LABORATORIO N° 2

ENZIMOLOGÍA

Bioquímica General
Objetivos de trabajo
• Estudiar la actividad enzimática de la enzima
fosfatasa ácida.

• Determinar la curva de progreso de la reacción

catalizada por la fosfatasa ácida.

• Determinar el efecto de la concentración de sustrato

en la velocidad de una reacción enzimática.

• Determinar el efecto del pH y la temperatura sobre la

actividad enzimática.
Reacciones Químicas

Reacciones Bioquímicas

Catalizadores

Enzimas
 ¿Qué es catálisis?
Si la reacción ocurre sin interferencia, eventualmente, parecerá como si se detuviera.
Lo que sucede realmente es que tanto la reacción directa como la inversa están ocurriendo en el
mismo grado.
A + B C + D
Equilibrio químico se expresa
Keq = [C][D]
[A] [B]
Esta constante es característica de la reacción.

Características de los catalizadores

• Aumenta la velocidad a la que la reacción se acerca al equilibrio, pero no
altera la naturaleza del estado de equilibrio.
• Son muy efectivos en cantidades muy pequeñas, con respecto a las
cantidades a catalizar.
Cinética enzimática
Teoría cinética de la materia
Una solución está formada por un conjunto de moléculas que se
mueven a una velocidad determinada. Como se encuentran en
movimiento, ellas chocan entre sí y cada colisión involucra una
cierta cantidad de energía.
En esta teoría, se considera que Si la
colisión no involucra suficiente energía, la
reacción no ocurre, pero si la energía es lo
suficientemente alta, las moléculas se combinan
para formar un intermediario activado (B*),
estableciendo un estado de transición. Esto lo
podemos representar mediante la siguiente
reacción, donde A es el sustrato, B* es el
complejo activado y C es el producto:
A B* C
 Energía libre de Gibbs
El cambio de Energía libre ó DG, es la diferencia de energía libre que se produce entre el estado
inicial (sustrato) y el producto final. Si observas los gráficos anteriores, te darás cuenta que el DG es el
mismo independientemente de ocurra con o sin enzima, por lo que la termodinámica de la reacción no
ha cambiado.
 Actividad enzimática
La actividad enzimática de una enzima corresponde a la cantidad
de producto formado (o de sustrato consumido) por unidad de
tiempo, tal como muestra la curva de progreso.

V0

La Comisión de Enzimas de la Unión internacional de Bioquímica ha

definido la unidad de enzima como: “la cantidad de enzima que
cataliza la transformación de 1 mmol (micro mol) de sustrato por curva
minuto bajo condiciones definidas”. asintótica

La mayoría de los estudios de cinética enzimática se centran en el período inicial, es decir, en la

zona lineal de la reacción enzimática, la velocidad que se determina en esta zona lineal se conoce
como VELOCIDAD INICIAL (Vo). Sin embargo, también es posible medir toda la curva de la reacción
y ajustar estos datos a una ecuación no lineal. Esta forma de medir las reacciones enzimáticas es
denominada análisis de la curva de progreso.
 Métodos de análisis.
✓Blanco sustrato: Mezcla de reacción semejante a la mezcla en la que
se detecta la actividad enzimática (se reemplaza la solución que
contiene el sustrato por un volumen equivalente de solvente)

✓Blanco Enzima: Mezcla de reacción semejante a la mezcla en la que

se detecta la actividad enzimática (se reemplaza la solución que
contiene la enzima por un volumen equivalente de solvente)

✓Blanco tiempo cero: La reacción es detenida en el momento mismo

en que se inicia (tiempo cero).
ACTIVIDAD ENZIMÁTICA
• La actividad de una enzima se determina midiendo la cantidad
producto formado (o de sustrato consumido) por unidad de tiempo.

Factores que afectan la actividad enzimática

CONCENTRACIÓN DE ENZIMA

CONCENTRACIÓN DE SUSTRATO

TEMPERATURA

pH

INHIBIDORES
 CONCENTRACIÓN DE ENZIMA

Cuanto mayor cantidad de enzima este presente, mayor será la velocidad que se
alcanzará, debido a que se necesita más cantidad de sustrato para que la enzima se
sature.
 CONCENTRACIÓN DE SUSTRATO

Aumenta la cantidad de sustrato la velocidad aumenta en forma lineal (zona proporcional), luego si bien la
velocidad continúa aumentando ya no lo hace en forma lineal (zona mixta) hasta que finalmente la reacción
alcanza una velocidad máxima que es constante, se vuelve independiente de la cantidad de sustrato (zona
de saturación).

