Capítulo 4:

Determinación de Proteína
 Conocer el contenido de proteína a través de la elección del método adecuado. Por la naturaleza de este
componente en el alimento, su importancia nutricional, y utilización de sus propiedades funcionales, el análisis se
hace necesario. Conocer las diversas técnicas para su determinación, nos permite discernir en la elección del
método ya sea en alimentos, mezclas alimenticias, valor nutritivo, durante su purificación; así también, para
profundizar su estudio (caracterización).
Contenido:
4.1. Determinación de proteína total
4.2. La proteína y el contenido del nitrógeno de algunos alimentos
4.3. Métodos físicos y químicos de análisis de proteínas
Actividades:
 Lectura del tema, previo a la clase, proporcionado por el profesor
 Interpretación y participación en clase, 24 y 30 Julio
 Entender los fundamentos de las técnicas utilizadas y saber discernir su utilización

Trabajo personal y/o grupal:

 Revisar la bibliografía recomendada y otras a fines al tema. Complementar la clase
 Presentación de trabajo grupal referido a: Métodos para la determinación de Proteína.
Entrega 30 de Julio

Capítulo 4: Determinación de Proteína Curso: Análisis de Alimentos

  Las proteínas abundan en un gran número de alimentos ……. los alimentos cárnicos,
lácteos, huevos y pescado. Los cereales, las legumbres y frutos secos. El contenido de
nitrógeno no proteínico es alto en ciertos alimentos (pescado, frutas y verduras)

 El análisis de proteína es necesario cuando se requiera saber

 Contenido total de proteínas
 Contenido de una proteína particular en una mezcla.
 Contenido de proteínas durante el aislamiento y purificación de una proteína
 Nitrógeno no proteico
 Composición de aminoácidos
 Valor nutritivo de una proteína

 Proteína bruta: proteínas propiamente dichas, péptidos de bajo peso molecular,

aminoácidos, amidas, sales de amonio, alcaloides, ácidos nucleicos y similares

 Los factores para convertir nitrógeno en proteína se basan en el contenido promedio de

nitrógeno de las proteínas encontradas en alimentos particulares de 15 a 18%; en
promedio 16% …. 6.25

Capítulo 4: Determinación de Proteína Curso: Análisis de Alimentos

 Métodos químicos de análisis de proteínas
 Método de Kjeldahl
 Método de Dumas (combustión de nitrógeno)
 Métodos físicos de análisis de proteína
 Métodos espectrofotométricos
 Absorción ultravioleta a 280 nm
 Métodos colorimétricos
o Método de Biuret
o Método de Lowry
o Métodos del ácido bicinconínico
o Método de unión con colorantes
• Colorantes aniónicos
• Método de Bradford
 Espectroscopía infrarroja
 Método refractométrico
 Turbidimetría
Capítulo 4: Determinación de Proteína Curso: Análisis de Alimentos
 Método de Kjeldahl
Combustión en húmedo de la muestra por calentamiento (360 – 410 ºC) con ácido sulfúrico concentrado en
presencia de catalizadores metálicos, el nitrógeno orgánico se reduce hasta amoniaco, quedando en solución
como sulfato de amonio. El digerido, se alcaliniza y se destila (directamente o por arrastre con vapor) para
desprender el amoniaco, el cual es atrapado y luego se titula.
 También se determina ácidos nucleicos y sales de amonio y también nitrógeno ligado a compuestos aromáticos
(pirazina, ciclopentapirazina, pirrol y oxazol) y a vitaminas (B1, B2 y B3). El bajo contenido de compuestos
aromáticos y vitaminas nitrogenados, el error se considera despreciable
 No incluye el nitrógeno inorgánico de por ejemplo, nitratos y nitritos
 Técnica más confiable para la determinación de nitrógeno orgánico. Se incluye en métodos oficiales y
reglamentarios

Método de Dumas
La muestra se somete a combustión completa (700-1000 °C) en presencia de oxígeno puro, el carbono se
transforma a CO2; el N presente, a N2 y NO. Los gases formados son arrastrados con CO2 a través de una columna
de cobre caliente (600 °C) que reduce el NO2 a N2 (gas). El nitrógeno gaseoso puede ser medido mediante GC
con detector de conductividad térmica (TCD). El nitrógeno total incluye el inorgánico

Capítulo 4: Determinación de Proteína Curso: Análisis de Alimentos

 A: Matraz de fondo redondo para la generación
de vapor
B: Trampa para la recolección de residuos líquidos
C: Matraz de destilación
D: Embudo para la adición de la solución de
muestra e NAOH
E: Condensador
F: Matraz receptor
G: Pinza

