Cromatografía

Técnicas de análisis
CROMATOGRAFÍA
Tecnicatura Universitaria en Metalurgia / Ingeniería Metalúrgica

Cromatografía
La cromatografía es un potente método de separación que tiene aplicación en todas las
ramas de la ciencia.
La cromatografía agrupa un conjunto importante y diverso de métodos que facilitan la
separación, identificación y determinación de componentes estrechamente relacionados en
mezclas complejas; muchas de dichas separaciones son imposibles por otros medios.
En todas las separaciones cromatográficas la muestra se disuelve con una fase móvil—que
puede ser un gas, un líquido o un fluido supercrítico— la cual se hace pasar a través de una
fase estacionaria inmiscible fija en una columna o en una superficie sólida.
Las dos fases se eligen de tal forma que los componentes de la muestra se distribuyen en
grados distintos entre la fase móvil y la fase estacionaria.
Aquellos componentes que son fuertemente retenidos por la fase estacionaria se mueven
con mucha lentitud con el flujo de la fase móvil. En cambio, los componentes unidos
débilmente a la fase estacionaria se mueven con rapidez.
Como consecuencia de las distintas velocidades de migración, los componentes de la
muestra se separan en bandas o zonas distintas que se pueden analizar en forma cualitativa
y cuantitativa.
Cromatografía
Clasificación
La clasficación más usual de los métodos cromatográficos se basa en los tipos de fases
móviles y estacionarias, y en la clase de equilibrios involucrados en la transferencia de los
solutos entre las fases.
Las tres categorías generales de cromatografía son: cromatografía de gases, cromatografía
de líquidos y cromatografía de fluidos supercríticos.
Como su nombre lo indica, las fases móviles en las tres técnicas son gases, líquidos y fluidos
supercríticos, respectivamente.
La cromatografía de líquidos puede llevarse a cabo en columnas o sobre superficies planas.
La cromatografía de gases y la de fluidos supercríticos están restringidas a los
procedimientos en columna.

Cromatografía
Clasificación

Cromatografía de elución en columna
La figura muestra, en forma esquemática, cómo dos
sustancias A y B se separan en una columna
empacada.
La columna está constituida por un tubo angosto
relleno con un sólido inerte finamente dividido que
mantiene a la fase estacionaria en su superficie.
La fase móvil ocupa los espacios abiertos entre las
partículas del material de empaque.
Para empezar, una solución de la muestra que
contiene una mezcla de A y de B en la fase móvil se
introduce en la parte superior de la columna.
Entonces los dos componentes se distribuyen entre
las fases móvil y estacionaria.
La elución implica la purificación de una especie por
lavado en una columna mediante la adición
continua de fase móvil nueva.
La adición continua se consigue por medio de una
bomba en cromatografía líquida y en cromatografía
de fluidos supercríticos o por la aplicación de
presión en cromatografía gaseosa.
Con la primera introducción de fase móvil nueva, la
muestra avanza hacia abajo por la columna, donde
tiene lugar un reparto o distribución entre la fase
móvil y la fase estacionaria.
A medida que la fase móvil limpia fluye por la
columna, transporta moléculas de soluto hacia
abajo de la columna en una serie continua de
transferencias entre las dos fases.
Como el movimiento de los solutos sólo puede
ocurrir en la fase móvil, la velocidad media a la que
una zona de soluto migra hacia abajo en la columna
depende de la fracción de tiempo que permanece o
reside en dicha fase. Tecnicatura Universitaria en Metalurgia / Ingeniería Metalúrgica
Esta fracción de tiempo es pequeña para las
sustancias que son retenidas fuertemente por la
fase estacionaria, por ejemplo, el compuesto B en la
figura, y grande cuando el soluto reside
principalmente en la fase móvil (componente A).
De manera ideal, las diferencias de velocidad que
resultan hacen que los componentes de la mezcla
se separen en bandas, o zonas, que se localizan a lo
largo de la columna.
El aislamiento de las especies separadas se logra
haciendo pasar una cantidad suficiente de fase
móvil por la columna hasta que las bandas
individuales llegan al extremo, es decir, son eluidas
o lavadas de la columna, en donde se detectan o se
recogen.

