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MONOGRAFA

SOBRE

CROMATOGRAFA
LIQUIDA DE ALTA PERFORMANCE

INTEGRANTES:
Beck, Cristina Soledad
Ibarra, Ariana

CROMATOGRAFA
ndice
1. Introduccin. Mtodos de separacin
2. Tipos de Cromatografa
3. Cromatografa liquida clsica y cromatografa liquida de
alta performance
4. Los mtodos cromatogrficos
5. Ventajas y desventajas de la cromatografa lquida de alta
presin
6. Instrumental
7. Aplicaciones
8. bibliografa

1.Introduccin. Mtodos de separacin


La cromatografa es una tcnica que permite separar, aislar e
identificar los componentes de una mezcla de compuestos qumicos.
La muestra es distribuida entre dos fases inmiscibles (slida, lquida o
gas) , una estacionaria y otra mvil, que se mueven una con respecto
de la otra manteniendo un contacto ntimo, de tal forma que cada
uno de los componentes de la mezcla es selectivamente retenido por
la fase estacionaria. Los componentes de la mezcla a separar
invierten un tiempo diferente en recorrer cada una de las fases, con
lo que se produce la separacin. Si un componente est la mayor
parte del tiempo en la fase mvil el producto se mueve rpidamente,
mientras que si se encuentra la mayor parte en la fase estacionaria,
el producto queda retenido y su salida es mucho ms lenta.
La separacin se lleva a efecto en una columna tubular rellena de
un slido poroso finamente dividido, el cual puede actuar como fase
estacionaria propiamente dicha
como soporte de una fase
estacionaria lquida. Tambin se puede efectuar utilizando como fases
estacionaria papel de filtro o un slido finamente dividido colocado en
forma de capa fina sobre una placa de vidrio. Estos tres tipos de
cromatografa se basan en los mismos principios fundamentales, y se
conocen respectivamente como cromatografa en columna, en papel y
de capa fina. En sta cromatografa solo se considerara la
cromatografa en columna.
La cromatografa es un proceso de separacin muy
comn
en
ingeniera qumica y bioqumica. Es un procedimiento altamente
selectivo, capaz de distinguir y separar componentes con
caractersticas fsicas y qumicas muy similares. Esta tcnica se
considera importante tanto a nivel de produccin como de anlisis.
Desde el siglo pasado las separaciones analticas se llevaban a cabo
por mtodos clsicos como son la precipitacin, destilacin y
extraccin. Los crecientes esfuerzos por conocer ms sobre la
composicin y funcin de las protenas han obligado a los cientficos a
buscar tcnicas, cada vez, ms precisas.
Para elegir una tcnica de separacin, adems de tener en cuenta
los criterios econmicos y de accesibilidad, hay que atender a dos
tipos de consideraciones: unas tienen que ver con las propiedades
fsicas y estructurales de las molculas que se pretende separar, o de
las caractersticas de la matriz en que se encuentran; otras se
derivan de los objetivos del anlisis (sensibilidad, resolucin, tiempo
de anlisis, necesidad de una deteccin especfica).
El mtodo de seleccin incluye los pasos necesarios para la
obtencin, preparacin y posible fraccionamiento de la muestra, la
aplicacin de la tcnica analtica adecuada y el tratamiento de los

