FACULTAD DE CIENCIAS

ESCUELA DE BIOQUÍMICA Y
FARMACIA
UNIDAD I
CÍNETICA DE REACCIONES ENZIMATICAS

NIVEL: SÉPTIMO DRA. VERÓNICA CANDO. MGS.

✓ Las células vivas obtienen la energía y los componentes necesarios
para su supervivencia de un gran número de reacciones químicas.

✓ Para acelerar la velocidad de estos procesos metabólicos, las

células poseen catalizadores específicos denominados enzimas, que
hacen compatibles sus necesidades
metabólicas con las condiciones de
temperatura, pH y presión del medio
celular.
 LA CATALISIS ENZIMATICA
Posee características importantes:

✓ Elevada eficacia catalítica

✓ Recuperación del estado inicial

✓ Especificidad

✓ Permiten que tengan lugar las reacciones esenciales para el

desarrollo celular
Factores que intervienen en la catalisis enzimática

FACTORES CONSISTENCIA

Las enzimas aumentan la [ ] de sustratos y la

De proximidad y orientación proximidad en la orientación de grupos activos.

El centro activo de la enzima constituye una

Fenómenos de superficie zona con propiedades fisicoquímicas diferentes
al medio acuoso en el que la proteína está
disuelta.

La unión del sustrato al centro activo provoca

De distorsión o tención de enlaces cambios estructurales para conseguir un
complementariedad más perfecta .

El centro activo puede contener grupos

Presencia de grupos catalíticos catalíticos capaces de reaccionar con el
sustrato.
RX -Q MECANISMO DE LAS REACCIONES
INICIA ENZIMÁTICAS
 TEORIA DE LA LLAVE Y LA CERRADURA

Encajan exactamente, cualquier cambio impedirá su acoplamiento

(AJUSTE O ACOPLAMIENTO INDUCIDO)

 CINETICA ENZIMATICA

AL AUMENTAR LA (S) AUMENTA

LA VELOCIDAD DE REACCION, Y
ESTO ES LÓGICO PORQUE MIENTRAS
QUEDE ENZIMA LIBRE, A MAYOR
MOLÉCULAS DE SUSTRATO MÁS
MOLÉCULAS DE PRODUCTO
APARECERAN

VELOCIDAD CONSTANTE
Velocidad máxima que no es posible
superar
 CINÉTICA DE MICHAELIS-MENTEN
Vo= Vmax [S]
Km [S]
Describe. Relación de afinidad E-S
RE

NECESIDAD
[ S] aumenta- V decrece hasta la
Vmax no supera y Ctts. Reacción
2° orden

Km = Vmax/2 Calculo
[ S] Baja- V aumenta de forma Km pequeño # – gran –afinidad
lineal xS
Reacción 1° orden Km grande # – baja afinidad
de E por el S

Km = Define como la concentración a la que la velocidad de la

reacción enzimática es la mitad de la Vmax
 ACTIVIDAD CATALITICA

PROCESO INCREMENTA LA VELOCIDAD FAVORECIENDO UNA RUTA

DE MENOS COSTE ENERGÉTICO
FACTORES QUE INFLUYE EN LA VELOCIDAD DE LAS REACCIONES ENZIMÁTICAS

PH

Se denomina pH óptimo al pico de la curva donde su

velocidad es máxima, depende:
•Naturaleza y (S)
•Naturaleza y (E)
•Presencia de activadores e inhibidores
TEMPERATURA
La v de Rx enzimática aumenta
con la temperatura entre 1.5 a
2 veces por cada 10 0C de
aumento de temperatura pero
llega un momento que se
desnaturaliza y se destruye la
enzima disminuyendo su
actividad:
• Lenta
La velocidad inicial
de la enzima
aumenta con la T
pero la linealidad
• 25 – 32 0C es ctt
• 37 0C- OPTIMA
0
 REVERSIBILIDAD

Las enzimas catalizan reacciones

bioquímicas en los dos sentidos

E+S V1/V2 ES E+P

Llegando fácilmente a su estado de

equilibrio en unas y en otras las
reacciones se desarrollan en un solo
sentido
ESPECIFICIDAD DE ACCIÓN

- CUANDO LA ENZIMA CATALIZA UNA RX

EN FORMA PRECISA.

