Reporte de práctica No.

7
Determinación de Salmonella spp.

Brenda Briseño Fuentes

Fátima Montiel Torres
Andrea Morales Guzmán

Universidad Iberoamericana Puebla

Departamento de Ciencias de la Salud

Nutrición y Ciencia de los Alimentos

Maestra: Martha Eugenia Martínez Lifshitz

03 de noviembre de 2021.

Laboratorio de Análisis de los Alimentos

Otoño 2021
REPORTE 7
Objetivo

Aplicar adecuadamente la técnica descrita en la NOM-114-SSA1-1994 para la determinación de

Salmonella en alimentos.

Hipótesis

Se hallará Salmonella spp. de la muestra de suelo que se analizó.

Marco teórico

La Salmonella es un grupo bacteriano, constituido por bacilos Gram negativos, anaerobios facultativos,
que son pertenecientes a la familia Enterobacteriaceae, los cuales son móviles debido a la presencia de
flagelos perítricos. Su estructura antigénica tiene dos clases de antígenos principales presentes:
antígenos O (somáticos) y antígenos H (flagelares). En algunas cepas se encuentra un tercer tipo como
antígeno de superficie, siendo análogo funcionalmente a los antígenos K de otros géneros; ya que
anteriormente se pensó, que se relacionaba con la virulencia; este antígeno se denominó antígeno VI y
se presenta únicamente en los serotipos Typhi, Paratyphi y Dublin (Parra et al., 2002).

Imagen 7.1 Estructura antigénica de la Salmonella.

La Salmonella entérica provoca salmonelosis, la cual es ocasionada por la ingestión de carne

infectada, pollo, leche cruda, huevos, productos que contienen huevo, repollo y otros alimentos de los
que se sospeche. Otra fuente común de esta enfermedad son las mascotas reptiles infectadas e inclusive
el agua para beber contaminada; mientras que uno de los tipos de bacteria Salmonella de los miles
existentes ocasiona fiebre tifoidea, la mayoría de ellos ocasionan fiebre, calambres abdominales y
diarrea (Quirós, 2016).

Los agentes etiológicos de la fiebre tifoidea: serotipos Salmonella typhi y Salmonella paratyphi
A, B y C, tienen como único hospedero al ser humano. Generalmente, la transmisión se da a través de
los alimentos, así como, el agua que ha sido objeto de contaminación fecal por enfermos o portadores
crónicos asintomáticos. En el caso de la fiebre entérica, una vez que se da la infección inicial a nivel
gastrointestinal, la Salmonella penetra la mucosa intestinal y provoca una invasión de sistema
mononuclear generando una enteritis que por lo general es asintomática (Parra et al., 2002).

Así mismo, cualquier especie de Salmonella es fuerte y tiene una gran capacidad de adaptarse a
cualquier condición ambiental que se le presente, de tal forma que, pueden crecer a temperaturas
elevadas, es decir, alrededor de 54°C, y tiene propiedades que le permiten crecer en alimentos con
temperaturas de hasta 2° y 4°, lo que podría demostrar la supervivencia de estás en productos
alimentarios que se encuentran a temperaturas bajas. Además, se ha mostrado que varios factores
afectan la supervivencia de la Salmonella, como la composición de la matriz de congelación y la cinética
del proceso de congelación, sin embargo, este grupo de bacterias tiene una resistencia térmica que
aumenta a medida que disminuye la actividad del agua del alimento calentado, razón por la cual a
temperaturas altas y en un ambiente seco, pueden conservarse (Doyle et àl., 1993).

Por otro lado, esta bacteria también tienen la capacidad de crecer en ambientes con valores de
pH entre 4.5 y 9.5, pero de manera óptima, tienen un crecimiento en un pH de 6.5 a 7.5, aunque
depende de la especie de enterobacteria; usualmente, la acidificación puede proporcionar un ambiente
favorable para el crecimiento de salmonellas durante el proceso de fermentación, incluso puede tener
una tolerancia al ácido (ATR), que se traduce en la síntesis de 43 proteínas de choque ácido, reducción
de tasa de crecimiento y homeostasis del pH, siendo más peligroso para el consumo humano (Doyle et
àl., 1993).