Si al final de la columna se coloca un detector que
responde a la concentración del soluto y se registra
su señal en función del tiempo, o del volumen de
fase móvil añadido, se obtiene una serie de picos
como se muestra en la parte inferior de la figura.
Este gráfico, denominado cromatograma, es útil
tanto para los análisis cualitativo como cuantitativo.
La posición de los picos en el eje del tiempo sirve
para identificar los componentes de la muestra.
Las áreas bajo los picos proporcionan una medida
cuantitativa de la cantidad de cada componente.

Cromatografía de gases
En cromatografía de gases los componentes de una muestra vaporizada se separan como
consecuencia de que se reparten entre una fase gaseosa y una fase estacionaria contenida
en una columna.
Al efectuar una separación cromatográfica de gases, la muestra se vaporiza y se inyecta en
la cabeza de una columna cromatográfica.
La elución se lleva a cabo mediante el flujo de una fase móvil de gas inerte.
A diferencia de la mayoría de los otros tipos de cromatografía, la fase móvil no interactúa
con las moléculas del analito; su única función es transportar este último a través de la
columna.

Cromatografía de gases
Existen dos tipos de cromatografía de gases: la cromatografía gas-líquido (CGL) y la
cromatografía gas-sólido (CGS).
La primera tiene gran aplicación en todos los campos de la ciencia; su denominación se
suele abreviar a cromatografía de gases (CG).
La segunda se basa en una fase estacionaria sólida en que la retención de los analitos
ocurre porque hay adsorción. Su aplicación se encuentra limitada a la separación de
algunas especies gaseosas de bajo peso molecular y no tiene mayores aplicaciones.
En la cromatografía gas-líquido el analito se divide entre una fase móvil gaseosa y una fase
líquida inmovilizada sobre la superficie de un relleno sólido inerte o en las paredes de un
tubo capilar.

Cromatografía gas-líquido
Diagrama de bloques de los componentes básicos de un instrumento característico para
cromatografía de gases:

La fase móvil se llama gas portador y debe ser químicamente inerte. El helio es el gas para
fase móvil más común, pero también se usan argón, nitrógeno e hidrógeno.
Estos gases se contienen en recipientes a presión. Se requieren reguladores de presión,
manómetros, filtros de agua/impurezas y medidores de caudal.
El sistema de inyección de la muestra debe garantizar que la muestra no se introduzca de
manera lenta o muestras demasiado grandes, que ocasionan dispersión de los picos y mala
resolución del cromatograma. Para ello se utilizan microjeringas calibradas.

La cámara de inyección de muestra se ubica en la
cabeza de la columna, a una temperatura de unos 50
°C por encima de la muestra.
Actualmente se utilizan autoinyectores con bandejas
automáticas de muestreo del punto de ebullición del
componente menos volátil para la mayoría de los
cromatógrafos de gases. Con éstos se puede mejorar
en gran medida la precisión del volumen inyectado en
comparación con la inyección manual con jeringa.

Se utilizan dos tipos generales de columnas, las empacadas y las tubulares abiertas o
capilares.
Anteriormente, la mayor parte de los estudios cromatográficos de gases se ejecutaba con
columnas empacadas. En la mayoría de aplicaciones actuales, las columnas empacadas
dejaron paso a las columnas capilares, más eficaces y rápidas.
Las columnas cromatográficas empacadas varían desde 1 m hasta 5 m de longitud, y las
columnas capilares varían de pocos metros hasta 100 m.
Están construidas con sílice fundida o con acero inoxidable, pero también se usa el vidrio o
el Teflón.
Se fabrican en forma helicoidal con diámetros de 10 a 30 cm.

Entre las propiedades deseables para una fase líquida inmovilizada en una columna
cromatográfica gas-líquido están:
- Baja volatilidad: idealmente, el punto de ebullición del líquido debe ser al menos 100 °C
mayor que la temperatura de trabajo máxima de la columna
- Estabilidad térmica
- Químicamente inerte
Durante el perfeccionamiento de la cromatografía gas-líquido se ha propuesto un número
incontable de solventes como fases estacionarias. Por ahora, menos de una docena se usa
de manera ordinaria.
La elección apropiada de la fase estacionaria es decisiva para el éxito de la separación.

