Universidad de Guayaquil

Facultad de Ciencias Químicas

Carrera: Bioquímica y Farmacia
Guía de Prácticas de Laboratorio
Práctica Aislamiento e identificación de ADN de cebolla
No.3
Integrantes
• Salazar Mora Fernando Andres Grupo#5
• Moreno Carriel Kiara Scarleth
Grupo #1- • Viñan Benites Lenin Ascencion Docente: Q.F. Yaime Delgado Arcaño
B • Peralta Perea Nashly
• Acosta Barboto Josue Emanuel

Objetivos de la práctica de laboratorio

1. Ejecutar la separación de moléculas de ADN de otros constituyentes celulares.
2. Demostrar su identidad.
Instrucciones o consideraciones previas (marco teórico)
Los rasgos hereditarios son transmitidos por los genes. Los genes son partes de moléculas gigantes de ácido
desoxirribonucleico (ADN). El ADN se encuentra enrollado alrededor de moléculas proteicas básicas llamadas
histonas. Una histona es una proteína que proporciona apoyo estructural para un cromosoma. Cada
cromosoma contiene una molécula larga de ADN, que debe caber en el núcleo de la célula. Para eso, el ADN
se enrolla alrededor de complejos de proteínas histona, lo que da al cromosoma una forma más compacta.
La combinación de la unidad de ADN con la histona es un nucleosoma. En los organismos inferiores, como
las bacterias y las levaduras, tanto el ADN como el ARN (ácido ribonucleico) se encuentran en el citoplasma,
mientras que, en los organismos superiores, la mayor parte del ADN está dentro del núcleo y el ARN está
fuera del núcleo, en otros orgánulos y en el citoplasma.

En este experimento, aislaremos moléculas de ADN de células de cebolla. La primera tarea es romper las
células. Esto se logra mediante una combinación de diferentes técnicas y agentes. Triturar las células hasta
romperlas hace que el citoplasma de muchas células de cebolla se derrame. Sin embargo, este no es un
proceso completo. La adición de un detergente cumple dos funciones: (1) ayuda a solubilizar las membranas
celulares y, por lo tanto, debilita aún más las estructuras celulares, y (2) ayuda a inactivar las enzimas que
degradan los ácidos nucleicos, las nucleasas, que están presentes. Sin esta inhibición, las nucleasas
degradarían los ácidos nucleicos a sus nucleótidos constituyentes.
Una vez que los ácidos nucleicos están en solución, deben separarse de los demás constituyentes de la
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célula. Estas son proteínas y pequeñas moléculas solubles en agua. La adición de solución de NaCl minimiza
la interacción entre las moléculas de histona (proteína) cargadas positivamente y el ADN cargado
negativamente.
La adición de etanol precipita las moléculas grandes (ADN, ARN y proteínas) y deja las moléculas pequeñas
en solución. El ADN, al ser la molécula fibrosa más grande, forma precipitados filiformes que se pueden
enrollar en una varilla. La proteína y el ARN forman un precipitado gelatinoso que no puede recogerse
enrollándolos en una varilla de vidrio. Por lo tanto, quedan separados el ADN del ARN y las proteínas. Esta
es una separación cruda y el ADN así aislado puede contener algunas proteínas contaminantes.
Reactivos de laboratorio:
- Alcohol etílico
- Detergente
- Difenilamina
- NaCl
- Tampón de citrato (NaCl 0,15 M, citrato de sodio 0,015 M)

Muestra:
- Cebolla perla
Materiales
- Abrazadera de anillo
- Agitador
- Embudo
- Gradilla
- Mortero
- Papel filtro
- Pipetas de 5 ml
- Soporte de anillo
- Tubos de ensayo
- Varilla de vidrio
- Vaso de precipitado
Equipos de laboratorio
Balanza
Baño de agua caliente
Técnica operatoria o procedimiento (Actividades por desarrollar)
Para que pueda seguir el procedimiento paso a paso, se proporciona un diagrama de flujo del proceso de
aislamiento de ADN.