datos obtenidos.
Las tcnicas analticas ms empleadas en la actualidad pueden
englobarse en dos grandes grupos: tcnicas de separacin y tcnicas
espectroscpicas. Las tcnicas espectroscpicas proporcionan, para
cada compuesto analizado, una informacin compleja, relacionada
con sus caractersticas estructurales especficas, por otro lado las
tcnicas de separacin se utilizan para resolver los componentes de
una mezcla y la seal obtenida puede utilizarse con fines analticos
cuantitativos o cualitativos.
Actualmente las separaciones analticas se realizan
fundamentalmente por cromatografa y electroforesis.
La cromatografa no solo permite la separacin de los
componentes de una mezcla, sino tambin su identificacin y
cuantificacin. Se pueden separar molculas en funcin de sus
cargas, tamaos y masas moleculares. Tambin a travs de la
polaridad de sus enlaces, sus potenciales redox, etc. El anlisis
cualitativo est basado en la medida de parmetros cromatogrficos
(tiempos y volmenes de retencin) mientras que el anlisis
cuantitativo est basado en la medida de alturas o reas de picos
cromatogrficos que se relacionan con la concentracin.
Los mtodos cromatogrficos se pueden clasificar segn la forma
en que la fase mvil y la fase estacionaria se pongan en contacto. As
en la cromatografa de columna, un tubo estrecho contiene la fase
estacionaria a travs de la cual se hace pasar la fase mvil por
presin. En la cromatografa en plano, la fase estacionaria se fija
sobre una placa plana o a los intersticios de un papel; en este caso la
fase mvil se desplaza a travs de la fase estacionaria por capilaridad
o por gravedad.
Las tres clases de cromatografa desde un ngulo ms general son
cromatografa de lquidos, cromatografa de gases y cromatografa de
fluidos supercrticos. Como su nombre lo indica, la fase mvil en las
tres tcnicas son lquido, gas y fluido supercrtico respectivamente.
En la cromatografa lquida, la fase mvil es un lquido que fluye a
travs de una columna que contiene a la fase fija. Solo la
cromatografa de lquidos es la que puede llevarse acabo en columna
o sobre superficies planas, por otra parte tanto la de gas como la de
fluidos supercrticos estn restringidas a los procedimientos en
columna de tal manera que las paredes de la columna contienen la
fase mvil.
La tcnica ms usada es la cromatografa lquida de alta
resolucin(HPLC), por su sensibilidad, fcil adaptacin a las
determinaciones cuantitativas exactas, su idoneidad para la
separacin de especies no voltiles y su aplicacin a sustancias de

primordial inters en la industria, como son los aminocidos,


protenas, cidos nucleicos, hidrocarburos, carbohidratos, entre otros.
2.Tipos de cromatografa
En la cromatografa en columna, la fase mvil puede ser un lquido
o un gas, y segn el caso se denominan
respectivamentecromatografa lquida y cromatografa de gases .
Esta fase mvil fluye a travs del relleno de la columna, arrastrando
los componentes de la mezcla, que son selectivamente retenidos por
al fase estacionaria. EL flujo de la fase mvil se mantiene constante a
travs de todo el proceso y de esta manera se logra que cada
componente de la mezcla sea eluido de la columna como un
compuesto puro, disuelto en la fase mvil. A esta tcnica se le llama
cromatografa de elusin. De acuerdo con la naturaleza de las fases
involucradas y con los mecanismos de separacin, es posible
distinguir diferentes tipos de cromatografa, como se indica en la
figura 1.

FIG. 1 - Mtodos cromatogrficos. CGS: cromatografa gas-slido; CGL:


cromatografa gas-lquido; CLS: cromatografa lquido-slido; CLL: cromatografa
lquido-lquido; CFQU: cromatografa de fase qumicamente unida; CII:
cromatografa de intercambio inico; CCF: cromatografa de capa fina; CP:
cromatografa de papel; CE: cromatografa de exclusin; CPG: cromatografa de
permeacin en gel; CFG: cromatografa de filtracin en gel.

Cromatografa de gases y cromatografa lquida de alta presin.

3. Cromatografa liquida clsica y cromatografa liquida de


alta performance
La cromatografa liquida clsica se lleva acabo en una columna
generalmente de vidrio, la cual esta rellena con la fase lquida. Luego
de colocar la muestra en la parte superior, se hace fluir la fase mvil
a travs de la columna por efecto de la gravedad. Con el objeto de
aumentar la eficiencia en las separaciones, el tamao de las
partculas de fase fija se fue disminuyendo hasta el tamao de los
micrones, lo cual genero la necesidad de utilizar altas presin es para
lograr que fluya la fase mvil. De esta manera, naci la tcnica de
cromatografa lquida de alta resolucin (HPLC), que requiere de
instrumental especial que permita trabajar con las altas presiones
requeridas. Ver figura 2.

