Está en la página 1de 7

A.

Buffer de carga: el buffer de carga contiene colorantes que sirven


para visualizar la migración de ADN durante el proceso de
electroforesis.
Otros que sirven como marcador

Tris
Es el nombre común de tris(hidroximetil) aminometano. Se trata de
un compuesto muy utilizado en el laboratorio para preparar
disoluciones tampón; el grupo ácido-base que ejerce el tamponamiento
es el amino. Se comercializa en sus formas básica ("Tris base") y ácida
("Tris hidrocloruro"), aunque la primera es la de uso más común.

SDS
El dodecilsulfato sódico (Sodium Dodecyl Sulphate, SDS,
laurilsulfato sódico) es un detergente aniónico que se une a las
proteínas, desnaturalizándolas en una conformación extendida
recubierta de moléculas de SDS. Como consecuencia, el tamaño de la
molécula de proteína es directamente proporcional a su longitud en
aminoácidos y su carga queda enmascarada por la mayor carga del
SDS que la recubre, que es también proporcional a la longitud. Por lo
tanto, la movilidad electroforética de la proteína
depende exclusivamente de su masa molecular.

Glicerol
El glicerol (glicerina) se utiliza como agente denso en la
composición del tampón de carga.
La muestra + tampón de carga se deposita al fondo del pocillo y no
difunde por el tampón que llena la cubeta y cubre el gel. De ese modo
no se pierde y se mantiene concentrada.

β-mercaptoetanol
Este compuesto (β-mercaptoetanol, 2-mercaptoetanol, 2-hidroxi-
1-etanotiol, 2-sulfaniletan-1-ol) actúa como agente reductor de
enlaces disulfuro. Facilita así la desnturalización completa y el
desplegado de las moléculas de proteína. Además, se separarán las
subunidades de la proteína si es que los disulfuro las mantenían
unidas.

Tampón Tris-HCl
Un tampón denominado "Tris-HCl" se prepara con Tris base a la
concentración indicada y con el HCl necesario para ajustar el pH al
valor indicado. La disolución, por tanto, contiene Tris base, Tris ácido
y cloruro.
En la electroforesis, es el tampón que mantiene el pH en el gel.

Tampón Tris-Gly
Un tampón "Tris-glicina" se prepara con Tris base y con glicina,
ambos a la concentración indicada. El pH debe resultar el adecuado
sin necesidad de ajustarlo (pues este tampón no debe llevar cloruro).
Una composición frecuente es 125 mM Gly, 25 mM Tris, pH=8,3. En
el caso de electroforesis desnaturalizante lleva además 0,1% de SDS.
En la electroforesis PAGE discontinua, es el tampón con el que se
llena la cubeta o tanque de electroforesis.

Tampón TAE
Es el medio usado para preparar el gel y desarrollar la
electroforesis. Recibe este nombre de las iniciales de sus
componentes.
El pH es alcalino, para que todos los grupos fosfato del DNA estén
ionizados por completo y éste se mantenga cargado negativamente.
La composición habitual es Tris 40 mM, ác. acético 19 mM, EDTA 1
mM, pH=7,5
En la electroforesis, permite mantener las moléculas de DNA con
una carga negativa uniforme y constante. Es, por ello, componente
del gel y del tampón de electroforesis, o tampón de cubeta.
Tampón de carga
Es una disolución que se mezcla con la muestra antes de aplicarla
al gel. Sus componentes cumplen varios propósitos:
En electroforesis de DNA:
 Glicerol para aportar densidad a la muestra y facilitar su
aplicación a los pocillos.
 Azul de bromofenol (u otro colorante como el xileno-cianol)
como marcador del frente de avance de la electroforesis.
Asimismo, su color es una ayuda visual durante la carga de
muestra en los pocillos.
 Tampón para estabilizar el pH y, por tanto, la carga de las
moléculas.
En electroforesis de proteínas SDS-PAGE se denomina
también tampón de ruptura (ya que provoca la desnaturalización):
 Glicerol para aportar densidad a la muestra y facilitar su
aplicación a los pocillos.
 Azul de bromofenol como marcador del frente de avance de
la electroforesis. Asimismo, su color es una ayuda visual
durante la carga de muestra en los pocillos.
 SDS para provocar la desnaturalización de las proteínas
(ayudado por un calentamiento breve a 90-100° C).
 β-mercaptoetanol para romper los enlaces disulfuro (una
reacción de reducción, el disulfuro se convierte en dos tioles).
 Tampón para estabilizar el pH y, por tanto, la carga de las
moléculas.

Agarosa
Se trata de un polisacárido sintetizado por algunas algas, que forma
parte del agar-agar (ingrediente de medios de cultivo). Para su uso
en electroforesis se emplea un producto más purificado. Tiene la
propiedad de disolverse en caliente (50-60°C) y solidificar cuando se
enfría, formando un gel de alta porosidad. Más detalles sobre su
estructura.
En la electroforesis, forma la matriz del gel y provoca el retardo
dependiente del tamaño que marca la separación.