Por lo tanto, identificar o monitorear la presencia de Salmonella en alimentos es de gran

relevancia. De acuerdo a la NOM-114-SSA1-1994, la determinación de Salmonella spp en alimentos, se
da en un esquema de 5 pasos (Imagen 7.2):

 Preenriquecimiento: La muestra es enriquecida en un medio nutritivo no selectivo, que permite

restaurar las células de Salmonella dañadas a una condición fisiológica estable.
  Enriquecimiento selectivo: Ayuda a incrementar las poblaciones de Salmonella e inhibir otros
organismos presentes en la muestra.
 Selección en medios sólidos: Uso de medios selectivos que restringen el crecimiento de otros
géneros diferentes a Salmonella y permite el reconocimiento visual de colonias sospechosas.
 Identificación bioquímica: Identificación genérica de los cultivos de Salmonella y la eliminación
de cultivos sospechosos falsos.
 Serotipificación: Técnica serológica que permite la identificación específica de un cultivo.

Imagen 7.2 Proceso de la determinación de Salmonella spp.

Para el primer día, se colocan 225 ml de caldo lactosado (preenriquecimiento) estéril en un

frasco, posteriormente se coloca el objeto con microorganismos y se incuba a por 24 hrs a 35 °C. Si en el
frasco se nota una turbidez, indica que hay presencia de crecimiento microbiano, es decir, todas las
bacterias en el objeto pasan al caldo. En el día dos, se siembran medios de enriquecimiento que en este
caso son el caldo selenito-cistina y caldo tetrationato, los cuales son específicos para Salmonella. Antes
de usar el medio tetrationato, para prepararlo se agregan 2 ml de una solución yodo-yoduro y 1 ml de
solución de verde brillante al 0.1% por cada 100 ml de caldo. El medio una vez adicionado de yodo no
debe calentarse y debe usarse el mismo día de su preparación que, en el caso de nuestra práctica, se
realizó un cálculo para 10 ml de medio de cultivo, es decir, 0.1 ml de verde brillante y 0.2 para yodo-
yoduro (NOM-114, 1994).

Para el día 3, del caldo selenito se siembran 4 placas diferentes por estría cruzada en los medios
XLD, SS, Verde Brillante y Sulfito de Bismuto; así mismo, se siembran 4 placas del caldo tetrationato en
los medios antes mencionados. El día 4 se siembra una colonia sospechosa, es decir, aquella que tenga
la morfología colonial que presenta la NOM-114, en el juego de bioquímicas. El objetivo de sembrar por
estría cruzada es obtener colonias aisladas para sembrar una colonia sospechosa en las pruebas
bioquímicas que son TSI (Triple Sugar Iron Agar), LIA (Lisina Iron Agar), Citrato de Simons, Urea y MIO.
Por lo tanto, se toma la colonia sospechosa y se pasa al TSI, del cual se tomará la muestra para el resto
de las bioquímicas (como se observa en la Imagen 7.3), y posteriormente se incuban a 35 °C por 24
horas para hacer la lectura de bioquímicas e interpretar el patrón bioquímico que nos ayudará a
identificar la bacteria de la familia Enterobacteriaceae (NOM-114, 1994).

Imagen 7.3 Proceso de siembra.