4. Los Mtodos Cromatogrficos


Dependiendo del tipo de fase fija y del tipo de fenmeno fsico que
provoca la separacin, la cromatografa lquida de alta resolucin puede
ser:
1) cromatografa de reparto o CLL: separa los solutos basndose en
la solubilidad.
Formada por CLL y CFQU. Estas tcnicas se diferencian en la forma
en que se retiene la fase estacionaria sobre las partculas del soporte
relleno. En el segundo caso, la fase estacionaria se une qumicamente a
la superficie del soporte. Esta tcnica actualmente es ms usada debido
a que la cromatografa CLL necesita de un recubrimiento peridico de las
partculas del soporte debido a la prdida de la fase estacionaria por
disolucin en la fase mvil.
En general, los soportes para casi todos los rellenos de fases unidas
qumicamente se preparan con slice rgida o composiciones donde la
slice es el elemento bsico. Estos slidos estn formados por partculas
mecnicamente resistentes, porosas y uniformes.
Los rellenos de columna en la CFQU se clasifican como de fase inversa
cuando el recubrimiento enlazado tiene carcter no polar, y de fase
normal cuando el recubrimiento contiene grupos funcionales polares.

Este mecanismo de separacin se basa en la distinta solubilidad que


presenta una molcula de la muestra en la fase mvil y en la fase
estacionaria. De ah que los compuestos mas solubles en la fase
estacionaria sean selectivamente retenidos por ella en tanto que los
menos solubles son transportados mas rpidamente por la fase mvil.
Puede utilizarse en la separacin de mezclas edulcorantes artificiales,
antioxidantes, bebidas refrescantes entre otras.
El inconveniente de esta tcnica es las solubilidad de la fase
estacionaria en la fase mvil y el deterioro de la columna. Esto se puede
corregir saturando la fase mvil con las fase estacionaria por medio de
una precolumna que contenga un alto porcentaje de fase estacionaria. O
bien, utilizando materiales que contengan la fase estacionaria
qumicamente unida a la superficie de un soporte (a modo de material
de relleno de la columna no suele ser empleada); esto evita la perdida
de fase estacionara y hace innecesario el uso de precolumnas para
saturar la fase mvil.
Esta requiere un control cuidadoso de flujo y de la temperatura para
poder identificar un compuesto de terminado en funcin del tiempo de
retencin que es caracterstico, en las condiciones de flujo y
temperaturas utilizadas, del compuesto determinado.
2)

Cromatografa de fase qumicamente unida (CFQU):

Esta tcnica surgi como consecuencia de problemas asociados con la


CLL. Dado que su fase estacionaria esta qumicamente unida a la
superficie de un soporte, la fase mvil difcilmente produce deterioro
alguno en la columna. Si se vara la naturaleza de los grupos funcionales
de las fase estacionaria es posible obtener diferentes tipos de
selectividad. Dichos grupos pueden ser de naturaleza polar, como el
grupo amino y el grupo nitrilo en el caso de la cromatografa de fase
normal, o bien no polar como el grupo octilo, octadecilo, fenilo, etc. en
el caso de la cromatografa de fase inversa, sta tiene innumerables
aplicaciones.
Su inconveniente es que en la cantidad de fase estacionaria que es
posible unir a la superficie de un soporte (partculas de slice), es
limitada y como consecuencia los tamaos de muestra separados en
esta columna son reducidos, por lo comn menor de 1 mg.
Este mecanismo de separacin es complejo, cuyas caractersticas son
similares a la de la CLL y es el ms utilizado.
3) Cromatografa de adsorcin o CLS: se basa en la afinidad de
adsorcin
Es la forma clsica de la cromatografa de lquidos. Ha sufrido algunas
transformaciones que la han convertido en un mtodo importante de la

