Servicio Nacional de Adiestramiento en Trabajo Industrial

Centro de Tecnologías Ambientales

INTEGRANTES:

• Benavente Torres, Nicole

• Caballero Cordova, Nilo
• Chunga Mondragón, Judith
• Rosales Palacios, Deybis
• Massa Toribio, César

CURSO:
Ensayos microbiológicos

PROFESOR:
José Azabache Asmat

AÑO:
2022
 Objetivo del trabajo

Contando con información tecnológica y recursos adicionales, los estudiantes serán capaces de
elaborar un análisis de coliformes termo tolerantes en agua de consumo humano, considerando
aspectos de calidad, cuidado ambiental y seguridad e higiene industrial, sin error.

Planteamiento del trabajo

La empresa “Aqua SA” dentro del desarrollo de nuevos productos, requiere realizar un análisis
de coliformes termo tolerantes en agua de consumo humano. Para ello se le pide, presentar una
propuesta de análisis indicando su propuesta de trabajo, esquemas necesarios, listado de equipos
e instrumentos a utilizar, procedimientos y cronograma de ejecución.
A. Método a utilizar

Realizaremos el Método de número más probable (NMP)

El método de NMP consiste principalmente en determinar la presencia o ausencia sea

positiva o negativa de atributos específicos de microorganismos en copias obtenidas por
diluciones consecutivas a partir de muestras de lácteos. Se basa en el principio de que una
única célula viva puede desarrollarse y producir un cultivo turbio . Este número es
calculado a partir de la observación del crecimiento respecto a la aparición de turbidez,
en cultivos en caldo duplicados, inoculados con porciones de un ml de diluciones
decimales de la muestra. Las cifras que representan resultados positivos con crecimiento
en tres diluciones sucesivas, suelen denominarse número significativo.

El método requiere la realización de una serie de diluciones en serie de la muestra de

cultivo, en un medio líquido adecuado para el crecimiento de dicho organismo de un
volumen diez veces mayor. Luego, se incuban las muestras de esos tubos y, pasado un
tiempo, se examinan los tubos. Aquellos tubos que recibieron una o más células
microbianas procedentes de la muestra, se pondrán turbios, mientras que los tubos que
no recibieron ninguna célula permanecerán transparentes.

B. Materiales e instrumentos

➢ Equipos

- Baño María
- Incubadora
- Vortex
 - Autoclave
- Cámara fotográfica

➢ Medios de cultivo

- Caldo Lauril sulfato. Merck

- Caldo brilla. Merck
- Caldo EC (caldo E. coli). Merck
- Caldo Peptonado

➢ Materiales

- Tubos de ensayo 10 x 15 mm.

- Campanas de Durham

- Pipetas 1, 2, 5 y 10 ml

- Probeta de 100ml

- Mechero de alcohol

- Frascos de vidrio colectores de boca ancha y tapa rosca (250 ml)

- Termo de poroflex

- Asas bacteriológicas en aro

- Gradilla

- Algodón

- Encendedor

- Alcohol 96°c

➢ EPPS

- Mandil

- Guantes quirúrgicos

- Mascarilla

- Protector de cabeza

C. Procedimiento

• Etapa de Laboratorio
En esta etapa de la investigación, se procedió a efectuar el análisis bacteriológico de
las muestras de agua a través del método de tubos múltiples de fermentación (serie de
5 tubos), el cual consistió en determinar la densidad del grupo coliformes expresadas
en términos del “Numero Más Probable” (NMP) Para lo cual se efectuó en 2 fases:
Presuntiva y Confirmativa.

• Fase Presuntiva

Se inoculó muestras de agua en volúmenes de 10 ml, 1 ml y 0.1 ml respectivamente,

con campanas de Durham invertidos en su interior en serie de 5 tubos de fermentación
que contenían 10 ml del medio de cultivo caldo Lauríl sulfato, luego se procedió a la
incubación a 37°C durante 24 a 48 horas; al cabo de este tiempo se examinó los tubos
de las series, constituyendo la presencia de gas como positivo. Por consiguiente, se
procedió a efectuar la fase confirmativa.

