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Análisis de topología de ADN en el laboratorio de bioquímica de pregrado

Un punto común de dificultad para muchos estudiantes en una clase introductoria de bioquímica es el
concepto de topología de ADN y las relaciones entre los topoisómeros de ADN. Sin embargo, es un
concepto importante, ya que la carga y topología adecuadas del ADN es crítica para muchos procesos
intracelulares, como la replicación, la transcripción, la recombinación y la reparación. Y, sin embargo,
incluso la topología relativamente simple del ADN circular superenrollado a menudo resulta confusa. Esta
Revista ha publicado artículos sobre ADN y su significado biológico, que brindan antecedentes excelentes
sobre el tema. Encuentro que los experimentos de laboratorio descritos aquí, que utilizo en mi clase
introductoria de bioquímica de nivel preuniversitario, mejoran en gran medida la comprensión de los
estudiantes. Un estudiante graduado que estudia la estructura del ADN también se beneficiaría.

Es bien sabido que el grado de arrollamiento helicoidal y la topología general del ADN están íntima e
inextricablemente relacionadas (1-3). El ADN fabricado en las células generalmente se enrolla. Las razones
para esto son varias, pero incluyen los efectos de empaquetamiento así como las ventajas energéticas
durante la replicación y la transcripción del ADN. El desenrollamiento se manifiesta principalmente a través
del superenrrollamiento, en donde el ADN gira sobre sí mismo (o alrededor de proteínas tales como las
histonas). Tal enrollamiento superhelicoidal permite que el ADN mantenga un giro helicoidal normal de
aproximadamente 10 pares de bases por vuelta. Los ADN circulares pequeños de origen
extracromosómico, como los plásmidos, también están infrarojados (2) y proporcionan un sistema
relativamente simple para el estudio. Al describir la topología del ADN plásmido, el concepto clave es que la
suma del número de vueltas dúplex (β) más el número de vueltas superhelicoidales (τ) (el número de veces
que el eje dúplex se ajusta al eje superhelicoidal) debe permanecer constante mientras ya que ambas
hebras de ADN permanecen intactas. Esta condición a menudo se expresa a través de la ecuación 1,
donde el parámetro constante α se denomina número de enlace

α=β+τ

Para el ADN que está infrarojado, τ será negativo. El círculo de ADN superenrollado y negativamente
enrollado se encuentra en un estado de estrés por torsión, y cualquier proceso que alivie este estrés es
termodinámicamente favorable. Hay dos formas obvias de eliminar estos supercoils y aliviar el estrés de
torsión. El primero es dividir uno o ambos filamentos de ADN. Si solo se escinde un filamento, se dice que
el ADN está mellado. El ADN mellado sigue siendo circular, porque una hebra permanece intacta. Si ambas
cadenas se escinden directamente opuestas entre sí, se dice que el ADN se corta y se genera un ADN
lineal. Cuando el ADN se corta o se corta, la restricción topológica en la ecuación 1 se alivia. Muchos
agentes químicos son capaces de promover dicha química. Los ejemplos incluyen Fe (II) -EDTA (4) y Cu (I)
-o-fenantrolina (5), que se usan en estudios de mapeo de ADN, quimioterapéuticos como la bleomicina (6)
y los antibióticos ene-diy como se ejemplifica en la caliqueamicina. (7) Además, un grupo de enzimas
conocidas como topoisomerasas puede aliviar el estrés de torsión al eliminar supercoils uno o dos a la vez,
generando así un ADN circular relajado covalentemente cerrado. Estas enzimas funcionan mediante la
introducción de una muesca transitoria o corte en el ADN, pasando una o dos cadenas a través del corte /
corte, y luego volver a sellar el ADN (8). La segunda forma de eliminar supercoils del ADN circular es
permitir que se una a un agente desenrollador. El agente desenrollador de ADN prototípico es el catión de
etidio, un derivado de fenantridina heteroaromático que se une por intercalación. El agente
quimioterapéutico (SP-4-2)-diaminodicloroplatino(II) (cisplatino), que se une covalentemente al DNA
principalmente a través de las posiciones N-7 de las guaninas adyacentes, también se sabe que desenrolla
el DNA (9). Como el ADN no se corta o corta durante este proceso, las restricciones topológicas
permanecen, y el desenrollamiento helicoidal se compensa mediante la eliminación de supercoils negativos
Que el desenrollamiento del ADN eliminará supercoils negativos se puede entender fácilmente a partir de la
ecuación 1. Desenrollar la doble hélice dará como resultado una disminución en la torsión helicoidal (β).
Como α debe permanecer constante, τ debe aumentar; y debido a que τ es un número negativo, un
aumento hace que su valor tienda hacia cero, lo que indica la eliminación de los supercoils (negativos). La
electroforesis en gel de agarosa es un método simple para evaluar el estado topológico del ADN circular.
Cuanto más superenrollada esté la molécula circular de ADN, más compacta será su estructura y más
rápido migrará en el gel, haciendo que las diversas formas topológicas se puedan resolver fácilmente. Por
lo tanto, la electroforesis proporciona una herramienta ideal para estudiar los efectos topológicos del
desenrollado y la escisión del ADN. Para ayudar a los estudiantes a comprender mejor la topología del
ADN circular, he desarrollado una serie de experimentos que utilizan la electroforesis en gel de agarosa
para estudiar los fenómenos mencionados anteriormente. El primer experimento usa un complejo de cobre-
o-fenantrolina para cortar el ADN e inducir transiciones entre las tres formas topológicas extremas. El
segundo experimento usa cisplatino para desenrollar el ADN y causar una transición gradual de una
molécula superenrollada a una sin supercoils. El tercer experimento utiliza la enzima topoisomerasa I para
generar un conjunto de topoisómeros a partir de un sustrato de ADN superenrollado. Los tres se presentan
aquí como un conjunto porque he encontrado que, cuando se consideran en conjunto, son más instructivos
para los estudiantes que cuando se consideran individualmente. Cada uno, sin embargo, puede servir
como un experimento independiente para ilustrar un punto específico.

