Tema 5

Teoría de la cromatografía

1.CONCEPTO Y CLASIFICACIÓN DE LAS TÉCNICAS CROMATOGRÁFICAS

Comprende un amplio abanico de técnicas utilizadas para separar y analizar muestras complejas.
Los componentes de las muestras se distribuyen entre dos fases (o entre una fase y una interfase), una móvil y
la otra estacionaria.
La fase móvil avanza en la dirección del eje del sistema separador, manteniendo un íntimo con la fase
estacionaria. Cuando una muestra entra en un sistema cromatográfico, la fase móvil tiende a hacer avanzar
sus componentes en la dirección del flujo, y la fase estacionaria a retenerlos. Los componentes más retenidos
viajan a menor velocidad, y son eluídos más tarde que los componentes retenidos. A la salida del sistema
cromatográfico se dispone de uno o varios detectores para identificar y cuantificar los componentes a medida
que van siendo eluídos. En general, las separaciones cromatográficas son rápidas, reproducibles y selectivas,
siendo posible en poco tiempo separar muestras muy complejas, y distinguir entre solutos con propiedades
muy similares.

Clasificación de técnicas cromatográficas:

La gran diversidad de las técnicas cromatográficas aconseja utilizar al menos tres criterios distintos para su
clasificación: naturaleza de las fases, diseño del sistema separador y modo operativo. El estudio de estos tres
criterios es útil para tener una visión global de las técnicas cromatográficas.

A) Por la naturaleza de las fases

Atendiendo a la naturaleza de la fase móvil se distingue entre cromatografía gaseosa, GC (la fase móvil es un
gas), cromatografía líquida, LC (la fase móvil es un líquido), y cromatografía de fluidos supercríticos, SFC (la
fase móvil es fluido supercrítico).
La naturaleza de la fase estacionaria es especialmente importante porque establece el mecanismo de
retención, que es el responsable de la separación de los componentes de la muestra. Atendiendo a la
naturaleza de la fase estacionaria se tienen a su vez subdivisiones tales como:

1. Cromatografía gaseosa por adsorción o gas-sólido

La fase estacionaria es un sólido, y la separación es producto del equilibrio de los solutos entre el estado
gaseoso y su adsorción sobre la superficie del sólido. Solo se utiliza en la separación de gases permanentes,
como oxígeno, nitrógeno, argón, etc. La separación de moléculas más complejas mediante cromatografía
gaseosa de adsorción es problemática (los picos aparecen con largas “colas”), debido a que la superficie de los
sólidos es muy irregular, presentando lugares muy activos y otros pocos activos.

2. Cromatografía gaseosa por disolución o gas-líquido

La fase estacionaria es un líquido. Las fases estacionarias forman una película muy delgada (unas decenas de
micras) sobre un soporte sólido. Pueden estar simplemente depositadas sobre el soporte sólido (fase retenida
por mojado), o bien puede tratarse de un polímero retenido sobre la superficie mediante uniones covalentes
(fase enlazada). La separación de los solutos es producto de su equilibrio entre su estado gaseoso y su
disolución en el líquido. No es un equilibrio de reparto, ya que la fase móvil es un mero vehículo de transporte
de los analitos en estados gaseoso, no teniendo afinidad ninguna por los solutos. Se parece más a una
destilación fraccionada que a una verdadera cromatografía.
Es muy utilizada en la separación de todo tipo de solutos a condición de que sean volátiles a temperatura no
superiores a unos 350ºC, o que se puedan convertir fácilmente en derivados volátiles.
 3. Cromatografía líquida de adsorción o líquido-sólido
La fase estacionaria es la superficie de un sólido, y la separación de los solutos es producto de su equilibrio
entre la fase móvil y la interfase líquido/sólido. Se utiliza poco con finalidad analítica, pero es muy habitual con
fines preparativos.

4. Cromatografía líquida de absorción o reparto líquido-líquido

La fase estacionaria es una fase líquida enlazada, y la separación de los solutos es producto de su equilibrio
entre las dos fases líquidas. Permite alcanzar eficacias muy altas, por lo que es muy utilizada. La cromatografía
líquida de alta eficacia se conoce como HPLC. La HPLC es muy habitual en la identificación y cuantificación de
todo tipo de solutos. Es especialmente útil en la separación y determinación de solutos no volátiles, que no
pueden ser separados por GC.

5. Cromatografía líquida de intercambio iónico

La fase estacionaria es una fase líquida enlazada con capacidad para intercambiar iones. Los solutos deben ser
iónicos, y su separación es producto de los equilibrios de desplazamiento de unos iones por otros del mismo
signo. Se practica tanto con fines preparativos como analíticos. En este último caso, se suele practicar a alta
precisión, y se conoce como IC. La IC es “HPLC de intercambio iónico”.

6. Cromatografía líquida de exclusión

La fase estacionaria es un sólido poroso, con poros de tamaño molecular. La separación de los solutos es
producto de la discriminación por tamaños, esto es, de la retención de los solutos de menor tamaño en el
interior de los poros. Se practica a alta presión, y se conoce como SEC.
Es importante en el análisis de macromoléculas de origen bioquímico o sintético.

B) Por diseño del sistema separador

Las técnicas cromatográficas se suelen clasificar también de acuerdo con el diseño del sistema separador, o
forma del medio físico en el que se produce la separación. Atendiendo a este criterio se distingue entre
cromatografía en columna y en lecho abierto.
En GC es muy habitual el trabajo con columnas, cuyos diámetros son inferiores a 1mm, y con longitudes que
oscilan entre 15 y 90 m. En estas columnas, la fase estacionaria es el recubrimiento de la pared interna, y la
fase móvil circula por el canal central. En GC se utilizan también columnas de relleno, de varios milímetros de
diámetro, y con longitudes de entre 1 y 10 m. En estas columnas, la fase estacionaria es el recubrimiento de las
partículas. Las columnas capilares proporcionan separaciones mucho más eficaces, por lo que son utilizadas
con mucha mayor frecuencia.
Las columnas para HPLC son mucho más cortas, típicamente entre 3 y 30 cm, y con diámetros internos entre 1
y 4 mm.
En HPLC se utilizan dos tipos de lecho cromatográfico:

1) Columnas empaquetadas o particuladas

Con un relleno de partículas porosas. Los rellenos de buena calidad contienen partículas
aproximadamente esféricas de un estrecho rango de tamaños (casi iguales), empacadas al azar.
El espacio libre interparticular, por donde circula la fase móvil, es del orden del 40% del
espacio total ocupado por el relleno (porosidad interparticular es 0,4).
 2) Columnas monolíticas
Constituidas por una pieza única de sílice porosa o de un polímero poroso. Son mucho menos
utilizadas que las empaquetadas (inicio de su desarrollo). El espacio libre o porosidad es
bastante mayor que los rellenos de partículas, lo que permite mantener un alto caudal de fase
móvil con una presión baja.

La fase estacionaria puede ser la superficie de las partículas o del monolito, pero más frecuentemente está
constituida por su recubrimiento. La eficacia es inversamente proporcional al tamaño de las partículas en
columnas de relleno, y al diámetro de los poros en columnas monolíticas. Por esta razón las mayores eficacias
se consiguen con partículas muy finas (diámetros de 1,7 a 5 micrómetros), o con monolitos con poros muy
estrechos (del orden de 2 a 4 micrómetros). A cambio, se requiere una alta presión para mantener el caudal de
fase móvil, especialmente en el caso de las columnas empaquetadas.
Por su parte, las distintas técnicas cromatográficas en lecho abierto utilizan los siguientes soportes:
- Capa fibrosa: la fase estacionaria es una lámina de papel (celulosa) o de acetato de celulosa.
- Capa de partículas: la fase estacionaria es una capa delgada de partículas
depositada sobre una lámina soporte (de vidrio, aluminio o plástico). La naturaleza
de las partículas y de la fase estacionaria son las mismas que en cromatografía en
columna, si bien se incorpora un aglomerante para mantenerlas adheridas a la
placa y entre sí. La técnica se conoce como cromatografía de capa fina (TLC).
- Capa de gel: la fase estacionaria es una capa delgada de gel poliacrilamida o de
otro polímero insoluble microporoso depositada sobre una placa o lámina soporte.

