Cromatografía

Universidad Tecnológica
metropolitana
Ingeniería en Química
 Contenidos

Conceptos, clasificación, métodos

Cromatogramas y tiempos de retención

HPLC y ejercicios
 Introducción

• La Cromatografía es un proceso utilizado para separar los componentes de una mezcla. Para comenzar el
proceso, la mezcla se disuelve en una sustancia llamada la fase móvil, la cual lleva la mezcla a través de
una segunda sustancia llamada la fase estacionaria.
• Los distintos componentes de la mezcla viajan a través de la fase estacionaria a diferentes velocidades,
causando que se separen unos de otros. La naturaleza específica de las fases móvil y estacionaria
determina qué sustancias viajan más rápido o lento, y así es como se separan. Estos distintos tiempos
de viaje se llaman tiempo de retención.
 Aplicación
• La cromatografía es una técnica cuyo campo de
aplicación se extiende a todas las áreas de la Química y
de la Bioquímica. Asimismo, es importante en Biología,
Control de Calidad, Investigación, Análisis,
separaciones a escala preparativa y medidas
fisicoquímicas. Asimismo, puede aplicarse con el
mismo éxito tanto a escala micro como macro, siendo
posible su utilización industrial para la separación de
los componentes en los más diversos materiales:
azúcares, tierras raras, productos farmacéuticos, etc.
 Definición
• "Un método utilizado inicialmente para la separación
de los componentes de una muestra en la cual los
componentes se distribuyen en dos fases, una de las
cuales es estacionaria, mientras que la otra se mueve.
La fase estacionara puede ser un sólido, un líquido
sobre un soporte sólido, o un gel. La fase estacionaria
puede estar contenida en una columna, extendida en
forma de capa o dispuesta en forma de película …. La
fase móvil puede ser gaseosa o líquida".
 Significado
• Fue desarrollada originalmente por el botánico ruso M. S.
Tswett como técnica para la separación de pigmentos
vegetales coloreados, El término "cromatografía"
posiblemente derive de las palabras griegas "chroma"
(color) y "graphein" (escribir), aludiendo a que los
pigmentos vegetales separados se ponen claramente de
manifiesto como bandas coloreadas. Sin embargo, el
mismo Tswett indica Sin embargo, el mismo Tswett indica
que también pueden separarse sustancias incoloras por
el mismo procedimiento.
Separación en una
columna
 Ejemplo
• Cuando se utiliza una columna rellena de CaCO₃
en la que se introduce un extracto de hojas
verdes en éter de petróleo, y seguidamente se
añade disolvente puro (eluyente) es posible la
separación de clorofila, carotenos y xantofilas.
 Ejemplo
En estas separaciones, la fase estacionaria es el
relleno (CaCO₃), la fase móvil es el éter de petróleo y
los componentes a separar, los distintos pigmentos
vegetales, los cuales se encuentran sometidos a dos
fuerzas contrarias: el disolvente tiende a arrastrarlos
hacia la salida y el CaCO₃ a retenerlos. Como este
último efecto es diferente para los distintos
pigmentos, éstos se mueven a diferente velocidad y
emergen de la columna a distintos tiempos
Esquema
 Cromatograma
• Cuando se mide la concentración de cada
componente a la salida de la columna y se
representa en función del volumen de fase
móvil, o del tiempo transcurrido desde la
introducción de la muestra, se obtiene una
gráfica denominada "cromatograma"*.
Cromatograma
 CLASIFICACION DE LOS METODOS
CROMATOGRAFICOS
• Los métodos cromatográficos pueden clasificarse
atendiendo a distintos factores: estado físico de
las fases móvil y estacionaria (gas-líquido, líquido-
líquido, etc), soporte utilizado (columna, papel,
etc), mecanismo de la separación (adsorción,
reparto), e incluso el tipo de soluto
(cromatografía iónica, cromatografía de
proteínas, etc). En el cuadro se muestra una
clasificación en función de algunos parámetros
mencionados anteriormente.
CLASIFICACION DE LOS METODOS
CROMATOGRAFICOS
 Clasificación
• Según la naturaleza de la fase móvil, los
métodos cromatográficos se clasifican en dos
grupos: cromatografía líquida y cromatografía
de gases, según que la fase móvil sea un
líquido o un gas respectivamente.
Clasificación cromatografía líquida
• En cromatografía líquida, cuando la fase
estacionaria es polar y la fase móvil no-polar, se
denominan sistemas normales, o de fase normal.
En estos sistemas, la retención del soluto se
incrementa generalmente con su polaridad. Por
otra parte, si la fase estacionaria es menos polar
que la fase móvil, el sistema se designa como de
fase inversa, y en éstos, las especies polares
tienen poca afinidad por la fase estacionaria,
siendo eluidos más fácilmente.
 Soporte
• En cuanto al soporte, o la técnica utilizada para
desarrollar el cromatograma, pueden distinguirse dos
categorías: plana y en columna. En cromatografía plana,
la fase estacionaria puede estar constituida por una hoja
de papel (cromatografía en papel) o por una capa de un
sólido distribuido uniformemente sobre una lámina de
vidrio, plástico o aluminio (cromatografía de capa fina).
Por otra parte, la fase estacionaria puede estar contenida
en una columna, en cuyo caso la técnica se denomina
cromatografía en columna. Cuando la fase estacionaria
es un líquido, éste debe inmovilizarse sobre un soporte
sólido inerte, o sobre la propia columna.
 Diferencias
• La cromatografía plana está limitada al uso de fase
móvil líquida, debido a las dificultades inherentes
para confinar un gas o un fluido supercrítico en una
superficie plana. Sin embargo, la cromatografía en
columna puede utilizarse en las modalidades de
líquidos, gases y fluidos supercríticos.
• En el caso de la cromatografía líquida en columna
existen dos modalidades, que pueden denominarse
en función de su desarrollo cronológico como
cromatografía clásica en columna y cromatografía
de alta resolución (CLAR o HPLC)*
 Columnas Cromatográficas
• Las columnas convencionales
usadas en cromatografía líquida
y de gases tienen diámetros
relativamente grandes: 2-4 mm
en CG y 4-6 mm en HPLC. Estas
columnas contienen la fase
estacionaria empacada,
consistente en un sólido o un
líquido volátil recubriendo a un
soporte sólido inerte.
 Columnas Cromatográficas
• Desde 1957 se han venido desarrollando distintos tipos
de columnas capilares (también denominadas
columnas tubulares abiertas) utilizadas inicialmente
en CG y extendiéndose posteriormente a CL. Estas
columnas son mucho más estrechas y mucho más
largas que las columnas empacadas. En ellas, la fase
estacionaria sólida está constituida por una capa
porosa (figura a) y la fase estacionaria líquida puede
estar recubriendo directamente la pared interna de la
columna (figura b.), o sobre un soporte sólido (figura
c.).
 Tipos de columnas abiertas