Poliacrilamida
La poliacrilamida es un polímero entrecruzado que forma geles
porosos. Se realiza una polimerización química de una mezcla de
acrilamida y bisacrilamida [ N,N’-metileno-bis(acrilamida) ]. La
acrilamida forma polímeros lineales pero la bisacrilamida introduce
uniones cruzadas entre las cadenas de poliacrilamida, generando la
malla, matriz o red tridimensional del gel. Regulando la
concentración de ambos tipos de monómero y su proporción se
consiguen distintas porosidades.
En la electroforesis, forma la matriz del gel y provoca el retardo
dependiente del tamaño que marca la separación.

Azul de Coomassie
El nombre completo es azul brillante de Coomassie R-250. Se trata
de un compuesto coloreado que se une a todo tipo de proteínas. Es
poco soluble en agua, por lo que habitualmente se disuelve en una
mezcla de agua, ácido acético y metanol o isopropanol.
Tras realizar la electroforesis, el gel se "tiñe" sumergiéndolo
durante unos 30 minutos en la disolución de Coomassie para que éste
penetre y se fije a las proteínas. Dado que todo el gel se impregna del
colorante, es preciso después realizar una destinción, lavando varias
veces con disolvente libre del colorante.

Azul de bromofenol
Se trata de un compuesto coloreado y con carga, utilizado para
comprobar el progreso de la electroforesis. Más detalles.
En la electroforesis, por su menor tamaño, se mueve más rápido
que las proteínas o que la mayoría de moléculas de DNA (aquéllas
superiores a 300 pb), es decir, marca el "frente de avance". Puesto
que su color azul-violeta es bien visible, permite detener la
electroforesis con la confianza de que las moléculas de proteína o
DNA no se hayan salido del gel.
B. La electroforesis en gel es una técnica utilizada para separar
fragmentos de ADN (u otras macromoléculas, como ARN y
proteínas) por su tamaño y carga. La electroforesis consiste en
aplicar una corriente a través de un gel que contiene las
moléculas de interés. Con base en su tamaño y carga, las
moléculas se desplazarán por el gel en diferentes direcciones o a
distintas velocidades, con lo que se separan unas de otras.

C. Tipos de electroforesis

D. Tipos de marcadores
a. RAPD (DNA polimórfico amplificado al azar): Es una de las técnicas
más versátiles desde que se desarrolló en el año 1990. Se usa una
colección de decanucleótidos para amplificar por PCR áreas
específicas distribuídas al azar por el genoma. Los
marcadores RAPD, pronunciado rapids, (Random amplified
polymorphic DNA) son un sistema de detección de polimorfismos en
la secuencia de ADN, basado en la reacción en cadena de la
polimerasa (PCR)1.

b. Los AFLP consisten en la digestión completa del ADN genómico total


con enzimas de restricción, seguida de la amplificación selectiva de
los fragmentos obtenidos para detectar polimorfismos debidos a
mutaciones en la secuencia de ADN en, o cerca de, los sitios de
restricción.

c. CAPS (Secuencia polimórfica amplificada y cortada), descrita en


1993. Los fragmentos amplificados se someten a una restricción
enzimática y se migra en un gel de agarosa. Las variaciones se
detectan por presencia o ausencia de sitios de restricción. Se
pueden así localizar cambios finos en una zona específica.

d. SCAR (Regiones amplificadas caracterizadas y secuenciadas),


descrita en 1993. Esta técnica aprovecha que las RAPD
proporcionan principalmente fragmentos de DNA altamente
repetido. Estos fragmentos de RAPD se clonan y secuencian para
elaborar oligonucleótidos específicos. Aunque permite el desarrollo
rápido de marcadores moleculares, el grado de polimorfismo
obtenido es bastante bajo.

e. D/TGGE (Geles de electroforesis en gradiente


desnaturalizante/térmico), descrita en 1987. Analiza el
polimorfismo a través de la estabilidad, a distintas condiciones
Desnaturalizantes o Temperaturas, del DNA amplificado. Su
principal problema reside en las dificultades técnicas para
manetener estables las condiciones experimentales.

f. Voltaje sugerido para electroforesis:

El voltaje que se aplica en los geles de agarosa depende de la


resolución requerida y del tamaño de fragmentos a separar. Entre
1-10v/cm (los centímetros entre los electrodos), la movilidad
electroforética de los fragmentos lineales de dsDNA es proporcional
al voltaje aplicado; sin embargo, si se tienen fragmentos grandes
cambian su movilidad electroforética sin que esta guarde relación
con su tamaño.
En general la separación de grandes fragmentos de DNA es mejor a
bajos voltajes aunque esto incrementa el tiempo de electroforesis
sin embargo produce bandas estrechas y bastantes bien resueltas
cuando se trata de fragmentos pequeños.

g. Que otro intercálante se utiliza para reemplazar el bromuro de


etidio?
Se utiliza el GEL RED
Ventaja: no genera alteraciones en la salud de las personas que lo
manipulan.
 Reduce la contaminación en el laboratorio y consecuencias en el
ambiente
 Es incapaz de atravesar estructuras celulares lo que permite la
reducción de genotoxicicdad mientras que el bromuro de etidio se
intercala en el ADN y penetra la célula
 Es muy estable a temperatura ambiente
 Resistente a altas temperaturas

También podría gustarte