C) Por el modo operativo

Atendiendo al modo operativo se distinguen 3 tipos de cromatografía: la elución zonal, la elución frontal y la
elución por desplazamiento. El modo más utilizado en cromatografía analítica es la elución zonal. Sin embargo,
es importante conocer los otros modos de trabajo, que tienen su utilidad en ámbitos y
aplicaciones concretas:

1) En elución zonal o por bandas

La muestra se introduce toda de una vez, procurando que se ocupe una zona o franja estrecha al
principio del sistema separador. A continuación, se eluye con un flujo continuo de fase móvil.
Idealmente, los componentes de la muestra se obtendrán en forma de picos aislados a la salida
del sistema separador.

2) En elución frontal
La muestra se introduce en el sistema de forma continua, constituyendo ella misma la fase móvil.
El sistema separador retiene selectivamente uno (o algunos) de sus componentes y deja pasar el
resto. El componente (o componentes) retenido no eluye hasta que el sistema separador se
satura (no es capaz de retener más). Si se retienen varios solutos, se eluye primero el menos
retenido. Los más retenidos eluyen más tarde, en orden de retención creciente. No se obtienen
bandas, sino frentes formados por los solutos que alcanzan su saturación en el sistema.
La elución frontal se utiliza con dos finalidades:
a) Preconcentrar traza que son posteriormente eluídas en un pequeño volumen mediante
un cambio de composición de eluyentes (es el modo habitual de trabajar en extracción en fase
sólido).
b) Purificar grandes volúmenes de disolventes, incluida la purificación de agua (se utiliza una columna
para retener las impurezas indeseadas).
 3) Elución zonal
En elución por desplazamiento la muestra se introduce toda de una vez, ocupando una estrecha
zona al comienzo del sistema separador. Como fase móvil se utiliza un disolvente que es
fuertemente retenido por la fase estacionaria. El disolvente desplaza a todos los componentes de la
muestra de sus sitios de unión con la fase estacionaria. Se tiene así una estrecha zona de muestra
que avanza rápidamente en el interior del sistema.

Debido a la elevada concentración de los componentes en dicha zona, la columna se satura en ellos
(hasta que el disolvente los desplaza). Los componentes más retenidos desplazan o “empujan” a los menos
retenidos, los cuales eluyen primero, inmediatamente seguidos de los componentes más retenidos, siempre
en orden de retención creciente. Se tienen separaciones poco eficaces pero muy rápidas. La elución por
desplazamiento es poco habitual salvo en algunas industrias (disolventes y combustibles).

2.PARÁMETROS FUNDAMENTALES EN CROMAT OGRAFÍA

Los parámetros cromatográficos, se puede dividir en tres grupos: geométricos, operativos y característicos de
los solutos.
Parámetros geométricos: son los que dependen únicamente del diseño físico del sistema separador, siendo
independientes de las condiciones de trabajo y de la naturaleza de los solutos. Son:
- Volumen total (VT)
- Volumen ocupado por la fase móvil (Vm)
- Volumen ocupado por el soporte sólido (VSS)
- Volumen ocupado por la fase estacionaria (VS)
- Longitud de la columna (L)
El volumen ocupado por la fase móvil, VM, incluye todos los espacios accesibles a la fase
móvil, desde el punto donde se inyecta la muestra hasta la salida de la celda del
detector. Así, en columnas de relleno, VM, incluye los espacios entre las partículas del
relleno y los poros de las partículas, más los volúmenes internos de los tubos y sus
conexiones, desde el inyector de muestra hasta la celda del detector, ambos incluidos.

También se llama volumen muerto, y es el volumen de fase móvil que se necesita para eluir (o “desplazar”
desde el punto de inyección hasta el detector) un soluto no retenido por la fase estacionaria. En extracción
líq-líq se ha definido KD = Co / Ca (conc de soluto en la fase orgánica divido por con de soluto en la fase acuosa,
en el equilibrio). En cromatografía de reparto se utiliza el mismo concepto, si bien, sustituyendo la fase
orgánica por la estacionaria y la acuosa por la móvil (como si el soluto fuese “extraído” por la fase
estacionaria): KD = CS / CM.
Por tanto, un soluto no retenido tiene KD = 0.
En columnas de relleno, el volumen muerto es, por lo tanto, el volumen total interno del sistema menos los
volúmenes ocupados por el soporte sólido y por la fase estacionaria (por el recubrimiento del soporte sólido).
En columnas capilares abiertas (sin relleno), el volumen muerto es igualmente el volumen accesible a la fase
móvil, esto es, el volumen interno del sistema desde el punto de inyección hasta el punto de detección,
descontando el volumen ocupado por la fase estacionaria (por el recubrimiento de la pared del capilar). En
todos los casos, la relación entre los volúmenes es: VT = VSS + VS + VM
Parámetros operativos: son los que dependen de las condiciones de trabajo, siendo independientes de la
naturaleza de los solutos. Son:
- Tiempo muerto, tM, o tiempo que se utiliza un soluto no retenido para atravesar el sistema
- Velocidad promedio o velocidad lineal de la fase móvil, 𝑢̅.
- El caudal volumétrico, F
Las relaciones entre estas variables son:
- La velocidad lineal es la distancia que avanza la fase móvil por unidad de tiempo, por lo tanto:
𝑢̅ = 𝐿⁄𝑡
𝑀
- El caudal volumétrico es el cociente entre cualquier volumen de fase móvil, V; y el tiempo utilizado
por dicho volumen en atravesar el sistema, t, y por lo tanto: F = V / t, y también F = VM / tM
- La velocidad lineal, 𝑢̅, es directamente proporcional al caudal, F. La relación entre ambos viene dada
por: 𝑢̅ = F / S, donde S es la sección libre del sistema separador. En una sección transversal de una
columna cromatográfica, la sección libre es la fracción del área que es accesible a la fase móvil.
Parámetros característicos de los solutos: Son la razón de distribución (K D = CS / CM), el tiempo y el volumen de
retención (tR y VR), la velocidad del soluto (v), y el factor de capacidad o retención relativa (k). Se definen como
sigue:
- Constante de distribución, KD: Se define como concentración total de soluto en la fase estacionaria, C s,
dividido por concentración total de soluto en la fase móvil, CM, esto es: KD = CS / CM
- Tiempo de retención de un soluto, tR: tiempo transcurrido desde la inyección (introducción en el
sistema) hasta el momento en que se detecta la máxima concentración de soluto a la salida del
sistema separador (máximo del pico de elución). La velocidad con la que se mueve el soluto es:
v = ΔL /Δt = L /tR
Esta velocidad es una fracción de la velocidad lineal de la fase móvil, 𝑢̅:
𝑚𝑀
𝑣 = 𝑢̅ = 𝑢̅𝑞 (3)
𝑚𝑀 +𝑚𝑆
Esta expresión indica que la velocidad del soluto es proporcional a la fracción másica del mismo que se
encuentra en la fase móvil. SI dicha fracción es cero (todo el soluto está en la fase estacionaria), el soluto no
avanza, y si es la unidad (todo el soluto está en la fase móvil) lo hace a la velocidad de la fase móvil.
- Volumen de retención de un soluto, VR: volumen de fase móvil gastado durante el tiempo de
retención del soluto, o volumen de fase móvil que es necesario utilizar para que eluya el soluto. El
cociente entre el volumen y tiempo de retención de cualquier soluto es el caudal volumétrico:
F =VR/tR.
- Factor de capacidad o retención relativa, k: El factor de capacidad se define en cromatografía de
modo análogo a como se definió en extracción líquido-líquido, como relación entre la masa de soluto
en la fase estacionaria (en lugar de la fase orgánica) dividido por la masa de soluto en la fase móvil (en
lugar de la fase acuosa). Sin embargo, en cromatografía, el factor de capacidad tiene también el
significado de “factor de retención” o “retención relativa”:

(4) (5)

Esta ecuación indica que la retención relativa, k, es el retraso cromatográfico en unidades de tiempo
muerto, esto es, el número de tiempos muertos que se retrasa un soluto retenido por la fase estacionaria
respecto a solutos no retenidos. Para demostrar esta expresión se parte de la ecuación (3):

(6)

Sustituyendo v por L /tR y 𝑢̅ por L /tM y despejando k se tiene la ecuación (5)

La retención relativa es un parámetro cromatográfico muy importante, porque permite relacionar el
tiempo (y el volumen) de retención de un soluto con el parámetro termodinámico K D. Reordenando la
ecuación (5):

(7)
 que indica que el tiempo de retención es igual al tiempo muerto más un tiempo de retraso cromatográfico
que depende de KD y de la relación de volúmenes de las fases. La retención relativa, k, es un parámetro
característico del soluto que depende además de la naturaleza de las fases y de la relación de volúmenes
de las fases. Sin embargo, es independiente de la longitud de la columna y del caudal.

3. LAS DOS TEORÍAS DE LA CROMATOGRAFÍA

En una separación cromatográfica interviene simultáneamente procesos de equilibrio y procesos dinámicos o

de difusión. La separación de los componentes de la muestra es el resultado de ambos tipos de procesos.
De hecho, la separación cromatográfica puede explicarse tanto desde el punto de vista del equilibrio químico,
como desde el punto de vista de las leyes de la difusión. Por esta razón, se desarrollaron dos teorías de la
separación cromatográfica: la teoría del equilibrio y la teoría dinámica o de velocidad.
- La teoría del equilibrio: Pone acento en los aspectos termodinámicos de la separación cromatográfica
y está inspirada en la destilación industrial en columnas de pisos o platos.
- La teoría de velocidad: Enfatiza los aspectos dinámicos de la separación

Las dos teorías aportaron visiones mutuamente complementarias, y llegaron a conclusiones de gran utilidad
para explicar y modelizar el comportamiento cromatográfico de los solutos.
Las dos teorías explicaron los tres fenómenos básicos que tienen lugar durante una separación cromatográfica.
Estos fenómenos son:

a) El ensanchamiento de las zonas ocupadas por los solutos (en términos absolutos)
Cuando más avanza un soluto, o cuanto más tiempo pasa dentro del sistema separador,
más se diluye.
Ejemplo: Un soluto ocupa inicialmente 10 μL y al salir de la columna puede ocupar, un
volumen de 40 μL o más, esto es, un soluto cuando eluye ocupa un volumen bastante
mayor que el que ocupaba inicialmente.

b) El estrechamiento relativo de las zonas ocupadas por los solutos:

Cuanto más avanza un soluto, o cuanto más tiempo pasa, el soluto más se diluye, pero el volumen de fase
móvil utilizado aumenta mucho más rápidamente que el volumen de dilución, por lo que el ensanchamiento
aparente es en realidad un estrechamiento en términos relativos. Un soluto cuando eluye ocupa un volumen
bastante mayor que el que ocupaba inicialmente, pero el volumen de fase móvil que se ha gastado es aún
mucho mayor que el volumen ocupado por el soluto.
Ejemplo: Supóngase un soluto que ocupa inicialmente 10 μL en una columna que contiene VM = 0,5 mL de fase
móvil. El volumen ocupado es de 10/500=2%. Cuando sale de la columna se ha diluido. Supóngase que se ha
multiplicado por 4, ocupando 40 μL en vez de 10. En términos absolutos el soluto se ha diluído 4 veces. Pero
ahora el soluto se encuentra en el volumen de elución VR, que es mayor que VM. Se puede demostrar que
cuando el volumen ocupado por el soluto se cuadriplica, su volumen de retención V R se hace 42=16 veces
mayor.
Resulta: VR=16x0,5=8 mL. El soluto ha pasado de ocupar el 2% del volumen disponible, a ocupar sólo un
40/8000=0,5% del mismo. Por tanto, en términos relativos, se ha concentrado 4 veces: Debido a su mayor
concentración en términos relativos, solutos distintos eluyen por separado, a pesar de que sus
concentraciones absolutas sean más bajas.

c) La migración diferencial de las zonas ocupadas por los solutos

Los solutos migran a diferentes velocidades, unos más rápidos que otros. El ensanchamiento de las zonas
actúa en contra de la separación, pero el estrechamiento relativo y la migración diferencial obran a favor. La
separación se consigue por la acción conjunta de estos dos últimos efectos.
4. TEORÍA DEL EQUILIBRIO. LA MÁQUINA DE CRAIG. CONCEPTO DE HEPT

De acuerdo con la teoría del equilibrio, la separación cromatográfica se produce como resultado de un gran
número de etapas sucesivas de equilibrio entre dos fases, una móvil y otra estacionaria. Cada etapa de
equilibrio se alterna con una etapa de transferencia, en la que se separan las dos fases y se prepara la etapa de
equilibrio siguiente. En las etapas de transferencia, la fase móvil avanza una posición dentro del sistema,
mientras que la estacionaria permanece siempre en el mismo lugar.
La máquina de Craig se diseñó para comprobar experimentalmente la teoría del equilibrio. Simula los aspectos
puramente termodinámicos (de equilibrio) de una separación cromatográfica.
La máquina de Craig está construida con tubos de vidrio unidos entre
sí. Una máquina típica puede tener desde un centenar hasta unos
pocos miles de tubos adosados unos a otros en serie, cada uno de
ellos comunicado con el anterior y con el siguiente a través de los
correspondientes orificios de salida y entrada.
Los tubos están diseñados para establecer contacto por agitación
entre cos fases líquidas inmiscibles, una densa y otra ligera.
Inicialmente, cada tubo se carga con una cierta cantidad de la fase
más densa (VS), la cual no abandona nunca ese tubo. Cuando todos
los tubos están cargados con la fase densa, la máquina está dispuesta
para trabajar. El trabajo se efectúa por ciclos, y cada ciclo consta de dos etapas (equilibrio y transferencia)
separadas por un período de descanso, durante el cual se separan las fases por gravedad.

Antes del primer ciclo, en el primer tubo de la serie se introduce un cierto volumen de la fase más ligera (V M)
junto con los solutos que se van a utilizar en el estudio. Se efectúa la primera etapa de equilibrio (que afecta
sólo al primer tubo). Durante esta etapa el soluto o solutos en estudio difunden de una fase a otra hasta que
se alcanza el equilibrio termodinámico regido por la constante de distribución. A la etapa de equilibrio sigue
siempre un período de descanso en el que, en el interior de los bulbos de extracción (B) de los tubos se
produce la decantación por gravedad de las dos fases inmiscibles.