ESPECIFICIDAD DE SUSTRATO

EZ PRESENTA AFINIDAD PARTICULAR

POR EL SUSTRATO.
 EFECTORES ENZIMÁTICOS
SON SUSTANCIAS ORGÁNICAS E INORGÁNICAS
QUE MODIFICAN LA CINETICA DE LA REACCION
 ACTIVADORES

MODIFICAN CINÉTICA DE RX

MODIFICAN
CAMBIAN SU VALENCIA
ACTIVADORES
INORG. (OXI = RED)

• Forman Metal –S
• Forman E –M – S

• Altera la ctt de equilibrio de la rx

• Cu, K, Fe, Mo, Mg, Mn
 INHIBIDORES

MODIFICAN CINÉTICA DE RX

COMPETITIVOS NO COMPETITIVOS

Semejanza S Se fijan a una región de

competencia por la superficie de la ez
ocupar el centro afectando su Vmáx
activo
 Métodos de Medición Analítica en
Bioquímica Clínica
Utilidad Fase Analítica

Comprende:
❑ Diagnóstico • Técnicas analíticas
❑ Valoración del pronóstico y Procedimiento de análisis basados
del tratamiento en el comportamiento de la materia
❑ Investigación (analito)
❑ Ensayos clínicos de fármacos
• Espectrometría:::: Electroforesis

• Química Seca::::: Inmunoensayos

 • Métodos Analíticos
Son aplicaciones de las técnicas con parámetros y protocolos concretos.

• Características analíticas:
• Punto final
• Cinético
• Colorimétrico
• Enzimático
• Métodos de curva de calibración
• Reactivos usados
• Verde de bromocresol
• Glucosa oxidasa
• FASE Post-analítica
❖ Desde la obtención de resultados hasta que
el clínico solicitante tiene el informe
❖ “Fase decisiva para cumplir una calidad
Total
✓ Validación de Resultados
✓ Valoración técnica: es la aceptación de los
resultados obtenidos por las distintas técnicas.
✓ Valoración Clínica: Los resultados deben ser
coherentes con la clínica
✓ Informe de resultados
✓ Tiempo de respuesta
✓ Teoría de los valores de referencia
✓ Variaciones analíticas
✓ Variaciones extranalíticas
 Métodos de análisis
Método QUÍMICO
Se emplean en la determinación de una
molécula o de un elemento determinado, que se
halla inmerso en una mezcla con otras
moléculas o elementos

Los bioelementos poseen una

capacidad para emitir y absorber luz
de una determinada longitud de onda Requieren de la utilización de
de emisión característica de cada alguna característica diferencial
elemento.
 Método FÍSICO
Compuestos bioquímicos, es que son Solubilidad
muy parecidos en cuanto a
propiedades químicas
Polaridad

Punto isoeléctrico
Requerimiento de un
procedimiento previo

Basadas en las propiedades

Métodos separativos físicas de los componentes
 Método ENZIMÁTICO
La mayoría de las veces las técnicas separativas no
permiten determinar la presencia de una
determinada proteína en presencia de otras

Las enzimas son específicas de reacción y

sustrato, y los elementos que intervienen en la
reacción pueden determinarse, bien porque
presentan una característica que puede medirse
o bien porque pueden determinarse por medios
químicos.
 MÉTODOS FOTOMÉTRICOS

• MÁS ACCESIBLES Cubre un amplio intervalo de E

radiante, desde los rayos de
• NO REQUIERE INSTRUMENTACIÓN
longitud de onda corta hasta las
ESPECIAL ondas de radio, de longitud de
• EL COMPUESTO MEDIDO PUEDE onda larga.
TENER COLOR PROPIO O SER
INCOLORO
• CURVA DE RX DE TODA ENZIMA, SE
INDICA LA FORMACIÓN DEL P ES
Región Ultravioleta: 10-380 nm
DIRECTAMENTE PROPORCIONAL AL
TIEMPO.
Región Visible: 380-780 nm
Región Infrarroja: 780-30.000 nm
 Métodos para medir la () de
una sustancia por
Espectrofotometría

 Punto final o de equilibrio

Se incuba la muestra y el reactivo durante un tiempo determinado y a

una temperatura determinada para que se complete totalmente la
reacción, de tal forma que la sustancia que buscamos debe consumirse
totalmente. Si no fuera así y quedase parte de la sustancia sin consumir,
al medir el producto, estaríamos midiendo menos cantidad de la que
realmente hay. Por lo tanto se mide al final de un tiempo fijo de
incubación.
 Métodos para medir la () de una
sustancia por Espectrofotometría

 Métodos cinéticos

En ellos se mide la velocidad de la reacción mediante

la medida de la variación de la Absorbancia en el
tiempo y esto se relaciona con la concentración.
Es una medición continua, a diferencia de la del
punto final, se mide en tiempos regulares. Se puede
medir la cantidad de sustrato no transformado ó la
cantidad de producto formado
 MÉTODOS CINÉTICOS
❑ Denominada Puntos múltiples
❑ Miden minuto a minuto la formación del producto
durante 3 a 5 minutos
❑ Se garantiza saturación de la enzima, ausencia de
productos secundarios que interfieren en la valoración
e inhibidores
❑Test que intervienen coenzimas ( NAD, NADP NADH,
NADPH presentan diferente Absorbancia en la zona UV
 LOS MÉTODOS CINÉTICOS
POR LO TANTO SON RÁPIDOS
Y CONFIABLES POR SU
EXACTITUD QUE LOS
MÉTODOS COLORIMÉTRICOS
 MÉTODOS OPTIMOS