HPLC.
Las nicas fases que se utilizan en este tipo de cromatografa son la
slice y la almina, siendo la primera la preferida.
Es adecuada para compuestos no polares probablemente con masas
moleculares inferiores a 5000. Los mtodos de la cromatografa de
adsorcin y reparto tienden a ser complementarios, aunque en algunos
casos se superponen.
En general la CLS es ms adecuada para muestras que son solubles
en disolventes no polares y por ello tienen solubilidad limitada en
disoluciones acuosas que son las que se utilizan en cromatografa de
reparto en fase inversa. En ste tipo de cromatografa tambin se
pueden separar compuestos con diferentes grupos funcionales. Una
caracterstica particular de este mtodo es su capacidad para diferenciar
compuestos ismeros en mezclas.
El mecanismo de separacin de sta, se basa en la competencia que
existe entre las molculas de la muestra y de la fase mvil o disolvente
por ocupar los sitios activos en la superficie de un slido (almina y gel
de slice).
Este tipo de cromatografa es muy til y se aplica a molculas de baja
o media polaridad.
4) Cromatografa lquida por exclusin o CE: separa solutos segn el
peso molecular
La cromatografa de exclusin, tambin llamada de filtracin en gel
o cromatografa de permeacin en gel, se basa en la diferencia de
penetracin de las molculas en los poros de la fase estacionaria
debido a que la separacin obtenida depende del tamao de la
molcula. El tiempo de retencin es proporcional al peso molecular
de los mismos, por lo que no es muy usada con los compuestos de
alto peso molecular. Este tipo de separacin por tamao difiere de las
dems tcnicas de cromatografa en que no existen interacciones
fsicas o qumicas entre el analito y la fase estacionaria. Es una
tcnica reproducible, escalable y rpida.
La fase fija est formada por partculas de slice que contienen una
red uniforme de poros por los que pueden penetrar las molculas de
pequeo tamao. Las molculas de tamao grande se excluyen
totalmente y son eluidas en primer lugar, mientras que las de
pequeo tamao tienen acceso a todo el volumen poroso y son las
ltimas que se eluyen; de esto se deduce que el volmen disponible
para las molculas pequeas es mayor que para las grandes. Por lo
tanto las molculas se eluyen por su tamao decreciente.
Los diferentes tipos de partculas usadas deben ser estables:
mecnica y qumicamente; tener bajo contenido en grupos inicos,

uniformidad de poro y tamao. Hay diferentes tamaos de partcula


para un gel: a menor tamao mayor resolucin y menor gasto en la
columna.
Este tcnica se emplea en la separacin de protenas de alimentos,
determinacin de glucosa y fructosa en zumos de fruta, etc.
La columna se rellena de un gel, cuyos poros son de tamao similar
al tamao de las molculas de la muestra. Las molculas pequeas
pueden penetrar dichos poros y quedan retenidas en tanto que las
grandes no. Las columnas empleadas pueden ser muy largas (varios
metros) y esto es especialmente cierto cuando se desea separar
muestras cuyos pesos moleculares estn distribuidos en intervalos
muy amplios.
Estas dos variantes en CE: la cromatografa de filtracin, emplea
materiales blandos; incapaces de resistir presiones mayores de 4
atm. y es muy aplicada en el estudio de los biopolmeros y en
contraste; la cromatografa de permeacin, emplea materiales de
relleno semirgidos o rgidos, y que pueden resistir presiones muy
elevadas. Ambas no implican mecanismos de separacin diferentes y
su divisin se debe a motivos puramente histricos.
Aunque existen excepciones, la eficacia de las columnas de la CE es
por lo general relativamente baja, por lo cual no es frecuente en esta
tcnica obtener la separacin de compuestos individuales, sino ms
bien fracciones de un cierto intervalo de pesos moleculares. El
mecanismo de separacin es tal que el tiempo de retencin es
inversamente proporcional al volmen de las molculas en la fase
mvil y por lo tanto proporcional al peso molecular; las molculas
ms pequeas son las que son objeto de una mayor retencin en la
columna.
5) Cromatografa por intercambio inico o CII: Separa solutos segn
la carga inica.
Est basada en la atraccin entre iones del soluto y puntos
cargados que existen en la fase estacionaria. En el caso de
intercambiadores aninicos, grupos cargados positivamente en la
fase estacionaria atraen aniones del soluto. Los intercambiadores
catinicos contienen puntos cargados negativamente que atraen
cationes del soluto.
Los intercambiadores inicos se clasifican en cidos o bsicos,
fuertes o dbiles. Las resinas cidas fuertes siguen ionizadas incluso
en disoluciones muy cidas, en cambio las resinas cidas dbiles se
protonan a un pH prximo a 4 y pierden su capacidad de intercambio
catinico. Los grupos muy bsicos de amonio cuaternario siguen
siendo catinicos a cualquier valor de pH. Los bsicos dbiles de

