ADN Ligasas

Las ADN ligasas catalizan la formación de enlaces fosfodiéster entre el fosfato 5 'yuxtapuesto y un
terminal 3'-hidroxilo en el ADN dúplex. Esta actividad puede reparar mellas monocatenarias en ADN
dúplex (Fig. 3.14.1) y unir fragmentos de restricción de ADN dúplex que tienen extremos romos (Fig.
3.14.2) o extremos cohesivos homólogos (Fig. 3.14.3). Se utilizan dos ligasas para investigación de
ácido nucleico — E. ligasa de coli y ligasa de T4. Estas enzimas difieren en dos propiedades
importantes. Una es la fuente de energía: la ligasa T4 usa ATP, mientras que la ligasa de E. coli usa
NAD. Otra diferencia importante es su capacidad para ligar extremos romos; En condiciones de
reacción normales, solo la ligasa de ADN T4 unirá los extremos romos.

LIGASA DE ADN DE T4

La ADN ligasa de T4, el producto del gen 30 del fago T4, se purificó originalmente de las células de
E. coli infectadas con el fago. El gen 30 del fago T4 ha sido clonado, y la enzima ahora se prepara a
partir de cepas que producen en exceso. Usando ATP como cofactor, la ADN ligasa de T4 cataliza la
reparación de mellas monocatenarias en el ADN dúplex y se une a los fragmentos de restricción de
ADN dúplex que tienen extremos romos o cohesivos. Es la única ligasa que se une eficientemente a
los extremos sin punta en condiciones normales de reacción. Parece que la actividad de la ligasa de
ADN de T4 puede ser estimulada por la ligasa de ARN de T4 (UNIDAD 3.15). Vea la UNIDAD 3.16 para
un protocolo de ligadura detallado.

Reaction Conditions

For 50- l reaction:

40 mM Tris⋅Cl, pH 7.5
10 mM MgCl2
10 mM DTT
1 µg DNA
0.5 mM ATP
50 µg/ml BSA
1 “Weiss” U T4 DNA ligase

Incubar a 12 ° a 30 ° C durante 1 a 16 h. Detenga la reacción agregando 2 µl de 0.5 M EDTA o

calentando a 75 ° C durante 10 min. El volumen de reacción, la concentración de ADN y la
temperatura y el tiempo de reacción variarán, dependiendo de la aplicación individual. Una unidad
Weiss es equivalente a 60 unidades de extremo cohesivo.

La ligadura de los extremos cohesivos generalmente se realiza a 12 ° a 15 ° C para mantener un buen

equilibrio entre el recocido de los extremos y la actividad de la enzima. Las temperaturas más altas
dificultan el recocido de los extremos, mientras que las temperaturas más bajas disminuyen la
actividad de la ligasa. Las ligaduras de extremo romo se realizan típicamente a temperatura
ambiente ya que el recocido no es un factor (la enzima no es particularmente estable por encima
de 30 ° C). Las ligaduras de extremo romo requieren aproximadamente 10 a 100 veces más enzima
que las ligaduras de extremo cohesivo para lograr una eficiencia igual. La ADN ligasa de T4 no es
inhibida por el ARNt, pero está fuertemente inhibida por las concentraciones de NaCl> 150 mM. Se
ha demostrado que las moléculas de exclusión macromolecular (p. Ej., PEG 8000) aumentan en gran
medida la tasa de unión tanto del extremo cohesivo como del extremo romo por la ADN ligasa de
T4 (Pfeiffer y Zimmerman, 1983). Una consecuencia inherente del hacinamiento macromolecular es
que todas las ligaduras son intermoleculares; por lo tanto, esta técnica no es adecuada para la
ligadura y circularización de insertos y vectores que se requieren para la mayoría de los
experimentos de clonación.

Aplicaciones

La ADN ligasa T4 es, con mucho, la ADN ligasa más utilizada. Se puede usar para prácticamente
cualquier aplicación que requiera una ADN ligasa. Es importante destacar que liga eficientemente
los extremos de extremos romos, una reacción que otras ligasas no llevan a cabo en ausencia de
moléculas de exclusión macromolecular.
ENZIMA ESCHERICHIA COLI DNA LIGASE

La ADN ligasa de E. coli es el producto del gen lig. El gen lig ha sido clonado, y la enzima se obtiene
de una cepa superproductora. La ADN ligasa de E. coli cataliza la reparación de mellas
monocatenarias en ADN dúplex y se une a fragmentos de restricción que tienen extremos cohesivos
homólogos. La ADN ligasa de E. coli no une los extremos con extremos romos en condiciones de
reacción normales. A diferencia de las otras ligasas, utiliza NAD como cofactor.

Reaction Conditions
For 50- l reaction:
40 mM Tris⋅Cl, pH 8
10 mM MgCl2
5 mM DTT
1 µg DNA
0.1 mM NAD
50 µg/ml BSA
10 “Modrich-Lehman” U E. coli DNA ligase

Incubar a 10 ° a 25 ° C durante 2 a 16 h. Detenga la reacción agregando 2 µl de 0.5 M EDTA o

calentando a 75 ° C durante 10 min. El volumen de reacción, la concentración de ADN y la
temperatura y el tiempo de reacción variarán, dependiendo de la aplicación individual. La ADN ligasa
de E. coli, en contraste con la ADN ligasa T4, no requiere agentes reductores (por ejemplo, DTT) en
la reacción. El PEG 8000 aumenta en gran medida la velocidad de unión cohesiva del extremo por la
ADN ligasa de E. coli (Harrison y Zimmerman, 1983). Curiosamente, la presencia de moléculas de
exclusión macromolecular también permite que la ADN ligasa de E. coli se una de manera eficiente
a los extremos de extremos romos, una reacción que no puede llevar a cabo en su ausencia. Las
unidades Modrich-Lehman miden la capacidad de formar círculos poli d (A-T). Una unidad
ModrichLehman es equivalente a 6 unidades Weiss (Modrich y Lehman, 1975).

Aplicaciones
La ADN ligasa de E. coli se puede usar como alternativa a la ADN ligasa T4 cuando no se requieren
ligaduras de extremo romo. La transformación usando ADN ligado con ADN ligasa de E. coli tiene un
fondo más bajo que resulta de las ligaduras aberrantes en comparación con la ADN ligasa T4, ya que
la ADN ligasa T4 tiene una especificidad mucho menor para la estructura de los términos.