Fases estacionarias más frecuentes:

La temperatura de la columna es una variable importante que se tiene que regular hasta
unas décimas de grado en el caso de un trabajo preciso.
Es por eso que la columna se suele alojar dentro de un horno con temperatura controlada.
La temperatura óptima de la columna depende del punto de ebullición de la muestra y del
grado de separación requerido.
En la práctica, con una temperatura igual o ligeramente superior al punto de ebullición
promedio de la muestra se obtiene un tiempo de elución razonable (2 a 30 min).
Para muestras cuya temperatura de ebullición varía ampliamente, lo mejor es aplicar una
programación de temperatura, con la cual se aumenta la temperatura de la columna en
forma continua o por etapas a medida que avanza la separación.
Algunas veces, los analitos de volatilidad limitada se pueden determinar mediante la
formación de derivados que son más volátiles. De igual manera, la derivación se usa a veces
para aumentar la detección o el rendimiento cromatográfico.

El detector ideal para cromatografía de gases tiene las siguientes características:
1. Debe poseer una sensibilidad adecuada a las sustancias a identificar.
2. Buena estabilidad y reproductibilidad.
3. Respuesta lineal para los solutos que se extienda a varios ordenes de magnitud.
4. Intervalo de temperaturas desde la temperatura ambiente hasta al menos 400 °C.
5. Tiempo de respuesta corto independiente de la tasa de flujo.
6. Alta confiabilidad y manejo sencillo. El detector debería estar a prueba de la impericia de
operadores inexpertos, si es posible.
7. Respuesta semejante para todos los solutos o, por el contrario, una respuesta selectiva y
altamente predecible para uno o mas tipos de solutos.
8. No debe destruir la muestra.

Detectores más usados

Detectores de ionización por llama
El detector de ionización por llama (FID, por sus
siglas en inglés) es el que más se utiliza y, por lo
general, uno de los que más se aplican en
cromatografía de gases.
En este detector el efluente de la columna se
dirige a una pequeña llama de hidrógeno y aire.
La mayoría de los compuestos orgánicos
producen iones y electrones cuando se pirolizan
a la temperatura de una llama de hidrógeno-aire.
La detección implica controlar la corriente
producida al recolectar estos portadores de
carga.

Detectores de ionización por llama
Cuando se aplica una diferencia de potencial
de unos pocos cientos de volts entre el
extremo del quemador y un electrodo colector
situado por encima de la llama, los iones y los
electrones se dirigen hacia el colector.
La corriente resultante se mide con un
picoamperímetro de alta impedancia.
El detector de ionización por llama manifiesta
una elevada sensibilidad, un gran intervalo de
respuesta lineal y un bajo ruido. Las
desventajas de este detector son la destrucción
de la muestra durante el paso de la combustión
y la necesidad de gases adicionales y
controladores.

Detectores de conductividad térmica
TCD, por sus siglas en inglés. Este dispositivo contiene una fuente que se calienta mediante
electricidad, cuya temperatura y resistencia eléctrica, a una potencia eléctrica constante,
depende de la conductividad térmica del gas circundante.
El elemento calentado puede ser un hilo fino de platino, oro o tungsteno.
Las ventajas del detector de conductividad térmica
son su sencillez, su amplio intervalo dinámico lineal,
su respuesta general tanto a especies orgánicas como
a inorgánicas y su carácter no destructivo, lo que
permite recoger los solutos tras la detección.
Su limitación principal es su baja sensibilidad, lo que
los imposibilita a ser utilizados con columnas
capilares donde las cantidades de muestra son muy
pequeñas.

La cromatografía de gases es una herramienta para efectuar separaciones.
En este sentido, los métodos de la GC son inmejorables cuando se aplican a muestras
orgánicas complejas, a organometálicos y a sistemas bioquímicos conformados por especies
volátiles o por especies que pueden someterse a un proceso para producir sustancias
volátiles.
El segundo papel que desempeña la GC es en la terminación de un análisis. En este caso se
emplean los tiempos o volúmenes de retención para la identificación cualitativa y las
alturas de los picos o sus áreas dan información cuantitativa.
Desde el punto de vista cualitativo, la GC es una técnica mucho más limitada que la mayoría
de los métodos espectroscópicos, por eso, una tendencia importante en este campo ha sido
en la dirección de combinar las notables cualidades para la separación que tiene la GC con
las mejores propiedades de identificación que poseen instrumentos como los
espectrómetros de masas, de infrarrojo y de resonancia magnética nuclear.