•Sociedad Alemana de Química Clínica

•Condiciones de Reacción Estandarizadas para
8 enzimas como:
• TGP, TGO, GLDH, CK, LDH, PAC, PAL, AP
(leucina aminopeptidasa).
 LA ESTANDARIZACIÓN COMPRENDE

▪Temperatura de Rx a 25°C
▪Clase y estandarización del sol. Tampón
▪Valor del pH
▪Relación del volumen de la muestra con el volumen total
de la muestra
▪[S] que permita la valoración de todas las isoenzimas.
▪Cofactores y efectores
SELECCIÓN DE MÉTODOS

1. SENSIBILIDAD
2. REPRODUCTIBILIDAD- LABORATORIOS
3. EXACTITUD-VALOR REAL
4. MEDICIÓN (FASE INICIAL)
5. NÚMERO DE PASOS- NO PASOS
6. VOLUMEN DE MUESTRA – SER FIJO
ORIGEN DEL AUMENTO A NIVEL ENZIMÁTICO
TEORÍA NECRÓTICA

Sucede cuando existe una destrucción de células (necrosis),

haciendo que las enzimas celulares salgan al líquido extracelular.
 TEORÍA DE LA PERMEABILIDAD
La destrucción celular alrededor de la lesión

- ANOXIA
- FALTA SUSTRATO
- INTENSA
RADIACION
- DESHIDRATACION
- INTOXICACION

Significa la pérdida de energía necesaria para

la conservación de su estructura celular y
actividad biológica, haciendo que las enzimas
celulares pasen al plasma sanguíneo.
TEORÍA DEL SÍNTOMA INESPECÍFICO
• SE CONSIDERA EL AUMENTO
ENZIMÁTICO SÉRICO COMO UN
SÍNTOMA INESPECÍFICO DEL
SÍNDROME AGUDO, NO SE PUEDE
EXPLICAR COMPLETAMENTE POR UN
SOLO Y ÚNICO MECANISMO
 DETERMINACIÓN DE LAS ENZIMAS

• OBTENCIÓN DE LA MUESTRA

FEMORAL
CAPILAR(OREJA,
DEDO, TALÓN)
SANGRE VENOSA
 •POSICIÓN DEL CUERPO  DIETA

•MEDICAMENTOS SUERO HEMOLIZADO CONSERVACIÓN

24 – 48 h – 4º C
6 meses a – 20º C
LABORATORIOS ESPECIALES

CONTAMINACIÓN
CONSIDERACIONES IMPORTANTES EN LOS ENSAYOS DE
ACTIVIDAD ENZIMÁTICA
• No utilizar muestras congeladas y descongeladas
varias veces.

• Separar lo antes posible el coágulo del suero

• Evitar trabajar con muestras hemolizadas

• Evitar estasis venosa durante la extracción

• Evitar el envejecimiento de las muestras

• El transporte de las muestras debe realizarse en frío sin

congelar, salvo que se vaya a prolongar mucho tiempo.
CONSIDERACIONES IMPORTANTES EN LOS ENSAYOS DE
ACTIVIDAD ENZIMÁTICA

Variables que afectan al análisis clínico. EDTA y hemólisis

EDTA:
Su efecto anticoagulante se basa en su capacidad para quelar iones
divalentes como calcio o magnesio. No es posible determinar la
actividad de enzimas que requieran estos iones.

MUESTRAS HEMOLÍTICAS:
La ruptura de los eritrocitos hace que su contenido pase al plasma.
Las muestras presentan una coloración roja intensa muy característica
debida a la presencia de hemoglobina.
La hemólisis puede ser causada por una patología o, en la
mayor parte de los casos, un procesamiento
indebido de la muestra.
PROTEGER EL HÍGADO
 Lectura

Bicromático

Esta técnica está basada en la premisa que

aunque un compuesto puede dar una
interferencia espectral, la absorbancia máxima
del interferente será diferente de la reacción
analítica verdadera

El uso de este procedimiento permite

también que cada muestra sea
utilizada como su propio blanco para
el color endógeno.
Esta técnica involucra la medición de
la absorbancia de una mezcla de
reacción a dos longitudes de onda
diferentes simultáneamente. Estas son:

- la longitud de onda principal (1 )

- Longitud de onda cercana (2) Curva de calibración

 En relación a los equipos

1 es la longitud de onda a la cual el
automatizados y su
cromógeno tiene la máxima
correcto funcionamiento
absorción. En 2 hay un mínimo de para realizar una lectura
absorción del cromógeno. Como la hay que tener bien en
reacción es monitoreada claro que no se puede
simultáneamente a dos longitudes de procesar un método si no
onda, ésta es conocida como análisis ha programado
bicromático. previamente el equipo
analizador.