En la primera etapa de transferencia se transfiere la fase ligera del primer tubo al segundo. En la figura, el
disolvente ligero pasa por el conducto C hasta el bulbo de transferencia D, y de éste por el conducto E se
transfiere a la boca A del tubo siguiente. Se introduce disolvente nuevo (una cantidad de la fase más ligera) en
el primer tubo y se procede realizar un segundo ciclo, y así sucesivamente. En las etapas de transferencia un
giro de la serie de tubos produce la transferencia de la fase más ligera de cada tubo al tubo siguiente de la
serie (por la salida E de cada tubo). La fase más densa siempre permanece en el mismo tubo en el que
inicialmente se produjo.

En la tabla se indica la distribución obtenida en los primeros cuatro tubos de la máquina a lo largo de las
primeras cuatro transferencias para dos solutos con KD=1 y KD=1/3. Se tiene, además, VS=VM. Los datos de la
tabla son las fracciones másicas de soluto en cada fase, dentro de cada tubo y después de cada etapa de
transferencia. De acuerdo con la teoría de la extracción líquido-líquido, las fracciones másicas se calculan como
1/(k+1) y k/(k+1).
 Al cabo de 4 transferencias, la distribución
obtenida es:

Se deduce que el soluto con KD=1/3 avanza más rápidamente que el soluto con KD=1, observándose ya una
incipiente separación entre ambos al cabo de 4 etapas de equilibrio.

- Analogía entre la máquina de Craig y la cromatografía.

Un tubo de la máquina de Craig representa una porción “elemental” de columna cromatográfica, así como una
serie de varios miles de tubos representan la columna completa. Además, la fase ligera que se transfiere de
tubo en tubo hace las veces de fase móvil, mientras que la fase más densa, que siempre permanece en el tubo
donde inicialmente se introdujo, equivale a una fase estacionaria. La fase ligera tiende a arrastrar a los solutos
en su avance a lo lardo de la serie de tubos, mientras que la fase densa tiende a mantenerlos en los primeros
tubos.

- Relación entre el avance de un soluto y KD.

Un soluto con KD=0 (no tiene ninguna afinidad por la fase densa) avanzará con el frente de disolvente,
mientras que un soluto con un valor muy alto de KD tenderá a permanecer para siempre en el primer tubo.
Solutos con valores intermedios de KD avanzarán con mayor o menor rapidez en la serie de tubos, ocupando
preferencialmente un conjunto de ellos. Dicho de otro modo, la velocidad de migración depende de K D en la
forma siguiente:

- KD muy elevado: la concentración del soluto en la fase móvil es próxima a cero, y el soluto tiende a
permanecer en el primer tubo.
- KD elevado: la concentración de estos solutos en la fase móvil será pequeña, por lo que avanzará
lentamente, ocupando preferencialmente zonas de tubos próximas al comienzo de la serie.
- KD bajo: su concentración en la fase móvil es alta y los solutos tienden a avanzar rápidamente en la
serie de tubos.
- KD cero: un soluto con afinidad nula por la fase estacionaria avanza con el “frente” de la fase móvil, y
a la misma velocidad que la fase móvil.
Separación de dos solutos en la máquina de Craig: ensanchamiento y migración diferencial de zonas.

Volviendo al ejemplo anterior de los dos solutos con distinto valor de K D, al comienzo del experimento la zona
ocupada por ambos era sólo el primer tubo. Después de un gran número de ciclos ambos ocupan muchos
tubos. En realidad, aún quedan restos de ambos solutos en el primer tubo, y si se han hecho mil ciclos,
también habrán llegado pequeñas cantidades de los dos solutos al tubo número 1000. Por tanto, los solutos se
han diluido y la zona ocupada por cada uno de ellos se ha ensanchado considerablemente.
Se observa también que la mayoría de los tubos contienen cantidades insignificantes de soluto. Un gráfico de
la concentración de un soluto frente al número del tubo presenta el aspecto de una campana de Gauss, con
una máxima concentración en unos pocos tubos, y concentraciones despreciables en los demás. Para delimitar
la zona ocupada por una cantidad significativa de un soluto, se adopta el siguiente criterio:
Anchura de la zona ocupada= 4σ=96% del área bajo la gaussiana=96% de la
cantidad total de soluto= Anchura de la base del pico.
Este criterio utilizado para delimitar la zona ocupada por un soluto tanto en los
estudios teóricos realizados con la máquina de Craig, como en la práctica real de la
cromatografía y la electrólisis. Estimas el valor de σ sobre una curva gaussiana no
es inmediato, por lo que en la práctica, el valor 4σ o anchura de un pico o banda
cromatográfica (cuando es aprox. Simétrica) se mide como la distancia entre dos
puntos de corte de la interpolación de la línea base con las tangentes en los puntos
de inflexión.

Si se delimita la zona ocupada por cantidades significativas de soluto (se desprecian los tubos con cantidades
insignificantes), cada soluto viene a ocupar una región distinta dentro de la serie de tubos, más o menos
avanzada dependiendo de su KD. Por tanto, como resultado de un elevado número de ciclos se obtiene:
1) Una dilución o ensanchamiento de las zonas ocupadas por los solutos
2) En relación al avance total de la fase ligera, un estrechamiento relativo de las zonas ocupadas por
cantidades significativas de soluto.
3) La migración diferencial de los mismos a lo largo del sistema.

Estrechamiento relativo de zonas

Puede demostrarse que la anchura de las zonas es proporcional a la raíz cuadrada del número de ciclos, n. Para
volúmenes iguales de ambas fases, se tiene la ecuación simplificada siguiente:

Esta ecuación indica que el ensanchamiento de la zona ocupada por un soluto, σ, no es proporcional al número
de tubos ocupado por la fase ligera, n, sino a su raíz cuadrada. Por tanto, cuando aumenta n, 4σ aumenta
proporcionalmente a √𝑛 . En términos absolutos las zonas ocupadas por los solutos se ensanchan al crecer el
número de ciclos, pero en términos relativos se estrechan. Esta conclusión es más fácil de comprender
utilizando un ejemplo numérico. Supóngase un soluto con K D =2 y con una razón de volúmenes de las fases
unidad. Aplicando la expresión anterior resulta:
Por tanto, cuanto más avanza la fase ligera, esto es, cuanto mayor es el número de tubos ocupados por la
misma, en términos relativos, tanto menor es el porcentaje de tubos ocupados por el soluto, esto es, tanto
más estrecha es la zona que ocupa el soluto. Tres consecuencias importantes son:

- La separación se produce a costa de una dilución

- La dilución aumenta con el número de ciclos, o lo que es equivalente, con la distancia migrada.
- El éxito en la separación se debe al estrechamiento relativo de las zonas ocupadas por los solutos.

La teoría del equilibrio permitió explicar las separaciones cromatográficas. Como se explica a continuación,
también permitió establecer una forma de medir la eficacia de un sistema cromatográfico trabajando en unas
condiciones dadas.

Eficacia de un sistema separador

En cromatografía, y también en electroforesis, en destilación a contracorriente, y en otras técnicas de

separación, la eficacia es una medida del ensanchamiento relativo de las zonas ocupadas por los solutos. Un
sistema separador es muy eficaz cuando las zonas ocupadas por los solutos se ensanchan muy poco durante su
avance. La eficacia se mide de dos formas:

a) Como eficacia por unidad de longitud del sistema separador

Mediante la altura equivalente a un plato teórico, H. El sistema es tanto más eficaz cuanto menor es H.

b) Como eficacia total del sistema separador de longitud L

Mediante el número total de platos teóricos con los que está funcionando, N=L/H. EL sistema es tanto más
eficaz cuanto mayor es N. Cuanto mayor es el número de “etapas” que tiene un sistema separador, tanto más
importante es el estrechamiento relativo, esto es, tanto más bajo es el porcentaje de etapas ocupadas. Es lo
mismo que decir que tanto más estrecha es la zona ocupada por el soluto, esto es, tanto más estrecho es el
pico cromatográfico.