Las pruebas bioquímicas son medios de cultivo con sustratos específicos y con un indicador de
pH que nos ayudarán a identificar la actividad metabólica de las bacterias, a través del cambio de color;
la mayor parte de ellas se gelifican de forma inclinada con el fin de tener una superficie amplia para
sembrar, tener dos cámaras (pico de flauta y parte profunda), y tener un ambiente aeróbico en el pico y
un ambiente anaeróbico en la parte profunda (RenaLOA, 2011).
 El objetivo del bioquímico TSI es permitir la distinción entre los miembros de la familia
Enterobacteriaceae y otros bacilos, basándonos en la fermentación de glucosa, lactosa, sacarosa, con
presencia de gas a partir de la glucosa y con la formación de ácido sulfhídrico (color negro). Para
determinar si el TSI es ácido, presenta un color amarillo y si es alcalino muestra un color rojo, los cuales
pueden presentarse tanto en el pico como en la parte profunda del medio; en dado caso de presentar
pico alcalino y fondo ácido, el m. o. solo fermenta glucosa; si el pico y el fondo son ácidos, fermenta
glucosa, lactosa y sacarosa; si el pico y el fondo son alcalinos, es un m. o. no fermentador de azúcares; si
hay presencia de burbujas o alguna ruptura del medio, quiere decir que es positivo en gas; y si hay
ennegrecimiento del medio, quiere decir que se produce ácido sulfhídrico (RenaLOA, 2011).

Por otro lado, el bioquímico LIA tiene como objetivo el evidenciar la capacidad enzimática de un
microorganismo para descarboxilar un aminoácido y formar un amino. Para determinar si hay formación
de H2S, el medio presenta un ennegrecimiento; y si la hay descarboxilación de lisina positivo el fondo y
superficie del medio es de color púrpura (alcalino), en dado caso de encontrar amarillo, se evidencia que
el cultivo tiene descarboxilación de lisina negativo (González, 2014).

En cuanto al bioquímico CITRATO, tiene como propósito la diferenciación de enterobacterias,

gracias a la capacidad que tiene para usar el citrato como fuente de energía y carbono. Para determinar
si el citrato es positivo, el medio es color azul y si es negativo, el medio es color verde. Además, el
bioquímico UREA, tiene como objetivo el determinar la capacidad de la bacteria para desdoblar la urea,
formando moléculas de amoniaco y por la acción de la enzima ureasa; por lo tanto, el amoniaco permite
que el pH del medio sea alcalino, es decir, si la prueba presenta un medio de color rosado, se muestra
como urea positiva, mientras que, si el medio es de color naranja, se muestra como urea negativa
(González, 2014).

Por último, el bioquímico MIO ayuda a identificar las enterobacterias con base a su movilidad, a
la actividad de la ornitina descarboxilasa y la producción de indol. Para determinar si hay movilidad, el
medio se ve turbio; si hay presencia de ornitina el tubo tiene color morado, lila o gris, y en dado caso de
ser negativo, el medio es de color amarillo; y para demostrar si hay indol positivo, se agregan gotas del
reactivo Ehrlich, y el resultado debe mostrar un color rojo/rosado (González, 2014).

Materiales

 Cajas Petri con agar XLD, SS, Verde Brillante y Sulfito de Bismuto; y con colonias aisladas.
  Mechero Fisher.
 Asa bacteriológica en punta.
 Tubos de ensaye con medios de pruebas bioquímicas (TSI, LIA, citrato, urea y MIO).

Metodología
Resultados

BRENDA

Imagen 7.4 Medio de cultivo con la colonia de bacteria identificada.

Imagen 7.5 Organización del equipo para la determinación de Salmonella.

Imagen 7.6 Bioquímicas antes de ser sembradas.

Imagen 7.7 Tubos de ensaye ya cultivados.

Imagen 7.8 Incubación de las pruebas bioquímicas a 35 °C.

Imagen 7.9 Resultados después de 24 horas de incubación a 35 °C.

Imagen 7.10 Medio MIO positivo.

Imagen 7.11 Medio MIO con Indol (-).

Posteriores a las 24 h de incubación se leyeron los siguientes resultados:

-TSI
 - Ac/Ac
- Gas (+)
- H2S (+)

-LIA

- Lisina (-)
- H2S (+)

-Citrato

- Negativo (-)

-Urea

- Negativo (-)

-MIO

- Movilidad (+)
- Indol (-)
- Ornitina (+)

Imagen 7.12 Resultados de la identificación de bacteria.