Cromatografía de líquidos
La cromatografía de líquidos es la técnica analítica de separación más ampliamente
utilizada.
Las razones de su popularidad son su sensibilidad, su fácil adaptación a las determinaciones
cuantitativas exactas, su idoneidad para automatizarla, su capacidad para separar especies
no volátiles o termolábiles, pero sobre todo, su amplia aplicabilidad a sustancias que son
importantes en la industria, muchos campos de la ciencia y para la sociedad en general.
Algunos ejemplos de estos materiales son aminoácidos, proteínas, ácidos nucleicos,
hidrocarburos, carbohidratos, fármacos, terpenoides, plaguicidas, antibióticos, esteroides,
especies organometálicas y una variedad de sustancias inorgánicas.
Con el objetivo de alcanzar flujos razonables se requieren presiones de bombeo de varios
cientos de atmósferas. Debido a estas presiones elevadas, el equipo necesario para la
cromatografía de líquidos de alta resolución (HPLC) tiende a ser más complejo y caro que el
que se utiliza en otros tipos de cromatografía.

Esquema de los componentes fundamentales de un cromatógrafo de líquidos

Equipamiento – Sistema de solventes
Posee uno o más recipientes de vidrio, cada uno de los cuales contiene 500 mL o más de un
solvente. Suelen contar con un sistema para eliminar los gases disueltos y polvo de los
líquidos.
Los gases disueltos ocasionan flujos inestables, ensanchamiento de bandas e interfieren
con el funcionamiento de la mayoría de los detectores. Los desgasificadores pueden
consistir en un sistema de bombeo por vacío, un sistema de destilación, un dispositivo para
calentar y agitar los solventes o sistemas de purga que permiten arrastrar los gases
disueltos fuera de la solución mediante finas burbujas de un gas inerte insoluble en la fase
móvil.
El dispositivo para filtrar los solventes y eliminar el polvo y las partículas sólidas que estén
en suspensión evita que se dañen la bomba o los sistemas de inyección u obturen la
columna.
Los instrumentos modernos poseen sistemas con válvulas de alimentación que introducen
los solventes desde dos o más recipientes, permitiendo regular la relación entre los
solventes de la manera que se desee durante la separación.
Equipamiento – Sistema de bombeo
El sistema de bombeo debe generar presiones de hasta 6000 psi (lb/in2) o 414 bares, una
salida libre de pulsos, tasas de flujo de 0,1 a 10 mL/min, reproducibilidad del flujo de 0.5%
relativo o mejor y componentes resistentes a la corrosión a causa de la diversidad de
solventes.
Las presiones elevadas que generan las bombas de cromatografía de líquidos no
constituyen un riesgo de explosión, porque los líquidos no son muy compresibles. La rotura
de un componente del sistema sólo provoca una pérdida de solvente. Lo que sí es evidente
es que ésta puede representar un riesgo de incendio o de contaminación del ambiente.
Las bombas que se utilizan son las de tipo reciprocante.

Equipamiento – Sistema de bombeo
Consisten en una pequeña cámara en la que el solvente es impulsado por el movimiento de
vaivén de un pistón accionado mediante un motor.
Dos válvulas de globo unidireccionales, que se abren y cierran de manera alternada,
controlan el flujo del solvente hacia dentro y hacia afuera de un cilindro.
El solvente está en contacto directo con el pistón.
Tienen la desventaja de producir un flujo
pulsado que se tiene que amortiguar
porque los pulsos se manifiestan como
ruido en la línea base del cromatograma.
Los instrumentos modernos de están
equipados con cabezas dobles para las
bombas o levas elípticas para reducir al
mínimo dichos pulsos.