Después del aislamiento del ADN, probaremos su identidad mediante la prueba de difenilamina. El color azul
de esta prueba es específico para la desoxirribosa.
La aparición de color azul se puede utilizar para identificar la molécula de ADN que contiene desoxirribosa. El
reactivo de difenilamina contiene pequeñas cantidades de acetaldehído. Este compuesto es irritante para los
ojos, aunque no en la concentración que existe en el reactivo. Aun así, algunos almacenes prefieren no
manipular acetaldehído y preparar una prueba de difenilamina menos selectiva sin acetaldehído en la que el
color amarillo verdoso de la desoxirribosa aparece muy rápido, mientras que otros azúcares, glucosa, ribosa,
etc., dan una coloración tenue que evoluciona lentamente.
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 Procedimiento:
1. Enfriar un mortero en agua helada. Agregue 20–30 g de cebolla amarilla picada.
2. Triturar la cebolla durante 5 min. para romper las células. Se formará una papilla amarillenta.
3. Usando una placa caliente, caliente 100 mL de agua destilada a 60 ºC. Agregar 10 g de NaCl y 10 mL de
detergente. Revuelva para disolver.
4. Agregue la cebolla molida a 30 mL de la solución salina con detergente. Usando una varilla de vidrio,
agitar la solución durante 5 min., mientras se mantiene la temperatura a aproximadamente 60 ºC.
5. Sostenga un embudo con una abrazadera de anillo en un soporte de anillo sobre un vaso de precipitados
de 150 ml.
6. Coloque un papel de filtro al embudo y decante la suspensión celular sobre el papel de filtro.
7. Deje que el líquido amarillento se filtre en el vaso de precipitados.
8. Enfriar la solución a temperatura ambiente.
9. A la solución acuosa viscosa que contiene ADN, agregue lentamente el doble de su volumen de etanol
absoluto frío, teniendo cuidado de que cuando agregue el alcohol, fluya a lo largo del costado del vaso de
precipitados, asentándose sobre la solución acuosa y formando una capa.
10. El siguiente paso es crítico: Inserte suavemente una varilla de vidrio esterilizada con llama en la
solución, justo debajo de la interfaz de las soluciones de ADN y alcohol. El ADN forma un precipitado
filiforme en la interfase. Gire (no revuelva) la varilla de vidrio en una dirección (hacia la derecha o hacia la
izquierda). La rotación enrolla todo el precipitado de ADN en la varilla de vidrio. Transfiera el ADN
enrollado en la varilla a un tubo de ensayo que contenga etanol al 95 %.
11. Deseche la solución de alcohol/detergente que queda en el vaso de precipitados en botes de basura
especialmente etiquetados. No vierta la solución por el fregadero.
12. Retire la varilla y el ADN enrollado del tubo de ensayo. Seque el ADN con un papel de filtro limpio.
Describe la apariencia del ADN crudo (1). Disolver el ADN crudo aislado en 2 ml de tampón de citrato
(NaCl 0,15 M, citrato de sodio 0,015 M).
a. Preparar un tubo de ensayo seco y limpio (150 x 18 mm). En el tubo de ensayo agregue 2 ml de agregue 2
ml de la solución de ADN crudo. Agregue 5 ml de reactivo de difenilamina al tubo de ensayo. Mezclar el
contenido del tubo de ensayo. Calentar el tubo de ensayo en un baño de agua hirviendo durante 10 min.
Tenga en cuenta el color (2).
b. Como procedimiento alternativo se puede utilizar difenilamina al 1% disuelta en ácido sulfúrico
concentrado. Coloque el tubo de ensayo como arriba en a, pero agregue solo 1 mL de solución.
13. Mantenga los tubos de ensayo en una gradilla para tubos de ensayo apuntando lejos de su cara.
14. Usando guantes, agregue lentamente, gota a gota, con una pipeta, un máximo de 1 mL de solución de
difenilamina al 1% al tubo de ensayo. Deje de agregar el reactivo de difenilamina cuando aparezca la
coloración. Sosteniendo la parte superior del tubo de ensayo entre los dedos, gírelo lentamente después
de cada adición. La adición de ácido sulfúrico concentrado a la solución acuosa genera calor que ayuda al
desarrollo del color. No toque el fondo de los tubos de ensayo. Están calientes. Anota el color y estima en
segundos qué tan rápido se desarrolla.
Resultados obtenido
Flujograma del procedimiento de la extracción del ADN

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 Ejemplo de extracción de ADN en Plátano (Musa sp.)

Objetivos
• Comprender para que sirve cada material en la separación de ADN.
Materiales para realizar la extracción casera de ADN

• Material vegetal, plátanos (Musa sp.).

• Taza medidora.
• frascos pequeños.
• Funda Ziploc (utilizarla como mortero)
• Detergente líquido.
• Sal de cocina o cloruro de sodio NaCl.
• Papel de filtro y colador.
• Etanol o alcohol isopropílico con una concentración mayor a 70%, frío.
• Agua.