¿Por qué?
 Efecto de la concentración del sustrato:
Cinética de Michaelis-Menten
La cinética enzimática comienza a inicios del 1900 con la derivación de la
Ecuación de Michaelis-Menten, la que describe la relación entre la
velocidad de la reacción y la concentración de sustrato:

La velocidad inicial (V0) de la reacción queda definida por la ECUACIÓN DE MICHAELIS-MENTEN:

Donde:
V0 = Velocidad inicial de la reacción
Vmax = velocidad máxima
[S] = concentración de sustrato
Km= constante de Michaelis-Menten
Km y Afinidad
• Km corresponde a la concentración de sustrato a la cual la enzima
alcanza la mitad de su velocidad máxima.
• Grado de afinidad de la enzima por un sustrato.

¿Qué significa un Km alto y uno bajo?

Km alto Baja afinidad

Km bajo Alta afinidad

Gráfico de Velocidad de Reacción versus Concentración de sustrato
(V0/[S])

• La magnitud de Km es un valor característico para la combinación de cada

enzima con su sustrato. Al graficar V0 /[S] se tendrá el siguiente gráfico.
Si te fijas en el gráfico de la imagen 3, observarás claramente
que la velocidad inicial presenta dos fases:

• Primera fase: En ella, la velocidad de la reacción es ½ Vmax

Vmax
directamente proporcional a la concentración de sustrato, es
decir, es de orden uno.

• Segunda fase: La velocidad de la reacción se vuelve

independiente de la concentración de sustrato, es decir, es de
orden cero. Esto ocurre cuando la enzima es saturada por el
sustrato, de manera que aunque aumentemos la
Km
concentración de sustrato, la velocidad se mantiene
constante.
 Gráfico de dobles recíprocos
• Lineweaver y Burk proponen un tipo de gráfico que considera el
inverso de la velocidad inicial (1/V0) y el inverso la concentración de
sustrato (1/[S]).
Gráfico de dobles recíprocos.

Pendiente=
Km/Vmax

1/Vmax

-1/Km
LINEALIZACIÓN Ec. Michaelis-Menten
Directamente el valor de Km (el intercepto con el eje x es igual a -
1/Km) y Vmax (el intercepto con el eje y es igual a 1/Vmax). Este
gráfico está representado por la siguiente función:
Pendiente de la recta Intercepto con el
eje y
 TEMPERATURA

• ¿Cómo se relacionan la actividad enzimática y la temperatura?

pH
 INHIBIDORES
Irreversibles
Estos inhibidores se unen
COVALENTEMENTE a algún
aminoácido del sitio activo.
Producen cambios
permanentes en la molécula
de enzima, con deterioro
definitivo de su capacidad
catalítica.
Reversibles
Unión NO COVALENTE de un inhibidor
a la enzima, pero difieren en los
mecanismos por medio de los cuales
disminuyen la actividad enzimática y
en la forma en que afectan la cinética
de la reacción.
COMPETITIVO
NO COMPETITIVO
INCOMPETITIVO
INHIBIDOR COMPETITIVO
• Compiten con el sustrato por el sitio activo de la enzima (por lo tanto,
AUMENTA Km). Si aumentamos la cantidad de sustrato, éste desplaza
al inhibidor del sitio activo, alcanzándose la Vmax.

AUMENTA Km
Vmax no cambia
 INHIBIDOR INCOMPETITIVO (ACOMPETITIVO)
Se fijan a un sitio distinto al del sustrato, con la diferencia que
solamente se fija al complejo enzima-sustrato.

DISMINUYE Km
DISMINUYE Vmax
INHIBIDOR MIXTO
• Se unen a un sitio distinto del sitio activo denominado sitio alostérico, de manera
que el inhibidor se une tanto a la enzima libre como al complejo enzima sustrato.
• El efecto de estos inhibidores NO se revierte agregando más sustrato, por lo que
la Vmax es menor a la que se alcanzaría sin inhibidor, mientras que la Km es
mayor a la que se alcanzaría en ausencia de un inhibidor

AUMENTA Km
DISMINUYE Vmax