Como medida de la eficacia por unidad de longitud también se usa 1/H que es el número de platos teóricos
por unidad de longitud (1/H = N/L).

Concepto de HETP (Height Equivalent to the Theoretical Plate)

Para comprender los significados de H y N es necesario introducir el concepto de altura equivalente a un piso o
plato teórico, HEPT o H. Según la teoría del equilibrio, el ensanchamiento y la migración diferencial de zonas
que se observan en cromatografía se explican como consecuencia de las
etapas de equilibrio y de transferencia. Se considera que el avance de la
fase móvil a lo largo de un trozo de columna de longitud H realiza la
misma función que una etapa de contacto y transferencia de fase entre
dos tubos consecutivos de la máquina de Craig.
Un HEPT es la longitud del segmento de columna (o sistema) equivalente
a una etapa de equilibrio, esto es, la longitud de columna que hace el mismo trabajo separador que haría un
contacto simple entre las dos fases hasta alcanzar el equilibrio termodinámico de reparto de los solutos. Es
como si la columna estuviera dividida en un elevado número de segmentos, N, cada uno de ellos de longitud H.
Cada segmento haría el mismo trabajo separador que un tubo de Craig.
Tener un sistema separador con un valor elevado de N es equivalente a afirmar que la eficacia global de dicho
sistema es elevada, o lo que es igual, el ensanchamiento de los picos de los solutos durante la separación es
muy pequeño.
 Por ejemplo, compárese una columna de HPLC de 10 cm que funciona con N=100 con otra columna de misma
longitud que tiene N=10000 (porque es más eficaz y H es menor). Si un soluto ocupa 20 etapas, el espacio
ocupado por ese soluto en cada columna es el 20% y el 0,20% respectivamente. Por tanto, en la primera
columna el soluto ocupa 20 mm y en la segunda solo 0,2 mm.

¿Por qué se dice “plato teórico?

El concepto de plato de los pisos de contacto líquido-líquido y líquido-gas utilizados en las

columnas de extracción y destilación industriales. En cada plato o bandeja tiene lugar un
contacto entre las dos fases. Luego, una de las fases abandona el plato para pasar al
siguiente. En destiladores y extractores industriales dicho contacto no alcanza nunca el
equilibro. De echo las columnas industriales trabajan con un rendimiento bajo (para ahorrar
tiempo)(entendiendo como grado de avance hacia el equilibrio), como 50 o del 70% en cada
etapa y por ello, un contacto entre las fases que llegue hasta el equilibrio se dice que
equivale a un piso “teórico” (hasta el 100”). En cromatografía y en otras técnicas de
separación en lechos continuos, H se define como la longitud de lecho o segmento capaz de
realizar un contacto “teórico”, esto es, “hasta el equilibrio”.
El concepto de HEPT es importante porque en él se basa la definición de eficacia de un
sistema cromatográfico: un sistema es tanto más eficaz cuanto menor es H, o cuanto mayor
es N.H varía con el diseño y naturaleza del sistema separador (tamaño de partícula del
relleno y con la naturaleza de la fase enlazada), y también varía con las condiciones de
trabajo (pH, composición de la fase móvil, cauda, etc.).
H se mide en unidades de longitud de columna o sistema separador, en metros en las columnas industriales, y
en milímetros y micrómetros para las columnas cromatográficas y electroforéticas. Los sistemas muy eficaces
se reconocen por dar lugar a bandas muy estrechas de los compuestos eluidos.

5. LA TEORÍA DIMÁMICA DE LA CROMATOGRAFÍA. LA ECUACIÓN DE VELOCIDAD

Limitaciones de la teoría del equilibrio

En cromatografía y electroforesis, las separaciones son producidas por procesos de equilibrio, regidos por
leyes termodinámicas (los valores de KD), y también simultáneamente, por procesos dinámicos (o de
velocidad), regidos por las leyes de la difusión de Fick, y que también producen ensanchamiento de las bandas
ocupadas por los solutos. La teoría del equilibrio y la teoría de velocidad son dos aproximaciones a la realidad,
en la que tienen lugar procesos de ambos tipos simultáneamente.
La teoría del equilibrio explica satisfactoriamente la separación cromatográfica. Sin embargo, sólo tienen en
cuenta los aspectos termodinámicos de la misma, olvidando los fenómenos relacionados con la difusión. Las
limitaciones de la teoría resultan evidentes cuando se observa el funcionamiento de la máquina de Craig: El
proceso se produce por etapas discretas y no de forma continua, tanto en el espacio (tubos discretos), como
en el tiempo (ciclos y etapas sucesivas).
Por lo tanto, la máquina de Craig no puede explicar todos los fenómenos que se producen en una separación
cromatográfica, que es un proceso continuo. A causa de su naturaleza discreta, la máquina de Craig tan solo
imita los aspectos termodinámicos de la cromatografía, pero no los aspectos dinámicos, como la difusión
molecular.
Para explicar los aspectos dinámicos de la cromatografía se desarrolló la teoría dinámica o de velocidad.
Ambas teorías, la del equilibrio y la de difusión o de velocidad, explican satisfactoriamente el comportamiento
de los solutos, esto es, el ensanchamiento de las zonas ocupadas, la migración diferencial de dichas zonas y su
estrechamiento en términos relativos.
La ecuación de velocidad

La teoría dinámica o de velocidad explica el ensanchamiento de las zonas ocupadas por los solutos como
consecuencia de tres procesos, cada uno de ellos representados por un término distinto de la ecuación de
velocidad o ecuación de Van Deemter. Según esta ecuación el ensanchamiento de zonas es proporcional a la
raíz cuadrada del TIEMPO pasado por el soluto dentro del sistema.
En cambio, en la teoría del equilibrio el ensanchamiento es proporcional a la raíz cuadrada del AVANCE de los
solutos a lo largo del sistema.
La ecuación de van Deemter describe cómo varia la eficacia con el caudal, o lo que es igual, con la velocidad
lineal de la fase móvil, 𝑢̅. Para GC, la forma simplificada de la ecuación de velocidad es:
𝐵
𝐻 = 𝐴 + + 𝐶𝑢̅
𝑢̅
La forma simplificada para HPLC es:
H=A+B/𝑢̅+ (CM+CS) 𝑢̅
Las ecuaciones completas, no simplificadas, son distintas según el tipo de columna. La ecuación de velocidad
es importante por dos motivos:

1) La medida experimental de H a valores crecientes de 𝑢̅ permite hallar los valores de los coeficientes A,
B y C. Estos coeficientes son característicos de cada sistema cromatográfico (una columna dada
trabajando en determinadas condiciones). Un valor demasiado grande de uno de los coeficientes
indica que se está perdiendo eficacia por defectos de construcción o estructura del sistema
separador, o en su caso, por un diseño inadecuado de la fase móvil.
2) La medida experimental de H a valores crecientes de 𝑢̅ permite hallar el valor óptimo de velocidad de
fase móvil (y, por lo tanto, de caudal), en el cual H es mínimo y por tanto la eficacia es máxima.

Las tres contribuciones a H

En GC, a partir de medidas de H a valores crecientes de 𝑢̅, se obtiene una curva como la mostrada en la figura
adjunta. El valor de H en cada punto es el resultado de la suma de tres contribuciones:

- Un valor constante A (difusión de remolino). Aunque esta contribución se debe esencialmente a

diferencias de velocidad en diferentes puntos de la fase móvil.
- Una función inversa, B/𝑢̅, debida a la difusión molecular longitudinal (a lo largo del eje principal del
sistema separador, esto es, en la dirección del flujo)
- Una función proporcional, C𝑢̅, debida al retraso con que se producen las transferencias de masa (de
soluto) entre las fases móvil y estacionaria, o lo que es igual, a la excesiva lentitud de los tiempos de
reequilibrado después de un avance infinitesimal de fase móvil.
Termino A: Las diferencias de velocidad.