Resumen de materiales y métodos

Materiales

Cualquier ADN circular superenrollado es adecuado para este experimento. Normalmente usamos ADN de
φX174 RF, ya que se puede comprar de forma relativamente económica. La topoisomerasa I es el reactivo
más caro, con un costo de alrededor de $ 100 por 200 unidades, una cantidad que es suficiente para 20 o
más experimentos. El cis-Diamminedichloroplatinum (cis-DDP o cisplatino) se puede comprar a un costo de
alrededor de $ 60 por 250 mg, una cantidad que es suficiente por varios años. Todos los demás reactivos y
tampones se encuentran comúnmente en los departamentos de química o biología. Detalles y recetas
adicionales se proporcionan en línea.MétodosW Escisión de ADN usando Cu- (OP) 2. Cu- (OP) 2 a
concentraciones que varían de 0 a 10 μM se deja reaccionar con cantidades de 0,2 μg de ADN de φX174
RF. Las reacciones (10 \ mu l de volumen total) se llevan a cabo en tampón de fosfato 5 mM, pH 7,4, en
presencia de peróxido de hidrógeno 1,0 mM y DTT 1,0 mM. Las reacciones se dejan avanzar durante 15-30
minutos a diversas temperaturas, luego se analizan mediante electroforesis en gel de agarosa. Reacción de
ADN con cisplatino. Se permite que una cantidad de 0.3 μg de ADN de φX174 RF reaccione con cis-
diamminedinitratoplatinum (preparado por adelantado por el instructor de cis-DDP y nitrato de plata) a
relaciones de Pt-nucleótido (a menudo denominadas rf) que oscilan entre 0.02 y 0.80. Las reacciones se
llevan a cabo en 15 μL de tampón TE durante 2 a 3 horas a 37ºC, luego se inactivan mediante la adición de
NaCl a una concentración de 0, 1 M. Los resultados se analizan mediante electroforesis en gel de agarosa
al 1% (sin etidio). Reacción del ADN con topoisomerasa I. El procedimiento es esencialmente el descrito
por Keller (10). Se incuba una porción de 1,0 μg de ADN con 10 U de topoisomerasa I a 0ºC durante 1-5
min en tampón TNE, pH 7,9. La reacción se interrumpe mediante la adición de SDS al 1%, luego se analiza
mediante electroforesis en gel de agarosa al 1,4% a 30-40 V durante la noche. Este experimento puede
llevarse a cabo simultáneamente con el experimento de cisplatino y analizarse en el mismo gel.