Equipamiento – Sistema de inyección de muestra
Un factor limitante en la precisión de las mediciones en
cromatografía de líquidos es la reproductibilidad con que se
pueden introducir las muestras en el relleno de la columna.
Los volúmenes de muestra que se emplean tienen que ser
muy pequeños, de unas pocas décimas de microlitro hasta
quizá unos 500 μL y lo apropiado es introducir la muestra sin
despresurizar el sistema.
Para lograr esto el medio que más se usa para la introducción
de las muestras en la cromatografía de líquidos se basa en los
rizos de muestreo.
Hay rizos intercambiables que permiten la elección de
distintos tamaños de muestra.
Este sistema permite introducir la muestra a presiones de
hasta 7000 psi con una desviación estándar relativa de unas
décimas porcentuales.
Equipamiento – Sistema de inyección de muestra
La mayor parte de los cromatógrafos actuales se venden con autoinyectores.
Dichas unidades tienen la capacidad de inyectar muestras en el cromatógrafo de líquidos a
partir de frascos que están en un carrusel o desde placas microtituladoras.
Por lo regular, contienen rizos de muestreo y una bomba de jeringa para inyectar
volúmenes desde menos de 1 μL hasta más de 1 mL.
La mayor parte de los equipos se puede programar para facilitar las inyecciones
automáticas en el sistema de cromatografía de líquidos.

Equipamiento - Columnas
Las columnas suelen construirse con tubo de acero inoxidable de diámetro interno
uniforme.
En algunas ocasiones las columnas se fabrican con tubos de vidrio de paredes resistentes o
con polímeros como el polieteretercetona. También hay columnas de acero inoxidable cuyo
interior está revestido con vidrio o polieteretercetona.
La mayoría de las columnas para cromatografía de líquidos miden de 5 a 25 cm de largo. A
veces se pueden alargar acoplando dos o más de ellas.
Invariablemente se usan columnas rectas. El diámetro interior de las columnas analíticas es
a menudo de 3 a 5 mm; los tamaños de las partículas de los rellenos más comunes son 3 o
5 μm.
Por lo regular, para aumentar la vida de la columna analítica, se coloca una precolumna que
elimina no sólo la materia en suspensión y los contaminantes de los solventes, sino también
los componentes de la muestra que se unen de manera irreversible a la fase estacionaria.

La composición del relleno de la precolumna debería ser semejante al de la columna
analítica, pero el tamaño de partícula es mayor para minimizar la caída de presión.
Cuando la precolumna ya se contaminó, se vacía y se rellena de nuevo o se reemplaza por
una nueva del mismo tipo. Por tanto, se le sacrifica para proteger a la columna analítica que
es más cara.
En muchas aplicaciones no se necesita un control riguroso de la temperatura, por esa razón
las columnas trabajan a temperatura ambiente.
Sin embargo, muchas veces se obtienen mejores cromatogramas, más reproducibles,
cuando la temperatura de la columna se mantiene constante.
La mayoría de los instrumentos comerciales modernos están equipados con calentadores
que controlan la temperatura de la columna con décimas de grado, desde la ambiental
hasta 150 °C.

Se utilizan dos tipos básicos de rellenos, pelicular y de partícula porosa.
Las partículas peliculares originales eran esferas de vidrio o de polímero no porosas cuyos
diámetros característicos eran de 30 a 40 μm. En la superficie de éstas se depositaba una
fina capa porosa de sílice, de alúmina o de una resina sintética de poliestireno-
divinilbenceno, o bien, una resina de intercambio iónico. Las micropartículas porosas
reemplazaron por completo a las partículas peliculares, aunque recientemente se han
reintroducido rellenos peliculares, de alrededor de 5 μm, para separar proteínas y
biomoléculas grandes.
Los rellenos de partículas porosas están formados por micropartículas porosas cuyos
diámetros varían entre 3 y 10 μm; para un tamaño de partícula dado es deseable tener una
distribución muy estrecha de dimensiones de partícula. Las partículas son de sílice,
alúmina, de una resina sintética de poliestireno-divinilbenceno o resinas de intercambio
iónico. La sílice es el material de relleno más común en cromatografía de líquidos.

Equipamiento - Detectores
No hay detectores para cromatografía de líquidos tan universalmente aplicables como los
detectores de ionización por llama y de conductividad térmica para cromatografía de gases.
El detector ideal para cromatografía de líquidos debería poseer todas las características que
se mencionaron para detectores de cromatografía gaseosa, con excepción de que no
requiere ser sensible en un intervalo tan grande de temperaturas.
Además, un detector de HPLC debe tener un volumen interno mínimo con el fin de reducir
el ensanchamiento de las bandas y ser compatible con el flujo de líquidos.
Los detectores para cromatografía de líquidos son de dos tipos básicos:
- Los que se basan en una propiedad de la solución, son sensibles a una propiedad de la
fase móvil, como el índice de refracción, la constante dieléctrica o la densidad, la cual es
modulada por la presencia de solutos.
- Los que se basan en una propiedad del soluto, responden a propiedades como la
absorbancia en el UV, fluorescencia o corriente de difusión, que no son inherentes a la
fase móvil.
Equipamiento - Detectores

