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CROMATOGRAFIA CLASICA

Objetivo:
• Conocer el fundamento de la cromatografía y diferenciar los tipos de cromatografía en función de la estructura mecánica de los recorridos de separación, la naturaleza y el estado físico de las fases y el fenómeno responsable de la distribución entre las mismas.

Definición
• Puede definirse como una técnica que separa una mezcla de solutos basada en la velocidad de desplazamiento diferencial de los mismos que se establece al ser arrastrados por una fase móvil (líquida o gaseosa) a través de un lecho cromatográfico que contiene la fase estacionaria, la cual puede ser líquida o sólida.

TIPOS DE CROMATOGRAFIA
Naturaleza de fase estacionaria Naturaleza de fase estacionaria Sólido Adsorción Exclusión Cambio iónico Afinidad Líquido Naturaleza de fase móvil Liquido Partición Líquido-líquido ((partición) Líquidosólido)adsorción, cambio iónico, exclusión,Afinida d. Gas Gas-líquido (CGL) Gas-sólido (CGS)

CLASIFICACION DE LOS MÉTODOS CROMATOGRAFICOS
• SON DE DOS TIPOS: – CROMATOGRAFIA EN COLUMNA
• La fase estacionaria se mantiene dentro de un tubo angosto • La fase móvil es forzada a pasar a través del tubo bajo presión o gravedad

– CROMATOGRAFIA PLANAR
• La fase estacionaria está sostenida por una placa plana o papel • La fase móvil se mueve por acción capilar o gravedad

se distinguen dos técnicas: Columna Se usa un tubo cilíndrico Capa fina Papel (partición) Plana: El soporte es una placa plana o los intersticios de un papel .Según el dispositivo utilizado para conseguir el contacto entre la fase móvil y la estacionaria.

Simbología de las diferentes formas de cromatografía Criterio de Clasificación Técnica Plana Cromatografía En columna* Fase móvil Liquido Liquido (CP Cromatografía en papel) Fase estacionaria Sólido (CCF – Cromatografía en capa Fina) Fase Ligada (CCF.Cromatografía en capa fina) .

Supercritica Solida Liquido (CLL) C.Criterio de Clasificación Técnica Fase móvil Gás Cromatografía En columna Fluido Supercrítico Líquido Líquido (CGL) c. Exclusión Fase Enlazada CLFE Liquida de Fase Enlazada CII Intercambio Ionico CB Bioafinidad . Supercrítica de fase enlazada Sólido Fase Enlazada (CGFL) CLS C. Gaseosa sólida Fase Enlazada (CSFL) C. gaseosa liquida) Sólido (CSS) C. Liquido Sólido CE C. Liquido liquido Fase estacionaria Sólido (CGS) C.

CLASIFICACION H De acuerdo al medio o soporte de contacto : Cromatografía en Columna Por presión Por gravedad Cromatografía Planar Por capilaridad Por gravedad H De acuerdo a la naturaleza de la fase móvil : Cromatografía de Gases Cromatografía de Líquidos Cromatografía de Fluidos Supercríticos .

Cromatografia preparativas • La cromatografía preparativa comprende un amplio campo de aplicaciones. desde el aislamiento de 1 µg. . de muestra para identificación espectroscópica hasta el aislamiento de un compuesto puro de una mezcla de 100 g.

Cromatografia preparativas • Cromatografía Frontal: – Procedimiento en el que la muestra (líquida o gaseosa) se alimenta de forma continua al lecho cromatográfico. No se utiliza ninguna fase móvil adicional. • Cromatografía de Elusión: – Procedimiento en el que la fase móvil se pasa de forma continua a través o a lo largo del lecho cromatográfico y la muestra se suministra al sistema de forma discreta. como una pequeña cantidad en un tiempo breve. La muestra se alimenta al sistema en forma discreta. como una pequeña cantidad en un intervalo breve. • Cromatografía de Desplazamiento: – Procedimiento en el cual la fase móvil contiene un compuesto (el desplazarte) que es retenido más fuertemente que los componentes de la muestra analizada. .

Cromatografia Planar • Cromatografia papel • Cromatografia TLC • Cromatografia HPTLC .