La contribución a H que es independiente de la velocidad de la fase

móvil, A, se explica esencialmente por la diferencia entre las
velocidades de fase móvil en canales de distinta amplitud entre las
partículas de relleno, y también por las diferencias de velocidad
entre el centro y los lados de los canales.
La fase móvil avanza más rápido por canales más anchos, y también es más rápido el flujo por el centro
que por los lados de los canales. De este modo, las moléculas de solutos que pasan por canales anchos, o
por el centro de los canales, se adelantan respecto a otras moléculas.

Por ello, en una columna de relleno, los factores que hacen grande el coeficiente A son las irregularidades
de las partículas del relleno y la disparidad de tamaños entre partículas. El término A disminuye al
aumenta la calidad del relleno: la regularidad de tamaños y formas de las partículas de relleno. El valor de
A es muy pequeño en columnas capilares abiertas (sin relleno), donde las diferencias de velocidades entre
el centro y los lados del único canal son mínimas.

Término B/ 𝑢̅ : la difusión molecular longitudinal.

Esta contribución a H se debe a la difusión molecular, esto es, al flujo de soluto de las zonas de mayor
concentración hacia las zonas de menor concentración en sentido longitudinal, esto es, a lo largo del eje
del sistema separador, tanto en la dirección del avance de la fase móvil como en el sentido opuesto (hacia
atrás).
La difusión molecular da lugar a un ensanchamiento de la zona ocupada
por el soluto en forma directamente proporcional al tiempo de
permanencia del soluto dentro del sistema. Precisamente por ello, esta
contribución es proporcional al inverso de la velocidad lineal de la fase
móvil: a más velocidad, menos tiempo de permanencia, y por tanto
menos ensanchamiento.

Término C: el retraso en la transferencia de masa del soluto

La contribución proporcional a 𝑢̅ se debe a la lentitud de las transferencias de masa de soluto entre una
fase y otra, o lentitud del re-equilibrio después del
avance de la fase móvil. Este fenómeno se puede ilustrar
mediante el esquema de la figura adjunta. La lentitud o
“retraso” con la que se efectúan las transferencias de
masa después de cada “etapa” de avance de la fase
móvil origina un ensanchamiento de la zona ocupada
por el soluto. Si se aumenta la velocidad de la fase
móvil, las velocidades de transferencia de masa no varían, aumentando el “retraso”. Cuanto mayor es la
velocidad de la fase móvil, mayor es el ensanchamiento producido por el retraso.

El valor del coeficiente C (o de CM y CS en LC) disminuye cuando se mejoran los factores de los que
depende la velocidad de transferencia de masa entre ambas fases: cuando se reduce el espesor de la fase
estacionaria, cuando disminuyen los espacios libres accesibles a la fase móvil, cuando se reduce la
profundidad de los poros en el caso de soportes porosos, y cuando se reduce la viscosidad de ambas fases.
 Por ejemplo, en el caso de las columnas capilares abiertas utilizadas en GC, la eficacia es mejor
(H es menor) para las columnas de menor diámetro. Es así porque los solutos tienen que
recorrer distancias menores entre la superficie de la fase estacionaria y el seno de la fase
móvil. Como la distancia es menor, las transferencias de soluto necesarias en todo momento
para restablecer el equilibrio termodinámico son más rápidas.

Análogamente, las columnas de relleno utilizadas en HPLC son tanto más eficaces cuanto más
pequeño es el tamaño de partícula. Con partículas muy pequeñas, los espacios libres entre
partículas son también muy pequeños, y por lo tanto, las distancias a recorrer entre la
superficie de la fase estacionaria y el seno de la fase móvil son también muy cortas. Además,
se las partículas del relleno son pequeñas, sus poros internos son necesariamente menos
profundos por lo que el tiempo necesario para que los solutos entren y salgan de los mismos
es también menor.

Valor óptimo de 𝑢̅

Derivando e igualando a cero se obtiene el mínimo de la ec. De Van Deemter:

𝑢̅ = (𝐵/𝐶)1/2
A este valor del caudal (de la velocidad lineal del flujo) se tiene una eficacia óptima (un H mínimo). En GC
se obtienen mínimos anchos y bien definidos a caudales relativamente altos. Sin embargo, con frecuencia
se trabaja a caudales algo superiores al óptimo para ganar rapidez. En LC se obtienen mínimos agudos a
valores muy bajos del caudal. Por esta razón, si se trabaja en el máximo de eficacia se alargan
excesivamente los tiempos de retención de los solutos. Por ello, para reducir el tiempo de análisis, se
suele trabajar también a caudales bastante superiores al óptimo. Típicamente, en columnas de HPLC
clásicas el óptimo puede corresponder a un caudal inferior a 0,1 mL min -1, pero es frecuente trabajar a
1 mL min-1 si las separaciones son aún satisfactorias. Al multiplicar el caudal por 10, los tiempos de
retención se dividen también por 10. Se sacrifica eficacia para ganar rapidez.

Migración diferencial por tiempo de permanencia en la fase móvil.

Por otra parte, la teoría de velocidad explica la migración diferencial de las zonas ocupadas por los solutos
como sigue:

- Se considera que el soluto avanza sólo cuando se encuentra en la fase móvil, y que no puede avanzar
cuando se halla en el seno de la fase estacionaria.
- Se supone que la velocidad de avance de un soluto es proporcional al tiempo que éste pasa en la fase
móvil; se supone también que el tiempo de permanencia en la fase móvil es proporcional a la fracción
másica de soluto en esa fase, q=1/(k+1).
- Se deduce que la fase móvil arrastra los solutos a distintas velocidades, dependiendo de su valor de q.
esto es: v=q a 𝑢̅, que indica que la velocidad lineal del soluto es la fracción q de la velocidad de la fase
móvil.

Por tanto, la teoría de velocidad también predice que los solutos migrarán a distintas velocidades dependiendo
del valor de KD, ya que q es una función de KD:
6.MEDIDA EXPERIMENTAL DE LA EFICACIA

La teoría dinámica conduce a otra definición de la HETP. La teoría demuestra que H es la varianza por unidad
de tiempo, y también por unidad de longitud migrada:

(14)
Esta expresión indicada que la longitud de columna ocupada por el soluto aumenta en forma directamente
proporcional a la raíz cuadrada de la distancia migrada. La Ec. 14 es la base para el cálculo de la eficacia de un
sistema separador. Teniendo en cuenta que la velocidad del soluto vale v=ΔL/Δt=L/tR y sustituyendo:

En el momento de la elución se tiene:

(16)

Esta ecuación permite calcular H a partir de la anchura de los picos y de su tiempo de retención, datos que son
fácilmente medibles sobre el cromatograma.
Ejemplo: Un pico eluye en 5 min con una desviación estándar de 0,04 min. Hallar H y N y el número de platos
por metro, sabiendo que la columna (HPLC) tiene una longitud de 25 cm.
Respuestas: H = (0,04/5)2 25 = 16 μm; N = 250.000 / 16 = 15.625 platos; 1/H = (1 / 16 μm) x 106 μm/m = 62.500
platos/m

Cálculo de la eficacia global de un sistema.