Deben destacarse especialmente dos reactivos peligrosos utilizados en estos experimentos. El bromuro de
etidio es un mutágeno potente, típicamente vendido como un polvo fino. Por lo tanto, se sugiere que el
instructor o asistente de enseñanza prepare la solución de 10 mg / ml para los estudiantes con anticipación,
mientras usan guantes y máscara. Los estudiantes deben usar guantes mientras manejan la solución, y se
debe tener especial cuidado para limpiar todos los derrames de inmediato y minuciosamente. El etidio
usado debe reaccionar con lejía antes de desecharlo. El cisplatino también es mutágeno y carcinógeno, y
se deben usar guantes al usarlo.

Resultados y Discusión

Los resultados típicos para estos experimentos se muestran en las Figuras 1 a 3. En el experimento de
escisión de ADN mediado por OP-Cu (Figura 1), la conversión de ADN superenrollado (forma I) a melón
relajado (forma II) está indicado por cambio recíproco en las intensidades relativas de estas dos bandas en
función de la concentración de Cu- (OP) 2. La aparición de ADN lineal (forma III, migra entre las formas
superenrrolladas y cortadas) a menudo se puede observar a temperaturas y concentraciones más altas. El
ADN lineal se forma porque, a medida que aumenta el número de muescas, aumenta la probabilidad de
que se produzcan dos muescas formadas de forma independiente, directamente opuestas entre sí. La
formación de dos tales mellas es el equivalente funcional de un corte de doble cadena. El ADN de Forma III
comienza a aparecer en los carriles 4 y 9. El carril 5 indica una pérdida casi completa del ADN cortado, así
como un poco de "manchado" debajo de la banda de la forma III, que es el resultado de una posterior
degradación no específica del ADN que genera fragmentos más pequeños. En el carril 10 (concentración y
temperatura de cobre más altas), el ADN se ha degradado hasta tal punto que apenas es visible en el gel.
La unión de cisplatino a ADN (figura 2) altera la velocidad de migración del plásmido superenrollado como
resultado del desenrollamiento del ADN, que elimina supercoils (véase más arriba).
Figura 1. Reacción de ADN circular cerrado covalentemente con cobre-o-
fenantrolina. Todas las mezclas de reacción contenían 0,2 μg de ADN y peróxido
de hidrógeno 1 mM y ditiotreitol. Las reacciones en las pistas 1-5 se llevaron a
cabo a temperatura ambiente; los de las calles 6-10 se llevaron a cabo a 37 ° C.
Carriles 1 y 6, control de ADN; carriles 2 y 7, Cu 0,25 μM (OP) 2; carriles 3 y 8,
Cu 1,0 μM (OP) 2; carriles 4 y 9, Cu 2,5 μM (OP) 2; carriles 5 y 10, Cu 10,0 μM
(OP) 2.

Figura 2. Reacción de ADN circular cerrado covalentemente con concentraciones crecientes de


cisplatino. Las relaciones formales de Pt-nucleótido son la línea 1, 0; carril 2, 0.02; carril 3, 0.05;
carril 4, 0.08; carril 5, 0,10; carril 6, 0,13; carril 7, 0,17; carril 8, 0,20; carril 9, 0.25; carril 10, 0,30;
carril 11, 0,40; carril 12, 0,50; carril 13, 0,60; carril 14, 0.80

Figura 3. Reacción del ADN circular superenrollado con topoisomerasa I. Todas las reacciones se llevaron a cabo a 0ºC
usando 1,0 μg de ADN. Carril 1, control de ADN; carril 2, ADN + 10 U topoisomerasa I, 1 min; carril 3, ADN + 10 U
topoisomerasa I, 5 min.