Cromatografia en columna • Cromatografía d e intercambio iónico – La Fase Estacionaria es una resina de intercambio iónico que contiene grupos cargados. la Fase Móvil es generalmente una solución amortiguadora de pH. En proteínas la cromatografía de intercambio iónico se basa en las diferencias en signo y magnitud de la carga eléctrica neta de las proteínas a un valor de pH determinado. . teniendo la propiedad de separar especies ionizadas (Cationes o Aniones).

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lectinas y otras moléculas) denominadas ligandos de afinidad y enlazados químicamente en soportes sólidos adecuados. Las separaciones se basan en el acoplamiento ¨llave-cerradura¨ típico de la biología molecular. . de manera reversible y selectiva.Cromatografia en columna • Cromatografia de afinidad – Se trata de un tipo especial de cromatografía de adsorción sólido-líquido en la que la sustancia de naturaleza bioquímica (anticuerpos. inhibidores enzimáticos. cofactores. retienen a los solutos (analitos). también de naturaleza bioquímica.

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. y el tamaño de los poros es tal que algunas moléculas (las demasiado grandes) no podrán ingresar a esos poros. estas partículas son porosas. la columnas se empaquetan con pequeñas partículas esferoidales formadas por esos polímeros entrecruzados. • En consecuencia. o más precisamente. la fase estacionaria consiste en largos polímeros entrecruzados que forman una red tridimensional porosa. en tanto que otras (las suficientemente pequeñas) podrán pasar libremente. – A los fines prácticos. lo cual determina una serie de caminos a ser recorridos por las moléculas que acceden al interior de esta. – Los poros quedan conectados formando una malla o red. según su radio de Stokes.Cromatografia en columna • Cromatografía de exclusión molecular • Las moléculas se separan en solución según su peso molecular. • En esta cromatografía.

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Cromatografia en columna • Cromatografia de adsorción .

Métodos Cromatográficos.sólido. Se encuentran dos tipos de adsorbentes : los tamices moleculares y los polímeros porosos. Cromatografía gas . Los coeficientes de distribución son generalmente mucho mayores que en cromatografía gas líquido. a veces se denominan columnas tubulares abiertas de capa porosa o columnas PLOT. Definiciones. Se basa en la diferente adsorción de las sustancias en fase gaseosa sobre superficies sólidas. Cromatografía gas .líquido. La CSG se lleva a cabo tanto en columnas empacadas como en columnas capilares. . Se basa en la distribución diferencial de los analitos entre una fase gaseosa y una líquida inmovilizada sobre la superficie de un sólido inerte. En éstas se fija en las paredes del capilar una delgada capa de adsorbente.

área de superficie.líquido. Es una clase de cromatografía líquido . Los componentes polares serán entonces más retenidas en la columna que los menos ( o no ) polares. irregular. Se basa en la interacción y distribución diferencial de las sustancias entre una fase móvil líquida y una fase estacionaria líquida presente sobre un soporte sólido. Factores tales como tamaño de partícula. . esférica. geometría. Cromatografía líquida Fase enlazada.sólido.Fase Normal.Cromatografía líquido . Se basa en la adsorción de sustancias sobre superficies sólidas (alúmina. sílica). porosa o pelicular) son de fundamental importancia. adherida o depositada mecánicamente (inmiscible).líquido en la cual la fase móvil es no polar y la fase estacionaria es polar. Cromatografía líquido .

la atracción de la muestra hacia la superficie iónica será mayor y tardará más tiempo en ser eluída. el aditivo es una sustancia menos polar. la fase estacionaria presenta una superficie iónica de carga opuesta a la de la muestra. . su retención será mayor. Entre menos polar sea el material. Algunas veces la fase móvil puede modificarse para cambiar su polaridad.Cromatografía líquido Fase enlazada Fase Inversa. Esta técnica se usa casi exclusivamente con muestras iónicas o ionizables. Clase de cromatografía líquido . La fase móvil es un buffer acuoso y el control de la elusión se hace variando el pH y la polaridad. En esta modalidad. En fase normal esto se logra agregando un solvente más polar mientras que en fase inversa. A mayor carga de la muestra.líquido en la cual la fase móvil es polar mientras que la fase estacionaria es no polar. Cromatografía de Intercambio Iónico.