• Columnas tubulares abiertas. a) de capa porosa. b) con

pared recubierta. c) con soporte recubierto.
Tipos de
columnas
 Ventajas de las columnas abiertas
• Las columnas tubulares abiertas proporcionan
mayor resolución, requieren menor tiempo para
el análisis y presentan mayor sensibilidad que las
columnas empacadas, si bien, se maneja una
cantidad de muestra considerablemente menor y
no son útiles para separaciones preparativas en
las que se trate de aislar cantidades
relativamente grandes de compuesto.
 Mecanismo de las separaciones
cromatográficas
• La naturaleza de las interacciones entre los
distintos componentes de la muestra y las dos
fases, móvil y estacionaria, permite clasificar los
sistemas cromatográficos desde este punto de
vista, si bien, puede considerarse que la fase
estacionaria es la que gobierna el modo de
separación. Las fuerzas implicadas en estas
interacciones suelen ser débiles, tales como
fuerzas de Van der Waals o enlaces de hidrógeno.
 Cromatografía de Adsorción
• se tiene cuando la fase estacionaria es un sólido
adsorbente de gran área superficial (gel de sílice,
alúmina, etc.). Los centros activos situados sobre
la superficie del sólido (por ejemplo, los grupos
silanol de la gel de sílice) interaccionan con los
grupos funcionales polares de los compuestos a
separar. La separación se produce como
consecuencia de la distinta intensidad de las
mencionadas interacciones para unos y otros
compuestos.
 Cromatografía de adsorción
• Una característica importante del adsorbente es
el tamaño de partícula. En principio, la retención
es proporcional al área superficial, la cual, a su
vez, depende del tamaño de partícula y de la
estructura interna de las partículas de
adsorbente. Cuanto menor sea el tamaño de
partícula, mayor será el área superficial del
adsorbente y, en consecuencia, mayor el número
de centros activos disponibles para la adsorción.
Esquema
 Cromatografía de reparto
• Tiene lugar cuando se utiliza un líquido como fase
estacionaria. Para inmovilizar este líquido se utiliza un
soporte sólido (gel de sílice, celulosa, tierra de diatomeas,
poli-estireno, etc.) de gran área superficial.
• En cromatografía líquido-líquido, para evitar que se
mezclen las fases se utiliza como fases móvil y
estacionaria dos líquidos de polaridades muy diferentes.
Si el líquido estacionario es polar (por ejemplo, etilen-
glicol), la fase móvil será no polar (por ejemplo, hexano).
En este caso, los solutos polares son retenidos más
fuertemente que los no polares.
 Cromatografía de reparto
• La forma citada es la de operación normal, si bien
también puede operarse con una fase
estacionaria no polar (por ejemplo, decano) y con
una fase móvil polar (por ejemplo, agua). Esta
forma de proceder se denomina de fase inversa.
En cualquier caso, la separación se produce
porque las moléculas de soluto se distribuyen
entre las dos fases según su solubilidad relativa
en cada una de ellas
Esquema
 Cromatografía de intercambio iónico
• La fase estacionaria es una matriz rígida, en
cuya superficie existen grupos funcionales
cargados positiva o negativamente (A) y
contra-iones de carga opuesta (M),
susceptibles de intercambiarse con iones de la
misma carga contenidos en la fase móvil
 Cromatografía de intercambio iónico
• La fase móvil suele ser una solución acuosa
tamponada y la separación se produce por la
competencia que se establece entre los iones de
la fase móvil y los iones del analito por los
centros activos de la resina. Este tipo de
cromatografía se utiliza ampliamente en química