amonio terciario se desprotonan en disoluciones moderadamente


bsicas y pierden entonces su capacidad. Las resinas de intercambio
inico tienen aplicacin de estudios donde intervienen molculas
pequeas (PM = 500) que pueden penetrar en los poros pequeos de
la resina. Los intercambiadores inicos de polestreno son tan
grandes que en las macromolculas muy cargadas, como las
protenas, se pueden lanzar irreversiblemente a ellos. Los de celulosa
y dextranos sirven para intercambio inico de macromolculas. Los
geles de intercambio inico se usan en el caso de molculas grandes
(protenas y cidos nucleicos). Cuando las separaciones exigen
condiciones qumicas fuertes se emplean intercambiadores inicos
inorgnicos.
La separacin por intercambio inico se basa en la competencia
entre la fase mvil y la muestra inica por los sitios o grupos activos
de una resina intercambiadora de iones.
Este tipo de separacin se aplica a compuestos de un intervalo de
pesos moleculares muy amplio, y ejemplos caractersticos de stos
son los pptidos y los aminocidos. Las columnas son ms largas que
las empleadas en otro tipo de cromatografa se basa en la baja
eficiencia de los materiales intercambiadores de iones.
La gran variabilidad de los mtodos cromatogrficos se debe a las
diferentes condiciones que pueden utilizarse para separar los
componentes de una sustancia. Todas estas tcnicas tienen en
comn la existencia de una fase estacionaria a travs de la cual fluye
una fase mvil, as como la presencia de un mecanismo de inyeccin
de la muestra y un mecanismo de deteccin de los diferentes
componentes separados

tipo

lquido-slido

fase
estacionaria

slido inerte como


gel de slice o
disolventes
almina

intercambio
inico
resina cambiadora
lquidolquido

gas-lquido

fase
mvil

soluciones
acuosas

lquido adsorbido
en un soporte slido

lquido

pelcula de lquido
adsorbida sobre un
soporte slido

gas

4. Ventajas y desventajas de la cromatografa lquida de alta


presin
Ventajas
-Velocidad de anlisis
-Alta resolucin
-Resultados cuantitativos
-Buena sensibilidad
-Automatizacin
-Amplio espectro de aplicaciones

Desventajas
-Instrumentacin costosa
-Difcil anlisis cualitativo
-No existe detector universal
y sensible
-Elevado costo de operacin
-Experiencia indispensable

Con esta tcnica es usual obtener separaciones en minutos e


inclusive en algunos casos en segundos. Por lo tanto se requieren
columnas de alta eficacia y sistemas de bombeo de alta presin, ya
que separaciones rpidas requieren flujos rpidos de fase mvil y
esto a su ves requiere presiones elevadas.
Su alta resolucin permite obtener y separar mezclas muy
complejas; como algunos fluidos biolgicos como la orina humana.
Las muestras naturales son difciles de manejar, pero con CII y
programacin de fase inmvil la resolucin es notable.
Los mtodos de HPLC proporcionan muy buena informacin de tipo
cualitativo, efectuando anlisis con precisin del 1%.
Los detectores proporcionan buena sensibilidad y segn el tipo de
muestra suelen medir hasta los 10 9 ng (nanogramos), otros mas
especializados pueden detectar cantidades muy pequeas.
Entre las ventajas de esta tcnica, la ms importante es la
diversidad de sus aplicaciones tantos a compuestos orgnicos como
inorgnicos, etc.
Las nicas muestras no susceptibles de poderse analizar con
facilidad son las gaseosas.
Mediante los instrumentos cromatogrficos, la identificacin de cada
seal de la muestra a anlisis se realiza comparando los tiempos de
retencin con valores previamente determinados y la cuantificacin
se obtiene mediante las reas integradas de las seales de acuerdo
con el mtodo analtico seleccionado.
Teniendo en cuenta sus limitaciones, el instrumental es costoso y
representa inversin para los laboratorios. Otra limitacin es la
necesidad de que el personal que utiliza estos mtodos tenga
experiencia para poder obtener provecho, lo cual requiere de 6 a 12
meses de experiencias para llegar a ser operador eficiente.
La HPLC no es un buen mtodo de identificacin, en general la
cromatografa es bsicamente una tcnica de separacin de gran

resolucin, pero que no nos identifica el compuesto que da la seal


obtenida en el cromatograma.
5. Instrumental
La HPLC utiliza un instrumental con ventajas significativas:

En este mtodo se usan columnas de dimetros muy reducido,


rellenas de materiales especiales pulverulentos, cuyas partculas
tienen un tamao entre 30-40 m y con frecuencia hasta de 5 6
m , con una distribucin de 2 m . Este tipo de columna es muy
eficaz, pero ofrece una gran resistencia al flujo de la fase mvil, o sea
una gran cada de presin. Por lo que se emplean sistemas de
bombeo de alta presin que hagan fluir la fase mvil a velocidad a
travs de la columna. La cantidad de fase estacionaria dentro de la
columna es pequea, por lo tanto la muestra debe ser pequea en 1
y 10 mg.
Si la presin de entrada a la columna no es muy elevada, la
muestra se introduce en la cmara de inyeccin mediante una jeringa
de alta presin, a presiones ms elevadas se utilizan las vlvulas de
inyeccin. La columna a pesar de su repetido uso, presenta un escaso
deterioro, auque en algunos casos es necesario regenerarla.
Un detector colocado a la salida de la columna, proporciona un
registro continuo de la composicin del lquido que sale, lo que
permite obtener un cromatograma y que se utiliza para identificar y
cuantificar los componentes de la muestra.

6. Aplicaciones

La cromatografa lquida de alta presin a pesar de ser una


tcnica relativamente nueva, se cuenta que describe numerosas
aplicaciones en la literatura qumica. En la mayora de los casos,
stas consisten en determinaciones de sustancias cuyo anlisis por
otra tcnica cromatogrfica resulta muy difcil. Estos resultados
comprenden:
Compuestos inicos, como aminocidos, sales inorgnicas, cidos
orgnicos, etc.
Compuestos de alto peso molecular, como polmeros,
hidrocarburos polinucleares, productos naturales, etc.
Compuestos termolbiles y no voltiles, como vitaminas,
pesticidas, esteroides, plastificantes, drogas y un producto muy
grande de otros productos farmacuticos.
En los problemas relacionados con la contaminacin ambiental, la
HPLC se utiliza para la contaminacin de algunos pesticidas
(insecticidas, larvicidas, hervicidas, etc.). Tambin es posible la
determinacin de hidrocarburos aromticos polinucleares que son
contaminantes atmosfricos muy importantes
En cromatografa lquida el anlisis de compuestos vitamnicos
es posible en corto tiempo.
El bioqumico con frecuencia en un campo de investigacin es el
que plantea el problema de analizar compuestos voltiles y de alto
peso molcula. Por ejemplo, se han efectuado determinaciones de
constituyentes de cidos nucleicos (nucletidos, nuclesidos) por
cromatografa de intercambio inico.
En el campo bioqumico la determinacin de esteroides en
cromatografa lquida ha sido el de deteccin, ya que slo el
detector de luz ultravioleta es lo bastante sensible para poner de
manifiesto estos compuestos a bajas concentraciones, pero no
todos los esteroides absorben en la regin ultravioleta. Esto ha dado
lugar a la formacin de compuestos derivados de los esteroides que
absorben en el ultravioleta a fin de hacer posible el anlisis.
El anlisis de medicamentos es tambin una aplicacin muy
interesante, la determinacin de los componentes activos de una
tableta analgsica. Tambin el anlisis de barbitricos,
anticonceptivos, etc.
En caso de que el compuesto analizar sean de alto peso
molecular, se usa cromatografa de permeacin o de exclusin. Es
posible combinar dos o ms tcnicas cromatogrficas para efectuar
separaciones difciles. La de permeacin es til en el estudio de
polmeros, facilitando la determinacin de la distribucin de pesos

moleculares, y en la investigacin de productos naturales para


efectuar separaciones de acuerdo con el peso molecular.
En separaciones segn el tipo qumico su finalidad no es la
separacin de compuestos individuales, sino de grupos diferentes
de sustancias presentes en las mezcla.
9. Bibliografa
* Harold M. McNair y Benjamn Esquivel H. Departamet of
Chemistry y Virginia Polytechnic Institute and State University
Blacksburg, Virginia Estados Unidos, 2 edicin 1980.
* Principios de Anlisis Instrumental 5 Edicin. Skoog Holler
Nieman.
* Informacin de internet (www.quiored.com.ar,

www.tecnoedu.com, Red Latinoamericana de Qumica por:


Rubn Daro Cortez)