenólicos pueden dividirse en

Figura 6. Clasificación de los compuestos fenólicos. (Fuente: González-Castejón y Rodriguez-

7.2.1. Ácidos fenólicos

Figura 8. Estructura química de los ácidos fenólicos. a) hidroxibenzoicos: ρ- hidroxibenzoico, R1

Los ácidos fenólicos se encuentran principalmente en la capa externa de los

Los flavonoides sin ser metabolitos primarios, se encuentran casi en cualquier

La estructura general de los flavonoides comprende un anillo A derivado de la

Figura 10. Estructura del flavano

Figura 12. Grupos de flavonoides.

Dentro del grupo de flavonoides más ampliamente distribuidos en las plantas

Las antocianinas son pigmentos solubles en agua que se encuentran en la

Figura 14. Estructura generalizada de las antocianinas. Cianinida: R1 = OH, R2 = H;

[7.2.4.] Taninos condensados

Los taninos son un grupo de compuestos hidrosolubles producidos por la

Figura 16 Estructura química de taninos condensados. Procianidina: R = H; prodelfinina: R =