Reordenando la ecuación 16 se tiene el número de platos teóricos del sistema:

Por ejemplo se tiene: N=(5/0,04)2=15.625 platos. En la práctica no se suele medir la

desviación estándar de los picos, sino la anchura de la base que vale 4 σ.
Introduciendo este factor 4 dentro y fuera del paréntesis, se tiene la expresión
utilizada habitualmente:

(18)
Si se imprime el cromatograma, la eficacia también se puede calcular midiendo los
tiempos como milímetros sobre el papel.

Ejemplo: Calcular N para el pico de la figura adjunta. Solución: N = 16 (27,16/ 0,72)2 = 22767 platos. Es
importante observar que la anchura de la base del pico se ha tomado sobre la interpolación de la línea base
(no sobre el eje, que puede estar desplazado), y que su valor viene dado por la prolongación de las tangentes
en los puntos de inflexión (el corte corresponde al 96% de la cantidad total de soluto). Asimismo, la posición
del pico se toma donde se encuentra el máximo.
7.RESOLUCIÓN Y FACTOR DE SELECTIVIDAD

Resolución.
Es una medida del grado de separación entre dos solutos. Se define como
distancias entre los máximos de los picos de los dos solutos dividida por la
media aritmética de las anchuras. Para el par de solutos X e Y, la resolución
es:

(19)
Para picos de igual altura, un valor de R igual a 1 indica picos parcialmente
solapados, cada uno con una contaminación del 2% del pico adyacente.
Con R=0,8, la contaminación asciende hasta el 4,5% y con R=1,5 se reduce
el 0,1%. Para valores de R superiores a 1,5 dos picos de igual altura tienen
el aspecto de estar bien separados, con un valle entre ellos que alcanza la
línea base.

Factor de selectividad.

La selectividad es la capacidad del sistema separador para distinguir entre solutos de propiedades similares, lo
que depende exclusivamente de las constantes de distribución. La selectividad relativa de un par de solutos, X
e Y, es el cociente entre sus constantes de distribución: α = KD,B / KD,A
El menor valor de KD se escribe en el denominador. Un factor de selectividad igual a 1 indica imposibilidad de
separar el par de solutos. Un factor de selectividad claramente mayor que la unidad indica que los dos solutos
se separan fácilmente con el sistema cromatográfico utilizado. La selectividad se define siempre con respecto a
un par de solutos dados, y es distinta para cualquier otro par de solutos. Así por ejemplo, una columna
trabajando en determinadas condiciones puede tener una excelente selectividad para resolver un pesticida
clorado de alta masa molecular respecto a su metabolito o producto de oxidación, y no ser capas de distinguir
entre dicho pesticida y una impureza con una estructura química similar.
Para medir α sobre un cromatograma, se hace uso de k, que se puede medir directamente, lo que no sucede
con el parámetro termodinámico, KD. Se tiene:

Por tanto, el factor de selectividad de dos solutos se mide como el cociente de sus tiempos de retención netos.

Ejemplo: Medir la resolución y el factor de selectividad para los dos solutos

del cromatograma adjunto, sabiendo que el tiempo muerto (obtenido
inyectando metanol) aparece a los 3,82 min.
Solución: R = 0,85/ [(0,72 + 0,79)/ 2] = 1,13 α = (28,01-3,82) / (27,16-3,82) =
1,04
Mejora de la selectividad

Mejorar la selectividad entre un par de solutos dado implica cambiar las condiciones de trabajo, y con
frecuencia, será necesario también cambiar el sistema separador. Se puede actuar sobre los factores
siguientes:

- Cambiar la naturaleza de la fase móvil: polaridad, pH, etc.

- Cambiar la naturaleza de la fase estacionaria: cambiando de columna, de tipo de relleno, de tipo de
fase ligada, pasando a una columna capilar, etc.
- Cambiar la temperatura de la columna
- Si es necesario, se puede cambiar la naturaleza de los solutos mediante la obtención de derivados;
estos tendrán un comportamiento cromatográfico muy distinto en comparación con los compuestos
sin derivar. Se consigue una mejor importante de la selectividad si uno de los dos solutos que se
quieren separar se derivatiza y el otro no.

Mejora de la resolución

Para mejorar la resolución entre dos compuestos, R, se pude actuar de tres modos:
1) Mejorando la selectividad (aumentando α). Aumentando la separación entre los
picos (pasar de A a B) Para modificar el factor de selectividad es necesario modificar
las constantes de distribución.
2) Mejorando la eficacia, esto es, reduciendo H: aumenta N y disminuye la anchura de
los picos (pasar de A a C, o de B a D)
3) Alargando el sistema separador. Es otra forma de incrementar N, ya que N = L/H
(pasar de A a B, pero con tiempos de elución más largos).

8.RELACIÓN ENTRE RESOLUCIÓN Y RETENCIÓN.EL PROBLEMA GENERAL DE LA ELUCIÓN

Factores de los que depende la resolución

Combinando la ecuación k=(tR-tM)/tM y las ecuaciones 18 y 19 se tiene:

(22)
Donde el último equivale a la fracción másica de soluto en la fase estacionaria, que es otra forma de expresar
la retención:

Análogamente, la fracción másica de soluto en la fase móvil es:

La ecuación 22 muestra cómo la resolución se consigue mediante la combinación de tres factores: eficacia
global del sistema, selectividad (diferencia respecto a la unidad) y retención. También muestra cómo aumenta
R a medida que se modifican estos factores:
- Si se alarga el sistema separador aumenta N, y por lo tanto aumenta R. Sin embargo, el aumento no
es directamente proporcional, por ejemplo para duplicar R es necesario cuadruplicar N.
- Si α=1 la resolución vale 0. A medida que α se aleja de 1, la resolución también aumenta.
- Si la retención relativa, k, es cero, la resolución también es cero. Si aumenta k, R aumenta, al principio
muy rápidamente. Cuando k ya es mucho mayor que 1, una mayor retención produce un aumento
insignificante de R. Además, valores altos de k suponen tiempos de elución muy largos.
El problema general de la elución

La relación entre R y K conduce al denominado “problema general de la elución”, cuyo enunciado es el

siguiente:

Valores de k menores que 0,2 indican poca retención, o lo que es equivalente, preferencia excesiva del soluto
por la fase móvil. Con valores muy bajos de k el pico del soluto aparece en cabeza del cromatograma, a valores
cercanos al tiempo muerto. EN la cabeza del cromatograma es donde aparecen precisamente los picos de
todos aquellos compuestos que no experimentan retención, o cuya retención es muy baja, por lo que la
separación es muy deficiente.
Valores de k mayores que 20 indican una retención demasiada alta, producida por una preferencia excesiva del
soluto por la fase estacionaria. Además del excesivo tiempo de análisis, otro inconveniente asociado a los
tiempos de retención excesivos es la dilución de los solutos (el soluto ha tenido mucho tiempo par difundir
dentro del sistema). Los picos con valores muy grandes de k son muy anchos y de baja altura, lo que supone
una baja relación señal/ruido, o lo que es igual, los límites de detección son muy altos.
Para aumentar o disminuir k se puede actuar sobre el cociente V S/VM (por ejemplo, utilizando otra columna
con un volumen mayor o menor de fase estacionaria), y sobre los factores de los que depende KD: condiciones
de trabajo (temperatura, pH, etc) y naturaleza de la fase móvil.