Equipamiento – Detectores de absorción UV-visible
Se utiliza una celda de flujo en forma de Z para las mediciones de absorción de los efluentes
de una columna cromatográfica. A fin de minimizar el ensanchamiento de banda
extracolumna, el volumen de dichas celdas tiene que ser el menor posible.
Los volúmenes de la celda representativa son de 1
a 10 μL y las longitudes de trayectoria de la celda
son de 2 a 10 mm.
Los detectores pueden ser de longitud de onda
fija, de longitud de onda variable o de arreglo de
diodos.
Muchos detectores de absorción son dispositivos
de doble haz, en los que uno de ellos atraviesa la
celda del eluyente y el otro es de referencia. Para
comparar las intensidades de los dos haces se
utilizan detectores fotoeléctricos contrastados.

Equipamiento – Detectores de fluorescencia
Los detectores más sencillos utilizan una fuente de excitación de mercurio y uno o más
filtros para aislar una banda de la radiación emitida.
Los instrumentos más complejos consisten en una fuente de xenón y emplean un
monocromador de red para aislar la radiación fluorescente.
La fluorescencia inducida por rayo láser también se utiliza debido a su sensibilidad y
selectividad.
Una ventaja inherente de los métodos de fluorescencia es su alta sensibilidad, que resulta
ser mayor por más de un orden de magnitud que la de la mayoría de los procedimientos de
absorción.
Los compuestos fluorescentes suelen estar relacionados con el análisis de materiales de
interés farmacéutico, productos naturales, muestras clínicas y productos del petróleo.

Equipamiento - Detectores de índice de refracción
El solvente, en su camino hacia la columna, pasa a través de una mitad de la celda y el
eluyente de la columna pasa por la otra mitad. Los dos compartimentos están separados
por una placa de vidrio montada a un ángulo tal que se produce una desviación del haz
incidente si las dos soluciones tienen distintos índices de refracción.
El desplazamiento resultante del haz respecto a la superficie fotosensible de un detector
causa una variación en la señal de salida, la cual, una vez amplificada y registrada,
proporciona el cromatograma.
La ventaja de los detectores de índice de refracción es que responden a casi todos los
solutos, es decir, son detectores universales.
Son confiables y no dependen de la
tasa de flujo. Sin embargo, son muy
sensibles a los cambios de
temperatura y tienen que estar a
temperatura constante hasta unas
pocas milésimas de grado
centígrado. Tecnicatura Universitaria en Metalurgia / Ingeniería Metalúrgica
El tipo de cromatografía de líquidos de alta resolución (HPLC) más ampliamente utilizado es
la cromatografía de reparto, en la cual la fase estacionaria es un segundo líquido que es
inmiscible con la fase líquida móvil.
Utilizan columnas de fase líquida unida, que se ligan al soporte por medio de un enlace
iónico, lo que da por resultado rellenos muy estables e insolubles en la fase móvil.
Los soportes para casi todos los rellenos de fases unidas químicamente se preparan con
sílice rígida o composiciones constituidas básicamente por sílice.
Con base en las polaridades relativas de las fases móvil y estacionaria, se distinguen dos
tipos de cromatografía de reparto:
- Fase normal: utiliza fases estacionarias de elevada polaridad y fase móvil no polar.
- Fase inversa: la fase estacionaria es no polar y la fase móvil es un solvente polar.
En la cromatografía en fase normal, el componente menos polar se eluye primero; al
aumentar la polaridad de la fase móvil ocasiona una disminución del tiempo de elución.
En cambio, con la cromatografía de fase inversa, los componentes más polares aparecen
primero y un aumento de la polaridad de la fase móvil incrementa el tiempo de elución.
Se calcula que en la actualidad mas de las tres cuartas partes de todas las separaciones
mediante cromatografía de líquidos de alta resolución se llevan a cabo en fase inversa.
La principal ventaja de las separaciones en fase inversa es que el agua se puede utilizar
como fase móvil. El agua es barata, no tóxica, es un solvente transparente a la radiación UV
y compatible con los solutos biológicos.


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