Pasos para la extracción de ADN

El procedimiento para realizar el aislamiento del ADN sigue los siguientes pasos:
Paso 1: preparación de solución salina-jabonosa
Preparamos una solución salina-jabonosa compuesta con 90 mL de agua, 10 mL de detergente líquido (1
cucharada) o 20 mL de champú (dos cucharadas) y 13 gr de NaCl o sal de cocina (una cucharada).
Paso 2: preparación de las frutas
Pelamos el plátano y cortamos en cubos pequeños, luego lo trituramos en una bolsa con cierre hermético.
Paso 3: adición de la solución de sal y detergente a la fruta
En la bolsa con la fruta triturada vertemos la solución salina-jabonosa y continuamos el proceso de romper
las frutas.
Paso 4: separación del material sólido, proteínas y lípidos
Pasamos por un colador o papel de filtro para retirar el grueso de la sopa de fruta y luego, a través de la gasa
o algodón, hasta obtener 5 ml del líquido filtrado.
El jugo de fruta salado-jabonoso se cuela y se filtra para quitarle los sólidos, proteínas y lípidos a la solución
acuosa del ADN.
Paso 5: precipitación del ADN por acción del alcohol
Sobre el jugo de fruta, vertemos lentamente por las paredes del tubo de ensayo etanol o isopropanol frío.
Dejamos reposar unos minutos. Debe aparecer una capa blanquecina gelatinosa. Si introducimos una varilla
de vidrio o un palito de madera, con movimientos circulares podremos recuperar el ADN enrollado en la
varilla.
Resultados
✓ Materiales

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✓ Preparación de solución salina-jabonosa

✓ Preparación de la fruta

✓ Adición de la solución de sal y shampoo a la fruta

✓ Separación del material sólido, proteínas y lípidos

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 ✓ Precipitación del ADN por acción del alcohol

Identificación de los conceptos del área de Biología

La actividad comienza con la selección y troceado de una muestra biológica, que puede ser un vegetal
(tomate), un hongo (champiñones), una muestra animal (saliva humana) o
bacteriana. Este paso sirve para recordar que el material hereditario, ADN,
es un atributo común a todos los seres vivos y a algunos agentes acelulares,
como los virus. Además, se puede abordar la localización del material
genético de entre las cuales nos podemos preguntar:
¿Se encuentra en todos los tipos de células?
¿Se encuentra en algún tejido en particular?
¿Todas las células tienen ADN?
Este diálogo permite responder a la pregunta: ¿De dónde se puede extraer ADN? Se puede tratar la estructura
celular, recordando que todas las células están rodeadas por una membrana grasa y, además, en las células de
plantas, hongos y bacterias, por una pared celular rígida. Conocer la composición y características de estas
dos estructuras es imprescindible para comprender y poder iniciar el proceso de extracción. Si las células que
forman la muestra tienen una pared celular dura, es necesario utilizar un método mecánico para romperlas,
como una batidora o un mortero. Mientras que, si solo tienen membrana plasmática, como las células
animales, no es necesario realizar este paso y basta con utilizar detergente y agitar vigorosamente para
disolverlas. Esta característica grasa de las membranas hace que un detergente sea una sustancia adecuada
para disgregarlas. La homogeneidad en la composición química de las membranas no se mantiene en las
paredes celulares, aunque sí su carácter rígido. Así, diferentes organismos presentan distinto componente
principal en sus paredes celulares: quitina los hongos, peptidoglicano o mureína las bacterias y celulosa con
lignina los vegetales.
Otros conceptos biológicos para desarrollar durante la práctica son dos aspectos muy relevantes de la molécula

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de ADN: su localización intracelular y su estructura. El ADN se encuentra localizado principalmente en el
núcleo celular, pero, en los organismos eucariotas, también está en las mitocondrias de animales, plantas y
hongos, y en los cloroplastos de las plantas. Estos tres compartimentos celulares también están delimitados
por membranas grasas, por lo que se pueden disolver utilizando detergente. Respecto a su estructura, el ADN
tiene carga neta negativa debido a que los fosfatos, que forman parte de los nucleótidos que lo componen,
quedan dispuestos hacia el exterior de la doble hélice. Finalmente, otro concepto biológico a comentar es el
de enzima, o proteína que cataliza las reacciones químicas en los sistemas biológicos. La actividad enzimática
es sensible a la temperatura y el pH, entre otros factores, por lo que ambos deben ser tenidos en cuenta en el
proceso de extracción. Para optimizar la extracción de ADN el proceso debe realizarse a baja temperatura, lo
que se consigue empleando agua fría y manteniendo los recipientes utilizados en una bandeja con hielo. La
baja temperatura ralentiza la actividad enzimática, evitando que las moléculas biológicas, como el ADN, sean
degradadas tras la ruptura de las membranas celulares que conlleva la liberación de los componentes
subcelulares.
Identificación de los conceptos del área de Química
Cuando en una molécula son más numerosos los protones que los electrones su carga neta es positiva y se
denomina ion positivo o catión. Sin embargo, cuando el número de electrones es superior al de protones, su
carga neta es negativa y se denomina ion negativo o anión. Por otra parte, las moléculas eléctricamente
neutras, con igual número de protones y electrones, según la distribución de cargas pueden ser polares,
apolares o anfipáticas.
En la disolución de lisis el agua actúa como disolvente, formando una mezcla homogénea, ya que las
moléculas polares que la forman establecen interacciones electrostáticas unas con otras y con todas las
moléculas cargadas o polares.
La disolución de lisis también contiene bicarbonato sódico. Para comprender su papel en el proceso de
extracción de ADN es necesario abordar dos conceptos químicos clave: el concepto de pH y el concepto de
buffer, tampón o amortiguador químico. El pH es la medida de la concentración de protones de una disolución
acuosa, que determina el grado de acidez o alcalinidad de esta