Se basa en la interacción selectiva de los enantiómeros de una sustancia con un selector quiral presente como fase estacionaria o bien adicionado a la fase móvil. En esta clase de cromatografía la sustancia que se quiere determina se adsorbe covalentemente dentro de una columna a un reactivo específíco para su posterior elución con un solvente adecuado. la columna se empaca con un material que tiene tamaños de poro precisamente controlados. El producto de la asociación estará balanceado eléctricamente. En este tipo de cromatografía. . Cromatografía de Par Iónico. Cromatografía de Afinidad . Se conoce como filtración por gel. Cromatografía de Intercambio Quiral.Cromatografía de Exclusión. Se basa en la obtención de un complejo formado a partir de la sustancia iónica y una segunda sustancia de naturaleza contraria (contraión) con lo cual se anulan las cargas. La muestra se ve sometida a una especie de tamizado y la separación se logra por diferencias en los tamaños moleculares de los componentes de la muestra.

.A tener en cuenta: • La cromatografía líquida puede tener lugar en columnas y sobre superficies planas • La cromatografía gaseosa está restringida a procedimientos en columnas.

AQUI NOS QUEDAMOS EL JUEVES 1/10/09 .

CROMATOGRAFIA DE ELUSIÓN • Elusión: es un proceso en el cual los solutos son lavados a través de una fase estacionaria por el movimiento de una fase móvil • Eluyente: es un disolvente que se usa para llevar los componentes de una mezcla a través de una fase estacionaria .

Secuencias de la Separación Cromatográfica .

CROMATOGRAMA • Es una grafica de alguna función de concentración de soluto contra el tiempo o volumen de elusión .

• Este grafico es útil tanto para análisis cualitativo como cuantitativo. • Las posiciones se pueden emplear para identificar los componentes de la muestra • Las áreas bajo los picos proporcionan una medida cuantitativa de la cantidad de cada especie .

• Estas velocidades son determinadas. por las relaciones de partición de los solutos entre las dos fases.VELOCIDAD DE MIGRACIÓN • La efectividad de una columna cromatográfica para la separación de dos solutos depende en parte de las velocidades relativas a las cuales las dos especies son eluidas. C o n c e n t r a c i ó n B B A A Distancia de migración . a su vez.

Aumenten la velocidad de separación de bandas 2. Disminuyan la velocidad de ensanchamiento de bandas .Variables físicas y químicas que influyen en las separaciones Se pueden obtener con mayor facilidad separaciones mejoradas mediante el control de variables que 1.

a a) Cromatografía original con sobreposición de picos b) la mejoría produjo un incremento en la separación de las bandas c) produjo un decremento en la anchura de las bandas b c Tiempo ------- .

• A móvil ↔ A estacionaria • La constante de equilibrio para esta reacción se llama relación de partición o coeficiente de partición y se define: Cs A móvil A estacionaria K= Cm Cs Cm K = Coeficiente de partición Cs= Concentración soluto en fase estacionaria Cm= Concentración en fase movil .•Todas las separaciones cromatográficas se basan en diferencias en el grado al cual los solutos se reparten entre la fase móvil y la estacionaria.

Tiempo de retención • El tiempo de retención Tr es el tiempo entre la inyección de una muestra y la aparición de un pico de soluto en el detector de una columna cromatográfica • Tiempo muerto Tm es el tiempo que toma para que una especie no retenida pase a través de una columna .

Cromatograma típico tr y h to Wb Wb t .

Fase estacionaria Fase móvil Temperatura .

los factores de capacidad se pueden manipular frecuentemente para dar mejores separaciones variando la composición de la fase móvil y de la fase estacionaria .• Los factores de capacidad en la cromatografía se puede variar cambiando la temperatura y el empaque de la columna. • En la cromatografía liquida.