Elución isocrática y con gradiente

Cuando se quieren separar solutos con propiedades muy distintas, no es posible conseguir que todos eluyan
dentro de la zona óptima de valores de k. En este caso, se procede a cambiar las condiciones de trabajo (y por
lo tanto, variar las KD) durante la elución.
De este modo, se consigue que la elución de cada soluto se realice dentro de la zona óptima de valores de k.
Modificar KD durante la separación se conoce como elución con gradiente, lo que se contrapone a elución
isocrática (sin cambios de condiciones de trabajo durante la elución).
Así, en GC lo habitual es utilizar un gradiente térmico, que consiste en aumentar progresivamente la
temperatura de la columna. De este modo se acelera la elución de los solutos menos volátiles, o de los
excesivamente afines a la fase estacionaria. En RP-HPLC es habitual aumentar la hidrofobicidad (aumentar el
porcentaje de disolvente orgánico en la composición de la fase móvil). Análogamente, en NP-HPLC es habitual
aumentar la polaridad (aumentar el porcentaje de isopropanol en mezclas isopropanol-heptano).
La elución con gradientes permite separar en un mismo cromatograma compuestos débilmente retenidos por
la fase estacionaria (con tendencia a eluir con valores muy bajos de k) y otros fuertemente retenidos (con
tendencia a eluir con valores muy altos de k).
Por ejemplo, en RP-HPLC, a medida que aumenta la hidrofobicidad del eluyente, solutos que experimentan
inicialmente una retención excesiva van siendo progresivamente más y más afines a la fase móvil (su K D
disminuye).
9.CARACTERÍSTICAS GENERALES DE LOS DETECTORES UTILIZADOS EN CROMATOGRAFÍA

Requisitos básicos de un detector para cromatografía

En GC, HPLC, electroforesis y otras técnicas, no existe un detector universal que pueda recomendarse para
todo tipo de aplicaciones. En la actualidad se siguen utilizando varios detectores para cada técnica de
separación, cada uno de los cuales tiene su campo de aplicación preferente. Con independencia de los
principios físicos-químicos en que se basa, un detector ideal debe poseer en alto grado las siguientes
características:

- Poca deriva de la señal (línea base plana) y bajo ruido (oscilaciones pequeñas de la línea base)
- Alta sensibilidad (variaciones grandes de la señal con cambio pequeños de la conc. del soluto)
- Respuesta rápida
- Amplio rango dinámico lineal ( 3 o más órdenes de magnitud o décadas)
- Bajo volumen muerto (la contribución del detector al volumen muerto debe ser muy pequeña)
- Baja sensibilidad frente a los cambios de temperatura o composición de la fase móvil. Si el detector es
sensible a estos cambios, la deriva de la línea base hace imposible la elución con gradiente.
- Fácil manejo, robustez y fiabilidad.
- Preferentemente no destructivo para permitir la conexión en serie con otro detector, o su aplicación
en cromatografía a escala preparativa.

Deriva y ruido

En la mayoría de las técnicas analíticas la señal se representa frente a una variable de barrido (como tiempo,
longitud de onda, relación masa/carga, etc.), y los componentes se detectan como desviaciones significativas
de la línea base en forma de pico o banda, que destacan sobre la línea base.
En cromatografía la variable de barrido es el tiempo de elución. La figura muestra un pico destacando sobre el
ruido de fondo o ruido de la línea base. Esta figura muestra un caso complicado, donde el ruido de fondo tiene
varios componentes:

- ruido de alta frecuencia (oscilaciones muy rápidas debidas al movimiento al azar de los electrones en
los circuitos electrónicos, siempre presentes)
- ruido de baja frecuencia o fluctuaciones (debidas a inestabilidad en el detector, cambios en la
temperatura, oscilaciones del suministro eléctrico, etc)
- deriva (línea base inclinada)

Para distinguir picos hasta concentraciones muy bajas, es importante que la línea base esté libre de deriva y
fluctuaciones, y que el ruido aleatorio de alta frecuencia sea de muy pequeña amplitud.
Medida del ruido de fondo con el criterio 5s.
Tanto en el caso más simple (cuando predomina el ruido de alta frecuencia), como en el caso más complejo
(cuando las fluctuaciones y la deriva son también importantes), una forma muy práctica de medir el ruido de
fondo es aplicar el criterio 5s. Se supone que las oscilaciones son aleatorias, por lo que siguen la distribución
de Gauss. El 99% del área bajo la curva de Gauss está comprendida entre -2,5s y +2,5s. Por lo tanto, si se tiene
la precaución de dejar fuera de la media un 1% del área abarcada por las oscilaciones del fondo (las “puntas”
de algunas oscilaciones), se tiene un valor de la anchura de la banda de fondo cuyo valor es aproximadamente
5s. Esta medida de s es suficientemente precisa para medir límites de detección, y para comparar unos
métodos con otros. Para tener un valor fiable se recomienda medir el ancho de banda del ruido a lo largo de
una 10 veces la anchura del pico en su base, y a cada lado del pico. Puesto que el ancho de la banda se toma
donde no está el pico del analito, en realidad se está midiendo la desviación estándar del blanco, s bl.
Ejemplo 1. Si en la figura anterior la banda del fondo tiene una anchura de 12 mV, resulta: s bl = 12/5 = ±2,4 mV

Límite de detección (LOD)

Es la capacidad de un método, de una técnica o de un
detector para detectar concentraciones o cantidades muy
pequeñas de analito. Un pico se considera detectado si
sobresale nsbl sobre la media de las desviaciones del fondo.
EL valor de la constante k varía según la norma que se
aplique. Un valor usual es n=3. Según este criterio, el LOD es
la concentración del analito que genera una señal que destaca 3s bl sobre la media de la línea base. Si b es la
pendiente de la curva de calibrado, el LOD se calcula como:

Ejemplo 1 (continuación). Si el pico del analito tiene 15 mV (desde la media del blanco hasta el máximo), y
corresponde a un estándar de 0,1 mg/L, se tiene: sbl = ±2,4 mV, b = 15 mV / (0,1 mg/mL) = 150 mV/(mg/mL), y
LOD = 3 x 2,4 / 150 = 0,05 mg/mL.

Sensibilidad
Es una medida de la capacidad del detector para distinguir pequeñas diferencias de concentración del analito.
Matemáticamente, es la pendiente de la curva de calibrado, b.

Selectividad
Un detector es selectivo cuando es sensible a un soluto dado, o a un pequeño grupo de solutos, y su
sensibilidad es baja o nula frente a otros solutos. Selectividad se opone a universalidad. Un detector es
universal cuando presenta una sensibilidad similar frente a todo tipo de solutos.

Rango dinámico lineal, LDR

Es el intervalo de concentraciones para el que la relación seña-
concentración es lineal. Se inicia en el LOD y termina cuando la respuesta
del detector se aparta de la linealidad en más de un 3%. Se mide en órdenes
de magnitud o décadas, como log (respuesta lineal máxima /LOD).
Ejemplo 2. ¿Cuánto vale el LDR para el ejemplo de la figura adjunta?
Datos: linealidad se pierde para y = 1,8 V, y el LOD se tiene donde y = 0,3
mV. Solución: LDR = log (1,8/0,0003) = 3,8 décadas.
La cuantificación de los analitos se facilita mucho si el detector tiene un
rango dinámico lineal de varios órdenes de magnitud: se evitan las
diluciones y preconcentraciones, y los errores asociados a la manipulación
adicional de las muestras durante las operaciones de dilución o preconcentración.
Análisis cuantitativo en cromatografía

Para determinar un soluto i, el área del pico correspondiente se relaciona con la concentración en la muestra:
Ai -bi Ci
donde bi es la pendiente de la curva de calibrado.
Como en cualquier otra técnica basada en la calibración, para hallar b i se cromatografía el patrón en
concentraciones crecientes y se miden las áreas, ya que las áreas de los picos de los solutos son proporcionales
a sus concentraciones. En cambio, las alturas de los picos sólo son proporcionales a la concentración si la
forma del pico se mantiene invariable al aumentar la concentración, lo que no siempre es así. En general, el
programario del instrumento contendrá herramientas para establecer la línea base e integrar el área de los
picos (unidades de voltaje x tiempo).