Conforme a la interpretación del patrón bioquímico con la tabla de identificación, podemos

darnos cuenta qué la descripción de nuestras bioquímicas no encaja con las características de ninguna
enterobacteria, por lo que no se pudo llegar a un diagnóstico.

FÁTIMA
Imagen 7.13 Medio de cultivo con la colonia Salmonella identificada.

Imagen 7.14 Bioquímicas antes de ser sembradas.

Imagen 7.15 Incubación de las pruebas bioquímicas por 48 horas a 35 °C.

Imagen 7.16 Resultados después de 48 horas de incubación a 35 °C

Imagen 7.17 Medio MIO con Indol (+).

Posteriores a las 48 horas de incubación se leyeron los siguientes resultados:

TSI

- Alc /Ac
- Gas (+)
- Ácido sulfhídrico (-)

LIA

- Lisina descarboxilasa (-)

- Á. Sulfhídrico (+)

CITRATO

- Citrato (-)

UREA

- Urea positivo débil, en la superficie.

MIO

- Ornitina (+)
- Movilidad (+)
- Indol (+)
Imagen 7.18 Resultados de la identificación de bacteria.

Al hacer el diagnóstico, tras realizar la lectura de bioquímicas con la bacteria sembrada y

basándome en la tabla para diferenciar enterobacterias, la enterobacteria encontrada es Yersinia
enterocolítica.

ANDREA

Imagen 7.19 Medio de cultivo con la colonia de bacteria identificada.

Imagen 7.20 Organización del equipo para la determinación de Salmonella.

Imagen 7.21 Bioquímicas antes de ser sembradas.

Imagen 7.22 Incubación de las pruebas bioquímicas a 35 °C.

Imagen 7.23 Resultados después de 48 horas de incubación a 35 °C.

Imagen 7.24 Medio MIO con Indol (+).

Posteriores a las 48 h de incubación se leyeron los siguientes resultados:

TSI: ac/ac; gas (+); H2O (+)

- Fermentador de glucosa, lactosa y sacarosa

- Gas de glucosa (-)

LIA:

- Descarboxilación de lisina (+)

- H2O (+)

Citrato: (-)

Urea: ureasa (-)

MIO:

- Movilidad (+)
- Descarboxilación de ornitina (+)
- Indol (+)
Imagen 7.25 Resultados de la identificación de bacteria.

Tras realizar la lectura de las pruebas bioquímicas y comparar los resultados con la tabla de
diferenciación de enterobacterias, podemos darnos cuenta que la descripción de nuestras bioquímicas
encaja principalmente con Edwardsiella tarda, no obstante, existen tres criterios importantes que se
contradicen, por lo que no se pudo llegar a un diagnóstico.

Discusión de resultados

Como pudimos observar en todos los resultados individuales, esta práctica se enfocó en el día 4 y 5 de la
determinación de Salmonella. Como se explicó en el marco teórico, previamente se sembraron distintas
placas con diferentes tipos de agar: XLD, SS, Verde Brillante y Sulfito de Bismuto. Dentro de nuestro
equipo, dos utilizaron colonias aisladas del agar para Salmonella y Shigella (SS) y otra persona utilizó
Sulfito de Bismuto.