EFICIENCIA DE LAS COLUMNAS • Se refiere a la magnitud del ensanchamiento de banda que ocurre cuando un compuesto pasa a través de la columna .

tM K’A = -------------------tM Cuando el factor de capacidad para un soluto es mucho menor que la unidad. Se relaciona con el tiempo de elusión de un componente de la muestra no retenido relacionado con el de un compuesto no retenido. Se emplea ampliamente para describir las velocidades de migración de solutos en columnas. los tiempos de elusión se convierten en excepcionalmente largos. Cuando el factor de capacidad quizás sea mayor que 20 a 30. Favorable: entre 1 a 5 .Parámetros Cromatográficos •Factor de Capacidad. tiene lugar la elusión tan rápidamente que la determinación de los tiempos de retención es difícil. El factor de capacidad (K’A) depende del tR y del tM tR .

Parámetros Cromatográficos . La selectividad de una columna es una medida del factor de capacidad de un componente de la muestra relativo al de un segundo componente. KB α = ---------KA En donde KB es la proporción de partición para las especies B retenidas con mas fuerza. y KA es la constante para las especies mantenidas menos fuerte. Α es siempre mayor que la unidad . •Factor de Selectividad (α). o sea las eluidas mas rápidamente (A).

•Donde N es el número de platos teóricos. t'R es el tiempo corregido de retención de un componente y ai es la anchura del pico cromatográfico. •Para definir la eficacia se utiliza el concepto de piso teórico. – Cuanto mayor se el número de platos teórico (N) mayor será la eficiencia de la columna. observando la agudeza de los picos. H es la altura de cada plato. L es la longitud de la columna. •Eficiencia . – La eficiencia o el número de platos se puede observa directamente a partir del cromatograma. no la retención de los mismos. •El número de platos teóricos mide la capacidad de la columna para separar los componentes. . y se define éste como la sección teórico-transversal en la cual se realiza el equilibrio de partición durante el flujo de fase móvil.Parámetros Cromatográficos .

la distancia entre platos es menor y por tanto la eficiencia será mayor.• Si H tiene un valor pequeño. si H es grande la columna es poco eficiente para separar ese componente ya que sus moléculas estarán muy difundidas. • La velocidad de la fase móvil influye en la eficiencia del sistema cromatográfico. por lo que el número de platos será mayor y la altura de los platos menor. . Por el contrario. ya que si la velocidad es pequeña los componentes tendrán más tiempo parta que se pueda realizar el equilibrio de reparto.

Resolución : Es una medida de la separación relativa de dos compuestos en una mezcla. Se denomina generalmente como altura equivalente de plato teórico. El valor de la altura del plato se calcula fácilmente dividiendo la longitud de la columna por la eficiencia de la misma. . Altura de plato .Parámetros Cromatográficos .

• Es el parámetro que expresa el grado de separación que se puede obtener en un sistema cromatográfico para dos componentes dados. Se define como: • Donde Rs es la resolución. Relaciona la capacidad separadora de un sistema cromatográfico para dos componentes.Resolución (R o Rs). tRA y tRB son los tiempos de retención de los componentes A y B. . y aA y aB son las anchuras de los picos del cromatograma de los anteriores componentes.

. La columna o placa es corta. • Si el valor de la resolución está próximo a 1. La columna es demasiado gruesa. pero no la base.5 se obtendrán unos picos bien delimitados por lo que se obtendrá una buena resolución. y está perfectamente delimitado cada pico.7 se obtendrá una mala resolución quedando los picos solapados. La fase móvil no discrimina entre los componentes.• La resolución puede observarse directamente sobre el cromatograma de picos. de forma que se distinguen las crestas. – Se tendrá una buena resolución si los picos no se solapan. sin que coincida el final de uno con el principio del siguiente. • Una pobre resolución es debida principalmente a: – – – – Hay demasiada muestra en la columna. • Si el valor de la resolución está próximo a 0.

Influencia de la forma de la señal sobre la eficiencia Factores que afectan la eficiencia • Calidad del empaque de la columna • Distribución del tamaño de partícula • Tamaño de las partículas • Tipo de estructura del soporte • Calidad del material del empaque Como se puede aumentar: •Aumentando la longitud • Aumentando el flujo •Disminuyendo la viscosidad • Disminuyendo el diámetro • Disminuyendo el recubrimiento .

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