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PRCTICA DE LABORATORIO MICROBIOLOGA DE ALIMENTOS 2011 I DETERMINACIN DE ESPORAS DE Clostridium SULFITOS REDUCTORAS Guerra Laura, Meja Leonardo, Paniquita

a Carolina, Pealoza Yanireth, Romero Nelsy INTRODUCCIN El gnero Clostridium est formado por ms de cien especies con limitada relacin gentica y propiedades bioqumicas diversas. Comprende a bacilos grampositivos, anaerobios, esporulados. Son ubicuos pudiendo ser encontrados en el suelo y aguas residuales as como tambin en la flora intestinal de hombres y animales. En su mayora son saprofitos, pero los patgenos pueden causar graves enfermedades como gangrena gaseosa, botulismo, ttanos, infecciones de piel y partes blandas, colitis asociada a antibiticos e intoxicaciones alimentarias. La capacidad para provocar enfermedad est vinculada a la posibilidad de sobrevivir en condiciones ambientales adversas mediante la formacin de esporas, crecer rpidamente y producir toxinas histolticas, enterotoxinas y neurotxicas. (Aycachi R. 2008) Clostridium perfringens es la especie del gnero Clostridium ms frecuentemente aislada en materiales clnicos. Es un bacilo gram positivo grande de bordes rectos y extremos romos. Desarrolla rpidamente en anaerobiosis, produciendo colonias grandes que muestran doble halo de hemlisis en las placas de agar sangre. Sus caractersticas morfolgicas, la demostracin de presencia de esporas, el rpido desarrollo en anaerobiosis y algunas propiedades bioqumicas (lecitinasa) conforman un perfil que facilita su rpida deteccin en el laboratorio. (Aycachi R. 2008) El mtodo de recuento en tubo, es otro mtodo que permite la determinacin del nmero de microorganismos viables presentes en muestras de alimentos. Este mtodo, es particularmente til para el recuento de microorganismos anaerobios, tales como los Clostridium sulfito reductores, siempre y cuando se utilice el medio adecuado y las correctas condiciones de incubacin. Los medios de cultivo empleados para el recuento de anaerobios (por ejemplo Clostridium sulfito reductores), son el medio Triptona Sulfito Neomicina Agae (TSN Agar), o el medio Sulfito Polimixina Sulfadiacina Agar (SPS Agar). (Alayo G, 2008).

OBJETIVO GENERAL Determinar la presencia de esporas de Clostridium sulfito reductor a partir de productos enlatados (Atn Vam Camps).

OBJETIVOS ESPECFICOS: Identificar la presencia de Clostridium sulfito reductor en la muestra de alimento (Atn Vam Camps), mediante el color y el nmero de las colonias.

Determinar el nmero de microorganismos viables (anaerobios sulfito reductores) presentes en la muestra de alimento. (Atn Vam Camps). Tomar conciencia de los peligros que ocasionan la presencia de estos microorganismos en los alimentos. Analizar la calidad microbiolgica del alimento Atn Vam Camps. MARCO TEORICO

Clostridium spp son organismos Gram positivos, anaerbicos, formadores de esporas, que estn normalmente en las heces, su representante ms caracterstico es Clostridium perfringens. Son deteriorantes, ya que producen malos olores y, con mucha frecuencia, ennegrecimiento del producto cuando ste tiene hierro, formando un precipitado oscuro de sulfuro de hierro. Estos microorganismos tienen la capacidad de reducir los sulfitos a sulfuros a partir de aminocidos y compuestos azufrados y para su deteccin se utiliza la evidente coloracin negra dada por la formacin del precipitado. El origen de los anaerobios sulfito-reductores no es exclusivamente fecal, ya que pueden proceder de otras fuentes ambientales como suelo, sedimentos marinos, vegetacin en descomposicin, heridas infectadas de hombre y animales, aguas superficiales, como tambin en los alimentos, especialmente cuando las condiciones de higiene en la elaboracin son deficientes.( Gesche E y col 2003). Clostridium perfringens es agente etiolgico de muchas enfermedades y es la tercera causa de toxiinfeccin alimentaria bacteriana despus Salmonella spp y Staphylococcus aureus. Existen dentro de la especie cinco tipos llamados A, B, C, D y E. C. perfringens A es el responsable de la mayora de los procesos infecciosos. Produce una enterotoxina (polipptido de 35.000 daltons de peso molecular) que se comporta como un superantgeno promoviendo la liberacin de mediadores de inflamacin en forma masiva. La enterotoxina es susceptible a pronasa pero no a tripsina ni quimiotripsina. En el intestino delgado, la enterotoxina se une a un receptor de membrana del ribete en cepillo e induce una alteracin de la permeabilidad calcio dependiente resultando en una prdida de iones y metablitos. Esta prdida electroltica altera la funcin metablica intracelular provocando dao morfolgico y eventual lisis. La enfermedad se produce cuando el individuo ingiere alimento contaminado con un elevado nmero de organismos productores de enterotoxinas. Los alimentos que pueden estar contaminados son carnes vacuna, pollo, salsas cocinadas y no refrigeradas. Cuando los alimentos llegan al intestino delgado se produce la esporulacin y la liberacin de enterotoxinas. (Aycachi R. 2008). Clostridium botulinum. Es un bacilo gram positivo largo, anaerobio, que forma esporas subterminales. Las esporas son altamente resistentes pudiendo sobrevivir en alimentos incorrectamente procesados. Esta ampliamente distribuidos en la naturaleza, suelos, agua, vsceras de cangrejos y bivalvos y en el tracto intestinal de mamferos. Produce una potente neurotoxina de la que existen siete tipos: A, B, C, alfa, D, E, F y G. Es posible dividir a los organismos en cuatro tipos (I a IV) segn la toxina que producen y su actividad proteoltica. Los pertenecientes al grupo I producen toxinas A, B o F y son proteolticas en los cultivos. Los del grupo II producen toxinas B,