Capítulo 4: Determinación de Proteína Curso: Análisis de Alimentos

 Metodo refractómetricos
 La mayoría de las proteínas en solución producen un incremento en el índice de refracción de
aproximadamente 0.001 por cada gramo “disuelto” en 100 ml

 Conocer el índice de refracción del disolvente y controlar la temperatura de medición

 Determinación del contenido de caseína en la leche: la proteína se separa por precipitación con ácido, se lava
el precipitado y luego se disuelve en una solución de álcali de índice de refracción conocido

 El índice de refracción de la solución y, por cálculos o por referencia a tablas de proporcionalidad, se establece
la concentración de caseína

Capítulo 4: Determinación de Proteína Curso: Análisis de Alimentos

 Turbidimétrico
 Precipitación de la proteína con ac. tricloroacético, ferrocianuro de potasio o ac. acético. Se produce turbidez
que es estandarizada a T°, concentración y tiempo de reacción. Se mide a 600 nm

 Se recomienda de 0.5-1.5 mg de proteína

 Ventaja: Método rápido (10-15 min)

 Desventajas:

 No todas las proteínas precipitan en la misma forma en presencia de ácido

 Los ácidos nucleicos también precipitan

Capítulo 4: Determinación de Proteína Curso: Análisis de Alimentos

Capítulo 4: Determinación de Proteína Curso: Análisis de Alimentos
Capítulo 4: Determinación de Proteína Curso: Análisis de Alimentos
Capítulo 4: Determinación de Proteína Curso: Análisis de Alimentos
Capítulo 4: Determinación de Proteína Curso: Análisis de Alimentos
 Métodos para evaluar la hidrólisis de proteína
Grado de hidrólisis (degree of hydrolysis, DH). Porcentaje de enlaces peptídicos hidrolizados. Al hidrolizar un enlace
peptídico se libera un grupo amino y un grupo carboxilo; el aumento en la concentración de tales grupos indica el
progreso de la hidrólisis. Se compara los grupos amino antes y después de la hidrólisis.
Análisis Técnica
Reacción de ninhidrina
Cromogénica
Espectrofotometría
Reacción de TNBS Evalúa el grupo amino libre
Reacción de fluorescamina Fluorometría
Titulación con formol Potenciometría
pH-stat Grupo -amino libre
Hidrólisis proteica:
 Generalmente por hidrólisis enzimática, producen polipéptidos más pequeños en PM
 Objetivos: aumento de la solubilidad por reducción del tamaño del péptido, mejora el valor funcional,
organoléptico y nutricional de un producto alimenticio
 Emplea fuentes de proteínas no convencionales para alimentos de animales y humanos
Capítulo 4: Determinación de Proteína Curso: Análisis de Alimentos
 Reacción con Ninhidrina
Los aminoácidos reaccionan con la ninhidrina para producir CO2, NH3 y, usualmente, un aldehído con un carbono
menos que el aminoácido original. La ninhidrina también reacciona con NH3 y aminas primarias. El producto
púrpura-azul formado se mide a 570 nm. La Pro y la hidroxiprolina dan un producto amarillo, se mide a 440 nm . Es
la técnica más usada

Reacción de ninhidrina con Pro e Hidroxiprolina,

Reacción de ninhidrina con un aminoácido, produciendo el producto amarillo
produciendo producto púrpura-azul
Wrolstad et al. (2001). Current Protocols in Food Analytical Chemistry

Capítulo 4: Determinación de Proteína Curso: Análisis de Alimentos

 Reacción con TNBS
El TNBS (2,4,6-trinitrobenceno 1-sulfónico ácido) sólo reacciona con los grupos amino primarios de los aminoácidos,
péptidos y proteínas en condiciones ligeramente alcalinas (pH 8 a 9). Los grupos amino deben estar en estado no
protonado. La reacciona se mide a 340 nm. El color para aminas, aminoácidos, péptidos y proteínas son
prácticamente similares. Alta reproducibilidad, pero es difícil aplicar a todas las proteínas, ejm proteínas
parcialmente insolubles. El buffer fue modificado con SDS para aumentar la dispersión de las proteínas

Reacción TNBS

Wrolstad et al. (2001). Current Protocols in Food Analytical Chemistry

Capítulo 4: Determinación de Proteína Curso: Análisis de Alimentos

 Reacción con fluorescamina
Fluorescamina reacciona con aminas primarias para formar fluoróforos (excitación a 390 nm y emisión a 475 nm).
Los péptidos reaccionan con fluorescamina a pH 7.0, dando mayor fluorescencia que los aminoácidos que
reaccionan a pH 9. La fluorescencia es proporcional a la concentración de amina. Es confiable y rápida.