inorgánica para la separación de iones metálicos,
así como en sistemas biológicos para la
separación de compuestos iónicos solubles en
agua.
Esquema
 Cromatografía de exclusión
• También se denomina cromatografía de filtración
en gel o cromatografía de permeación en gel. En
ella, la fase estacionaria consiste en un sólido
inerte que contiene pequeños poros en los que
pueden penetrar las moléculas de tamaño
reducido, pero no las grandes El grado de
retención depende del tamaño de las moléculas
(solvatadas) y del tamaño de los poros.
 Cromatografía de exclusión
• Las moléculas pequeñas pueden penetrar en los poros
pequeños, mientras que las de tamaño intermedio
pueden penetrar solo en algunos poros, siendo
excluidas de los otros, y las moléculas grandes son
excluidas completamente, Estas últimas se desplazan
con la fase estacionaria y son eluidas en primer lugar.
Este tipo de cromatografía resulta especialmente
adecuada para la separación de especies orgánicas de
peso molecular elevado de otras moléculas pequeñas*.
Esquema
 Cromatografía por afinidad
• La cromatografía por afinidad es un tipo de
cromatografía de líquidos que se basa en la unión
reversible entre el analito de interés y un ligando
específico, inmovilizado en un soporte sólido inerte.
Cuando la muestra pasa por la columna, sólo son
retenidas las moléculas que se unen de manera selectiva
al ligando por afinidad y las que no se unen avanzan con
la fase móvil. Después, los analitos retenidos pueden ser
arrastrados cambiando las condiciones de la fase móvil.
 Cromatografía por afinidad
Las matrices o soportes empleados en cromatografía de afinidad
como fase estacionaria deben ser rígidos, resistentes, insolubles,
permeables y reactivos. Suelen ser de dos tipos:
• Matrices de polisacáridos (agarosa, celulosa, dextrano)
• Matrices sintéticas (vidrio, poliacrilamida)
• Los ligandos por afinidad característicos son anticuerpos,
inhibidores de enzimas, o compuestos más generales, como las
lectinas (que se enlazan a polisacáridos). Se fijan
mediante enlaces covalentes a la fase estacionaria
químicamente activada.
 Cromatografía por afinidad
• La fase móvil desempeña dos funciones distintas:
• Debe soportar el fuerte enlace entre las
moléculas del analito y el ligando
• Debe ser capaz de debilitar o eliminar la unión
entre el analito y el ligando, una vez se han
eliminado las especies indeseables, de modo que
el analito pueda ser eluido.
 Cromatografía por afinidad
• Según la naturaleza de los ligandos y los analitos
distinguimos dos procedimientos generales de elución:
• Elución bioespecífica: la fase móvil contiene un inhibidor por
el que el analito tiene preferencia (compite con el ligando). El
analito se retira entonces del ligando y es eluido.
• Elución no específica: la fase móvil provoca un cambio en el
sitio activo del ligando, mediante variaciones del pH, de la
constante dieléctrica o de la fuerza iónica del medio. También
se puede desnaturalizar el ligando mediante reacciones
químicas con urea o tiocianato potásico.
Esquema
Esquema
Resumen
 FUNDAMENTOS TEORICOS
• Los componentes a separar, en su desplazamiento
a lo largo del sistema cromatográfico se mueven a
diferentes velocidades, dependiendo de la
afinidad de cada uno por la fase estacionaria,
respecto a la fase móvil. Cada uno de ellos se
distribuye entre las dos fases según un equilibrio
caracterizado por una constante denominada
constante de distribución o coeficiente de
distribución.
 constante de distribución o
coeficiente de distribución
• Para el componente A