A medida que aumenta la cantidad de platino unido, las tasas de migración disminuyen gradualmente,
hasta el punto en que se eliminaron todos los supercoils negativos. Esto se denomina punto de
coalescencia, como ocurre cuando la banda superenrollada comigra con la banda mellada que está
invariablemente presente en las muestras de ADN plasmídico. Más allá de este punto, el desenrollamiento
continuo genera supercoils positivos y la movilidad del ADN superenrollado aumenta nuevamente. Esto
comienza a ocurrir en el carril 14 de la Figura 2. Es importante enfatizar que en este experimento, el
número de enlace permanece sin cambios; son las cantidades relativas de arrollamiento helicoidal y
superhelicoidal las que están siendo alteradas por la droga. Si se desea una investigación adicional, se
puede determinar la relación de platino-nucleótido unido (rb) en el punto de coalescencia, y estos datos
pueden usarse, junto con el ángulo de desenrollado conocido para cisplatino de 13 ° (9), para estimar la
densidad superhelical y el número de enlace del plásmido. Los detalles se proporcionan con la información
suplementaria que se encuentra en línea.W La escala de los topoisómeros generados por la topoisomerasa
I es muy ilustrativa (figura 3). La ADN topoisomerasa I introduce un corte transitorio en el ADN formando un
complejo de ADN-enzima covalente. El hilo intacto se deja pasar a través de este corte y el corte se vuelve
a sellar. La enzima repetirá este proceso sucesivamente hasta que el ADN esté completamente relajado.
Las condiciones de reacción que implican tiempos de reacción cortos y bajas temperaturas dan como
resultado una mezcla de topoisómeros que se resuelven fácilmente. En un experimento cuidadosamente
ejecutado, el número de supercoils se puede estimar mediante bandas de conteo. El concepto crítico en
este experimento es que para cada ciclo de mellado y sellado mediado por topoisomerasa, el número de
enlace cambia en uno. Esto es fundamentalmente diferente del experimento de cisplatino, donde los
supercoils se eliminan mediante el desenrollado de la hélice manteniendo constante el número de enlace.
Ventajas y beneficios de los experimentos Creo que este conjunto de experimentos, cuando se los
considera en su conjunto, es útil para los estudiantes en varios aspectos. Los estudiantes pueden
comprender mejor el concepto de topología de ADN. El experimento de escisión de ADN mediado por
cobre demuestra las formas topológicas extremas del ADN circular. Está claro a partir de los geles que la
transformación de una forma a otra ocurre en un solo paso tras la escisión del filamento de ADN, y las
consecuencias de aliviar el estrés torsional son evidentes. A este ejercicio le siguen los experimentos de
platino y topoisomerasa, que permiten a los estudiantes ver el efecto de eliminar supercoils gradualmente
dentro de un conjunto de restricciones topológicas. La eliminación de Supercoil por cada uno de estos tres
métodos es fundamentalmente diferente. Como resultado de ver estos efectos experimentalmente y
subsecuentemente se les pidió que los explicaran en el informe del laboratorio, el estudiante finaliza este
laboratorio con una comprensión razonablemente buena de los fenómenos topológicos y las
interrelaciones, así como algunos de los factores que pueden afectarlos. Los tres experimentos están
relacionados fácilmente con aplicaciones de química médica. El mecanismo de escisión del ADN por Cu-
(OP) 2, que se inicia por la abstracción del átomo de hidrógeno del anillo de ribosa, imita la química de
varios fármacos antitumorales, como la bleomicina o los antibióticos ene-diino. (De hecho, el experimento
Cu- (OP) 2 descrito aquí se puede llevar a cabo con bleomicina, aunque a mayor costo). El cisplatino se
usa actualmente en muchos regímenes quimioterapéuticos. Una interesante elaboración de este
experimento, que he hecho en el pasado, es comparar el desenrollamiento del ADN causado por el
cisplatino con el del isómero trans inactivo, que se desenrolla en un grado significativamente menor (11).
Además, debido a sus funciones integrales en la replicación y transcripción del ADN, las topoisomerasas
son objetivos perseguidos activamente para el diseño racional de fármacos. De hecho, varios agentes
quimioterapéuticos usados actualmente, tales como adriamicina y topotecán, se dirigen a la topoisomerasa
o a su complejo de ADN. El tema del daño en el ADN se puede introducir de forma conveniente a través de
estos experimentos, lo que conduce naturalmente a temas relacionados como la mutagénesis, la
carcinogénesis química y la reparación del ADN. El tema de la reparación del ADN es de intenso interés
actual y, de hecho, se ha trabajado mucho en la reparación de los aductos de cisplatino-ADN. Siempre es
un tema de gran interés para mis alumnos. Finalmente, a los estudiantes se les enseña la técnica
bioquímica común de análisis de ADN mediante electroforesis en gel de agarosa a través de un interesante
conjunto de aplicaciones.