De acuerdo a Condalap (2019), el agar Sulfito de Bismuto (SB) se utiliza para el aislamiento de la
mayoría de Salmonella, en especial S. typhi ; sin embargo, si analizamos la Imagen 7.18, podemos
confirmar que esta bacteria no fue la encontrada cuando se sembró la colonia aislada proveniente de
este agar. Para este cultivo (Imagen 7.13), se buscaron morfologías coloniales descritas en la NOM-114-
SSA1-1994, generalmente con un halo café y con un centro gris o negro, sin brillo metálico, evitando las
colonias verdes sin un halo oscuro.
 En sí, la enterobacteria Yersenia enterocolítica (bacteria diagnosticada a partir del agar SB)
pertenece a la familia Enterobacteriaceae al igual que la Salmonella, y aunque puede llegar a generar
síntomas parecidos a los mencionados en el marco teórico, no se presenta la fiebre tifoidea
característica de la Salmonella. Según Certest (s.f.), en general esta bacteria puede desarrollar una
gastroenteritis autolimitada y hasta la causar la muerte de quien se infecte.

Como podemos observar en la Imagen 7.16, las pruebas bioquímicas muestran que esta
enterobacteria en un estado anaeróbico es capaz de consumir el azúcar presente en el medio,
generando el ácido pirúvico y cambiando el pH del fondo (dándole el color rojo). El hecho de que en un
medio aeróbico esta fermentación no se esté produciendo, nos indica que la bacteria no es
fermentadora de lactosa, por ende, el pico alcalino (que se genera por presencia de amoniaco) indica la
degradación aeróbica de la glucosa (y una consecuente producción de gas). Incluso, podemos observar
que esta bacteria no presenta la capacidad enzimática para descarboxilar lisina, pero sí para
descarboxilar ornitina; igualmente, podemos observar una pequeña presencia de la enzima ureasa, que
consiguió romper la urea en el pico del medio, pero no en el fondo, y la presencia de la enzima
triptofanasa (que produjo indol) junto con una movilidad positiva clara por parte de la bacteria.

Por otro lado, según Becton Dickenson (2013) el agar SS se utiliza para el aislamiento de bacilos
entéricos patógenos mediante la incorporación de lactosa al medio, y que inhibe las bacterias gram
positivas; si analizamos la Imagen 7.12 e Imagen 7.25, podemos confirmar que estas bacterias gram
positivas no fueron encontradas cuando se sembró la colonia aislada proveniente de este agar.
Asimismo, siguiendo lo establecido por la NOM-114-SSA1-1994, se buscaron colonias translúcidas y
opacas, con centros oscuros, y evitando las colonias rojas.

No obstante, aquí se llega a un dilema. Como podemos observar en la Imagen 7.12 e Imagen
7.25, se presentaron más de dos criterios (en la lectura de la primera y de la tercera integrante de este
equipo) que no encajaban con las características de las bacterias de la tabla de identificación de
enterobacterias; la principal y más lógica explicación es que la toma de las colonias se vio contaminada.
Existen dos mayores factores que pudieron haber afectado este suceso: primeramente, puedo ser que
las colonias no se encontraran lo suficientemente aisladas y, tomando en cuenta que todavía somos
microbiólogos inexpertos, se agarraran al menos dos colonias diferentes, alterando los resultados de la
determinación; la segunda probable explicación es que, en la NOM-114-SSA1-1994, se establece
claramente que debe realizar el cultivo en los agares XLD, SS, Verde Brillante y Sulfito de Bismuto
alrededor de 24 horas antes de la selección de colonias típicas, no obstante, las cajas petri con los
medios se guardaron durante una semana; por ende, al no tener un cultivo fresco, los diagnósticos
pudieron haberse visto afectados.

Aun así, si se analizan más a fondo los resultados para todos los diagnósticos de enterobacterias,
podemos comprobar que la muestra, en este caso provenientes de una lombricomposta y una
composta, que se analizó presentaba enterobacterias, mas no Salmonella. De acuerdo a Barrantes y Achí
(2011), la identificación de bacterias tan agresivas como la Salmonella spp. o Escherichia coli suele ser
perfectamente evidente cuando existe una verdadera presencia de éstas en cualquier tipo de muestra.
Esto lo podemos confirmar con lo explicado en el capítulo 7 del libro de Doyle te àl. ya que, como lo
explicamos también en el marco teórico, la resistencia de bacterias peligrosas como la Salmonella se ha
desarrollado enormemente, permitiendo que éstas sobrevivan en temperaturas y niveles de pH
extremos.