Donde [AS] es la concentración de A en la fase

estacionaria, y [AM] la concentración de A en la
fase móvil. Este modelo es análogo al utilizado
en sistemas de extracción simple.
 constante de distribución o
coeficiente de distribución
• En cualquier caso, cuanto mayor sea el valor de K,
mayor será la afinidad del componente en cuestión
para la fase estacionaria y menor será la velocidad a la
que se mueve a través del sistema.
• Para una muestra que contenga los componentes A, B
y C, y que se introduzca como una banda estrecha
sobre una fase estacionaria, si KA > KB > KC el
componente A se desplazará a lo largo del sistema más
lentamente que el B, y éste más despacio que el C.
 Efecto en el cromatograma
• la señal obtenida es proporcional a la cantidad
de soluto presente en el eluyente, con lo que
se obtienen picos más o menos Gaussianos.
RETENCION Y DISTRIBUCION
La muestra que
contiene un solo
analito (A). El pico
pequeño (B),
corresponde a una
especie no retenida
por la columna y que a
menudo está
contenida en la
muestra, pero que
puede añadirse para
facilitar la
identificación de los
picos*.
 Características del cromatograma
• tM: tiempo muerto (tiempo requerido para que una
especie no retenida alcance el detector)
• VM: volumen muerto (volumen de fase móvil que se
requiere para eluir una especie no retenida)
• tR: tiempo de retención (tiempo transcurrido desde la
introducción de la muestra hasta que el componente
alcanza el detector)
• VR: volumen de retención (volumen de fase móvil que se
requiere para eluir un soluto de la columna cromatográfica)
• h: altura de pico; w: anchura de pico; w 1/2: anchura de
pico a la semialtura
• W 0,1: anchura de pico a un décimo de la altura.
 Factores de retención
• Interacciones electrostáticas entre especies de
carga opuesta, como las que tienen lugar en
separaciones por cromatografía iónica.
• Interacciones por fuerzas de van der Waals del
tipo dipolo-dipolo (orientación) o del tipo dipolo-
dipolo inducido (inducción)
• Interacciones por fuerzas de dispersión entre
moléculas neutras o grupos funcionales.
• Formación de enlaces de hidrógeno.
 Tiempos de retención
• El tiempo de retención puede considerarse que
está constituido por dos componentes. Uno de
ellos es el ya mencionado tiempo muerto, que es
el mismo para todos los analitos en un sistema
cromatográfico determinado, y el otro es el
denominado tiempo de retención ajustado, t'R,
que es el tiempo que realmente se invierte en la
retención de un soluto por la fase estacionaria, y
que se define como
 Factor de capacidad K´
• Las características de retención de los componentes
suelen describirse en la práctica por el factor de
retención o factor de capacidad, k', definido como,

• y relacionado con el coeficiente de distribución y los

volúmenes de fase móvil y fase estacionaria por:
𝑚𝑆
𝐴𝑆 𝑉𝑆 𝑚𝑆 𝑉𝑀 ´ 𝑉𝑀
𝐾= = 𝑚𝑀 = × =𝐾 ×
𝐴𝑀 𝑚𝑀 𝑉𝑆 𝑉𝑆
𝑉𝑀
 Factor de capacidad K´
• Donde VM y VS son los volúmenes de fase
móvil y estacionaria respectivamente. La
relación VM/VS se denomina relación de fases,
β, y es uno de los parámetros que se utilizan
para caracterizar una columna cromatográfica,
particularmente en cromatografía de gases.
 Medida de K´
• La medida directa de mS y mM suele ser difícil,
por lo que la determinación del factor de
retención generalmente se lleva a cabo a
partir de los tiempos de retención,
parámetros fácilmente medibles en el
cromatograma. Para ello, el factor de
retención puede considerarse que es,
 Alternativa de calculo
• Otra forma de expresarlo