• Fase Confirmativa

En esta fase del análisis solo se trabajó con los tubos positivos de la fase presuntiva. El
cual, nos permitió determinar la presencia de Coliformes Termo tolerantes.

• Confirmación de Coliformes Termo tolerantes

Para la confirmación de coliformes termo tolerantes, se inoculó una azada de los tubos
positivos en series de 5 tubos de fermentación que contienen tubos Durham en su
interior y 10 ml de caldo Escherichia coli, luego se les incubó a 44.5°C durante 24 a
48 horas en baño maría; al cabo de este tiempo se examinó los tubos de las series,
constituyendo la presencia de gas como positivo. Posteriormente, a partir de los tubos
que resultarán positivos, se procedieron a determinar el número de coliformes termo
tolerantes por 100 ml; con la ayuda de la tabla del NMP.

Todos los resultados se compararon con la Norma de los Estándares Nacionales de

Calidad Ambiental para Agua ECA´s-MINAM.

ETAPA DE LABORATORIO

• Muestras recolectadas
• Diversos tubos con caldo Lauril y los tubos invertidos de durham ensu interior.

• Inoculando las muestras de agua en concentración 10 ml, 1 ml y 0.1 ml en

caldo Lauril.
• Incubando las muestras por 48 horas a temperatura 35°C - 37°C

• Fase Presuntiva: A la izquierda un tubo negativo y a la derecha un tubo

positivo (presencia de gas)

• Caldo E. coli (coliformes termotolerantes) y caldo brilla (coliformes totales).

• Fase Confirmativa: Inoculación de las muestras positivas en caldo brilla
(coliformes totales) y caldo E. coli (coliformes termotolerantes).
• Tubo con caldo E.coli negativo (izquierda) y positivo (derecha)

• Tubo con caldo brilla negativo (izquierda) y positivo (derecha)

• Tabla de valores de números combinatorios en serie de 5 tubos en concentraciones

de 10 ml, 1 ml y 0.1 ml.
 D. Cronograma de ejecución

CRONOGRAMA DE EJECUCIÓN

Análisis bacteriológico de la muestra

30 horas
de agua para consumo humano

Incubación a 37 °C de tubos de
24 horas 48 horas
fermentación con 10 ml de cultivo

Incubación a 44.5 °C tubos de

24 horas 48 horas
fermentación (Positivos)

E. Esquema

Muestra de agua

10ml 10ml 10ml

F.
G.
H.

Caldo brilla Caldo brilla

doble simple
concentrado concentrado

Gas (-)
Gas (+)
24
24
Horas
Horas

Prueba Re incubar 24
confirmativa
positiva para Prueba de Horas
Gas (+) 24
coliformes temperatura elevada
termo Horas en caldo brilla
tolerantes incubar a 11,5+/-0,2
Gas (-) 24 ºC

Prueba Horas Gas (+) 48 Gas (-) 48

negativa horas: prueba horas:
positiva para prueba
coliformes negativa
totales
F. Bibliografia

• Córdova, Tania. (2020). Determinación de coliformes termotolerantes por

fermentación en tubos multiples (SM 9221 E). Curso Taller REDCAM 2020:
Estandarización de las mediciones analíticas requeridas para la estimación del
Índice de Calidad de Aguas Marinas y Costeras – ICAM. Ocean teacher Global
Academy. Santa Marta D.T.C.H., Colombia.

• Gianoli, A; Hung, A y Shiva, C. (2018). Relación entre coliformes totales y termo

tolerantes con factores fisicoquímicos del agua en seis playas de la bahía de
Sechura-Piura 2016-2017. Salud y tecnología veterinaria. 2018;2: 62-71.

• Sotil, H. (2017). Análisis de indicadores de contaminación bacteriológica

(coliformes totales y termo tolerantes) en el lago de morona cocha. (Tesis de
licenciatura, Universidad científica del Perú, Facultad de ciencia e ingeniería,
Escuela Nacional de Ecología). San Juan, Piura.