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Identificación de los conceptos del área de Física
Un concepto clave en Física son los de densidad o cantidad de masa en un determinado volumen de
sustancia. Cuando se juntan compuestos inmiscibles de diferentes densidades, los compuestos menos densos
quedan encima de los más densos. Si los compuestos son miscibles, es necesario que no se mezclen al
juntarlos, para que queden separados por densidades. Tener conocimiento de esto permite entender por qué,
al añadir el alcohol en la última fase del proceso de extracción, este queda por encima del caldo molecular,
por el motivo de que el alcohol es menos denso que el agua, por lo que si se añade alcohol con delicadeza
sobre el agua para evitar que se mezclen, el alcohol se mantendrá flotando sobre el agua. Es muy importante
dejar resbalar lentamente el alcohol por la cara interna del recipiente, para que quede en la superficie del agua
y no se mezcle con ella, ya que ambos compuestos son miscibles.
En general, la densidad de una sustancia aumenta a medida que la temperatura disminuye. Así, el alcohol
añadido debe estar frío (a -20 ºC, temperatura de un congelador), ya que al contactar con el agua la enfriará,
haciendo que ésta sea más densa y evitando, por tanto, que se mezclen el alcohol y el agua.
Otro concepto necesario para comprender el fundamento científico de la extracción de ADN es la clasificación
de los fenómenos fisicoquímicos en función de si liberan o absorben energía. Así, aquellos procesos,
generalmente espontáneos, en los que se libera energía en forma de luz o calor se denominan exotérmicos,
como la combustión o la disolución de ácido sulfúrico en agua; mientras que en los procesos endotérmicos el
sistema absorbe energía, como en la fotosíntesis.
Es preciso abordar cómo varía la solubilidad de los gases disueltos en líquidos en relación a la temperatura:
conforme aumenta la temperatura disminuye la solubilidad de éstos. La formación de una red cristalina de sal
y ADN, y su consiguiente precipitación, es un proceso exotérmico. El calor liberado hace que aumente
ligeramente la temperatura, lo que resulta en una disminución de la solubilidad del oxígeno del agua y en la
formación de burbujas. Estas burbujas se observan junto a los filamentos blancos en los que precipitan la sal
y el ADN (en la zona en la que se produce la reacción exotérmica), haciendo que los filamentos de ADN
floten.

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 Conclusiones (la conclusión debe estar relacionada con el objetivo planteado en el Informe de laboratorio)
✓ La trituración de la fruta facilita a que se dé el efecto lisis, ruptura que ayuda a liberar el material genético.
✓ Las moléculas del detergente o shampoo líquido ayudan a romper las membranas celulares y liberar el
ADN del núcleo.
✓ Los componentes no solubles como el material fibroso y las proteínas se separan del ADN por filtración.
✓ El alcohol isopropílico con una concentración al 96% frio, provoca que el ADN se separe del agua y
precipite. El ADN se muestra como unas hebras blanquecinas entre el etanol y la solución acuosa.
✓ El cloruro de sodio o sal de cocina ayuda a separar algunas de las proteínas que están unidas al ADN.
También mantiene las proteínas disueltas en la capa acuosa de forma a impedir que estas precipiten
también con el alcohol, junto con el ADN
Recomendaciones
Para obtener una buena extracción casera de ADN, se tendría que trabajar con las proporciones
establecidas.
✓ Trabajar en un lugar limpio, para así no llenar de impurezas nuestra muestra.
✓ En caso de no contar con los materiales de laboratorio en casa, se puede adaptar con los que
contamos en casa
Bibliografía
• Bettelheim, F. A., & Landesberg, J. M. (2012). Isolation and Identification of DNA from Onion, pág. 515. Laboratory
experiments for introduction to general, organic and biochemistry. Cengage Learning.
• Marcos-Merino, J. M., Gallego, R. E., de Alda, O., & Gómez, J. (2019). Extracción de ADN con material cotidiano:
desarrollo de una estrategia interdisciplinar a partir de sus fundamentos científicos. Educación química, 30(1), 58-69.