Reacción con fluorescamina

Wrolstad et al. (2001). Current Protocols in Food Analytical Chemistry

Capítulo 4: Determinación de Proteína Curso: Análisis de Alimentos

 Titulación con formol
La reacción de la muestra con formaldehído libera un ion H+ del grupo amino, que se valora
potenciométricamente con una solución de NaOH

La HIs no reacciona. La Pro e hidroxiProprolina reaccionan 75%. Las aminas terciarias como las del grupo de
guanidina no interfieren con la reacción.

pH-STAT
pH-stat evalúa el progreso de la hidrólisis titulando los grupos amino liberados con una solución alcalina. Es
necesario solución amortiguadora para la acción de enzimas sobre los enlaces peptídicos

Capítulo 4: Determinación de Proteína Curso: Análisis de Alimentos

 ELECTROFORESIS
Método analítico-semipreparativo, separa biomoléculas
Migración de solutos iónicos bajo la influencia de un campo eléctrico

Los métodos electroforéticos son de alta sensibilidad, poder de resolución y versatilidad

Separación de mezclas complejas de ácidos nucleicos, proteínas y otras biomoléculas, donde aportan un
potente criterio de pureza
Brinda características ácido-básicas de las proteínas presentes en un extracto crudo
Determinar parámetros como peso molecular, punto isoeléctrico y número de cadenas polipeptídicas de las
proteínas

Capítulo 4: Determinación de Proteína Curso: Análisis de Alimentos

 Moléculas cargadas, migran a los electrodos de polaridad opuesta cuando se encuentren en un campo
eléctrico, hacia el cátodo o ánodo (electrodos - y +)
La migración está en función de la combinación de su carga, peso molecular y estructura tridimensional
La magnitud de la carga eléctrica depende de la molécula, el pH y la composición del medio en que se
encuentre
La movilidad de las moléculas: viscosidad del medio, tamaño, forma y carga de la molécula; principalmente, de
grupos ionizables presentes en la superficie de la partícula, signo y magnitud de la carga de los grupos ionizables

La velocidad de migración depende de la densidad de carga de la molécula (relación carga/peso), voltaje
aplicado y porosidad del gel de electroforesis
Capítulo 4: Determinación de Proteína Curso: Análisis de Alimentos
 Esquema de la electroforesis desnaturalizante en poliacrilamida
(SDS-PAGE) en una dimensión (1D)

Badui, S. Química de los Alimentos)

Capítulo 4: Determinación de Proteína Curso: Análisis de Alimentos

1. Polimerización vinílica del
monómero acrilamida y del
monómero entrecruzador bis-
acrilamida

CH2=CH-CO-NH–CH2-NH-CO-CH=CH2

CH2=CH-CO-NH2

2. Formación de radicales
libres del monómero; se
producen por radicales
libres de oxígeno, por
causa de la acción de
iones persulfato

3. Las aminas terciarias como el TEMED se emplean

como catalizadores de esta reacción; causan la
formación de radicales libres del persulfato

Capítulo 4: Determinación de Proteína Curso: Análisis de Alimentos

 Electroforesis en gel de poliacrilamida dodecil sulfato de sodio (SDS-PAGE)

Caracterización de las proteínas, determinación del peso molecular y pureza

Casi todas las proteínas son solubles en SDS (detergente aniónico), se une a las proteínas con alta afinidad, les
confiere una carga negativa a los polipéptidos y “relaja” las estructuras más “altas” de las proteínas
Es esencial la disrupción de la estructura terciaria y cuaternaria: separación de acuerdo con el PM
Los R-S-S-R' inter e intra-moleculares de los polipéptidos mediante la adición de agentes reductores tales como
ditiotreitol (DTT) o 2-mercaptoetanol y calentamiento posterior ocasiona disociación de las sub-unidades

Capítulo 4: Determinación de Proteína Curso: Análisis de Alimentos

 Electroforesis en gel de poliacrilamida no denaturante

La electroforesis no desnaturalizante se utiliza para analizar proteínas preservando al mismo tiempo la estructura
nativa y la conformación
En condiciones nativas, la separación depende de tamaño, forma y carga de la proteína
Las muestras de proteína no deben contener desnaturalizantes fuertes como SDS

Capítulo 4: Determinación de Proteína Curso: Análisis de Alimentos

 100000

10000

1000

100
2.0 4.0 6.0 8.0 10.0 12.0 14.0 16.0

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