• El factor de capacidad es un parámetro importante porque es

independiente de la velocidad de flujo de la fase móvil y de
las dimensiones de la columna, y puede usarse para
comparar retenciones en instrumentos diferentes.
• Los factores de retención grandes favorecen una buena
separación, pero también incrementan el tiempo de elución
y el ancho de banda. Idealmente, las separaciones se realizan
en unas condiciones en las que los factores de capacidad
para las especies de una mezcla oscilan entre 1 y 5.
 Volumen de retención
• es un parámetro de utilidad en muchas ocasiones. De
la expresión anterior se deduce que:
• 𝑉𝑅 = 𝑉𝑀 × 1 + 𝐾 ´
𝑉𝑀
• 𝑟𝑒𝑒𝑚𝑝𝑙𝑎𝑧𝑜 𝑑𝑒 𝑒𝑐𝑢𝑎𝑐𝑖ó𝑛 𝐾 = 𝐾´ ×
𝑉𝑆
 Modificación cromatografía de
adsorción
• que es una ecuación importante en cromatografía, si
bien, en cromatografía de adsorción debe modificarse de
la forma siguiente:
• 𝑉𝑅 = 𝑉𝑀 + 𝐾𝐴 × 𝐴𝑆
• donde KA es el coeficiente de adsorción y As el área
superficial del adsorbente.
• La capacidad de una determinada fase estacionaria para
separar dos componentes A y B se expresa mediante el
factor de separación o factor de selectividad, α, definido
por:
 Alternativa de factor de selectividad
• y, por otra parte, puede determinarse
fácilmente de forma directa midiendo los
tiempos de retención de las especies A y B
sobre un cromatograma experimental, ya que,
 Cromatografía HPLC
• En cromatografia HPLC (High performance liquid
chromatography) normalmente se utilizan
métodos instrumentales como detectores a la
salida de la columna en los que se monitoriza
continuamente la composición de la fase móvil, la
señal obtenida es proporcional a la cantidad de
soluto presente en el eluyente, con lo que se
obtienen picos más o menos Gaussianos.
Esquema
 Instrumentación
• Sistema de suministro y almacenamiento de
fase móvil
• Sistema de bombeo
• Sistema de inyección de muestra
• Columna cromatográfica
• Detector
 Instrumentación
• Los detectores en cromatografia de líquidos son de dos
tipos básicos. Los detectores basados en una propiedad
de la disolución responden a una propiedad de la fase
móvil, tal como el índice de refracción, la constante
dieléctrica, o la densidad, que se modifica por la
presencia de los analitos. Por contraste, los detectores
basados en una propiedad del soluto responden a
alguna de las propiedades del soluto, como la
absorbancia UV, fluorescencia, o intensidad de
difusión, que no son propias de la fase móvil.
Tabla de detectores usados en HPLC
 Ejemplo
• Se desea determinar la concentración de cafeína de un café
de marca tradicional, se masaron 0,500 g de café y se
disolvieron en agua hasta formar 200 mL de disolución, una
alicuota de 20,0 mL se disuelve hasta formar 500 mL de
disolución y luego se toman 50 mL y se disuelven hasta formar
200 mL de disolución, una alicuota de esta disolución se mide
generando un area 90 A.U. La calibración se realiza usando
una disolución patrón de 50,0 [mg/L] y se toman las
siguientes alicuotas que se aforan en matraces de 100 mL
como exhibe la tabla, determine la concentración de cafeína
en [mg/L]
N° V (mL) C ppm A (A.U.)
1 2,5 30
2 5 60
3 10 125
4 20 250
5 40 500
 Ejemplo 2
• De desea determinar la concentración de cafeina que
existe en una determinada planta para ello se
digestionan 350 gramos de planta y se obtienen 250
mL de disolución, luego se toman 200 mL y se aforan
hasta formar 1500 mL de disolución finalmente 100 mL
se aforan en 1000 mL de disolución, de acá se toman
alícuotas de 20,0 mL de disolución y se depositan en
distintos matraces de 100 mL y se adicionan volumenes
crecientes de un patrón de cafeína de 50,0 [mg/L]
como exhibe la tabla determine el % de cafeína en la
planta
 Ejemplo 2
N° V (mL) C ppm A (A.U.)
1 0 300
1 2 420
2 4 550
3 6 670
4 8 790
5 10 910