E o F y no son proteolticos. La enfermedad humana est vinculada a los tipos I y II y a la toxina A principalmente. MATERIALES Papel graff estril. 11 g de Atn Van Camps 1 Erlenmeyer con 99ml de agua peptonada. 2 tubos de ensayo con 9ml de agua peptonada. 3 tubos de ensayo estril. Balanza analtica. Agar SPS. Puntas azules. Micropipeta de 1ml. Esptulas estriles. Alcohol Algodn Gradilla Mortero

PROCEDIMIENTO Se Mezclo muy bien la muestra para asegurar su homogenizacin. Luego se Desinfect con alcohol al 75% el sitio por donde se tom la muestra. Se abri aspticamente (con el mechero en medio) y adecuadamente la muestra y se tomaron porciones de diferentes sitos de la muestra. Fueron pesados 11 gramos de la muestra en balanza analtica, sobre un papel graff estril, y se macero en un mortero. Los 11 g de muestra macerados se aadieron a un recipiente que contena 99 ml de agua peptonada para obtener la dilucin de 10-1. Se agito vigorosamente el recipiente para homogenizar. Se prepar la dilucin 10-2 trasfiriendo 1 ml de la dilucin 10-1 a un tubo de ensayo que contena 9 ml de agua peptonada. Se prepar la dilucin 10-3 trasfiriendo 1 ml de la dilucin 10-2 un tubo de ensayo que contena 9 ml de agua peptonada. De las tres diluciones anteriores se tomaron 1 ml y fueron adicionados en tubos de ensayos tapa rosca y se calentaron a 80 oC durante 10 minutos en bao de mara, pasado el tiempo se dejo enfriar y se adicionaron 4 ml de agar SPS ( Sulfato polimixina Sulfadiacina). Se dejo solidificar y se agrego otra capa de SPS Se Incubo a 37C durante 72 horas, y se observo cada 24 horas

RESULTADOS Luego de incubar los tubos obtuvimos: 24 horas 48 horas 72 horas

Al pasar las 72 horas de incubacin, no logramos observar ninguna colonia de color negro en el medio de cultivo, es decir no pudimos aislar microorganismos reductores de sulfito a sulfato.

INFORME: < 10 UFC/g de esporas de Clostridium sulfitos reductoras en el atn de marca Van Camps.

ANALISIS DE RESULTADO El gnero Clostridium por ser productor de esporas, tiene una mayor resistencia a las condiciones ambientales por esta razn su identificacin en alimentos enlatados es muy comn. Segn los datos obtenidos fue posible reportar la ausencia de esporas de Clostridium sulfito reductoras debido a que no se presentaron colonias de color negro al no llevarse a cabo la reduccin del sulfito de sodio que contena el medio ni la produccin de sulfuro de hierro.

CONCLUSIONES Con la realizacin del anterior trabajo se logr determinar que la muestra del producto enlatado analizado (Atn Vam Camps) no se observ la presencia de esporas de Clostridium sulfito reductor, de igual manera no hubo aumento en el nmero de colonias.

Se considera que el alimento present una adecuada calidad microbiolgica, ya que de acuerdo a los estudios realizados no se observ la presencia Clostridium sulfito reductor tanto de esporas como de colonias.

BIBLIOGRAFIA

Aycachi R. 2008. Aislamiento e Identificacin de Clostridium perfringens. Lambayeque. Universidad Nacional Pedro Ruiz Gallo. Disponible en: http://es.scribd.com/doc/6674027/Microbiologia-de-Alimentos-Practica-n 14Aislamiento-e-identificacionde-Clostridium-perfringens Gesche E, Vallejos A, Saez M. 2003.Eficiencia de Anaerobios sulfito-reductores como indicadores de calidad sanitaria de agua. Mtodo de Nmero Ms Probable (NMP). Chile. Universidad Austral de Chile. P 99- 105. Disponible en: http://mingaonline.uach.cl/pdf/amv/v35n1/art11.pdf Clostridium botulinum. http://www.bvsops.org.uy/pdf/clostridium.pdf Disponible en:

Alayo G. 2008. Recuento en tubo de anaerobios Sulfito Reductores .Peru. Universidad Nacional de Trujillo. Disponible en: http://es.scribd.com/doc/8536988/microbiologia-de-alimentos-LaboratoriosPascual M, Caldern V.2000.Microbiologia Alimentaria. Madrid-Espaa. Editorial Daz de Santos. P 75

ANEXOS AGAR SPS: Es un medio es selectivo para grmenes sulfito- reductores. El sulfato sdico, por la accin sulfito reductora de la mayor parte de los Clostridium, se produce a sulfuro. El sulfuro, al reaccionar con el citrato de hierro, da lugar a sulfuro de hierro, que se manifiesta formando un precipitado negro alrededor de las colonias. La Sulfadiazina sdica es selectiva e inhibe el crecimiento de grmenes gram negativos. (Pascual et all, 2000) COMPOSICIN: Frmula ( Gramo/ litro) Triptona Extracto de levadura Citrato frrico Sulfito de Sdio Tioglicolato de Sodio Monooleato Sorbitn Sulfadiazina Sulfato de Polimixina B Agar pH final: 7.0 0.2 a 25 C. 15g 10g 0,5g 0,5g 0,1g 0,05g 0,012g 0,01g 15g