En general, también pudimos observar en todas las cajas con los cultivos que la variabilidad en la
población microbiana de enterobacterias en la muestra es muy alta. Tomando en cuenta que lo que se
está analizando no es un alimento, sino una composta, tiene lógica que se presenten tantos
microorganismos debido a su papel en el buen desarrollo de este tipo de mezcla de tierra con residuos
orgánicos, pero igual debido a que se trata de un suelo. Evidentemente, si esta muestra se tratara de
una matriz alimentaria, la presencia de tantas enterobacterias sería alarmante, sin embargo, no es el
caso y, gracias a que no se presentan enterobacterias agresivas y peligrosas, se puede deducir que la
composta es inocua.

Conclusión

Conforme a los resultados, logramos alcanzar el objetivo de esta práctica ya que conseguimos aplicar
adecuadamente la técnica descrita en la NOM-114-SSA1-1994 para la determinación de Salmonella, en
este caso, en compostas.

En general, también pudimos confirmar la presencia de una gran variedad de enterobacterias en las
muestras analizadas (composta y lombricomposta), sin embargo, debido a que las colonias no se
encontraban aisladas en los cultivos y a que se incubaron los medios durante un tiempo mayor al
indicado por la NOM-114-SSA1-1994, hubo una oportunidad de contaminación evidente. Por lo tanto,
no se logró obtener diagnósticos concretos, especialmente porque los resultados de las lecturas de las
pruebas bioquímicas no coinciden contra la tabla de interpretación.
Originalmente se planteó que se hallaría Salmonella spp. en la muestra del suelo que se analizó. Tras
obtener los resultados y realizar la discusión, podemos estar de acuerdo con lo establecido por
Barrantes y Achí (2011) al decir que la identificación de Salmonella es muy clara cuando
verdaderamente se trata de esta enterobacteria; así que, aunque nuestras pruebas resultaran
contaminadas, se tiene la certeza de que no hay presencia de Salmonella en las compostas analizadas.
Por ende, la hipótesis se rechaza.

Tomando toda esta información en cuenta, se puede concluir que la composta es

completamente inocua ya que no se encontró ningún tipo de bacteria altamente patógena, peligrosa y
extremadamente resistente como lo es la Salmonella spp. o Escherichia coli. Por lo tanto, la composta
que está vendiendo nuestro cliente (y utilizando para sus huertos) es completamente adecuada y segura
conforme a las medidas de la NOM-114-SSA1-1994.

Referencias

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Barrantes, K. y Achí, R. (2011) Calidad microbiológica y análisis de patógenos (Shigella y Salmonella) en

lechuga. Revista de la Sociedad Venezolana de Microbiología, 31(1). Recuperado 03 noviembre
2021. http://ve.scielo.org/scielo.php?script=sci_arttext&pid=S1315-25562011000100007

Certest (s.f.) Yersinia enterocolitica. Recuperado 03 noviembre 2021.

https://www.certest.es/es/products/yersinia-enterocolitica/

Condalap (2019) Agar Bismuto Sulfito (Wilson Blair) USP. Recuperado 03 noviembre 2021.
file:///Users/andreamorales/Downloads/1011_es_1.pdf

Doyle, M.P., Beuchatt, L.R. y Montville, T.J. (1993). Microbiología de los Alimentos. Editorial ACRIBIA.
https://kupdf.net/download/microbiologia-de-los-alimentos-
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González, J., Pereira, N., Soto, S., Hernández, E. y Villarreal, J. (2014). Aislamiento microbiológico de
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Recuperado 01 noviembre 2021. http://www.scielo.org.co/pdf/sun/v30n1/v30n1a09.pdf
Parra, Miguel, & Durango, Johnny, & Máttar, Salim. (2002). Microbiología, patogénesis,
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