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UNIVERSIDAD NACIONAL MAYOR

DE SAN MARCOS
(Universidad del Perú, DECANA DE
AMÉRICA)

FACULTAD DE FARMACIA Y BIOQUÍMICA


E.A.P. DE FARMACIA Y BIOQUÍMICA

♣ Departamento Académico de Química Básica y Aplicada


♣ Docente : MG Américo Jorge Castro Luna
♣ Curso: Química Orgánica II
♣ Monografía: Cromatografía líquida de alta presión
(HPLC). Aplicación en compuestos orgánicos
♣ Grupo de laboratorio : Viernes
♣ Mesa: 5
♣ Integrantes :
♣ Gonzalo Aire, Gabriel / 08040051
♣ Murga Sulca, Jhonatan Antonio / 08040101
♣ Pérez Guerreo, Fiorella Yahaira / 08040106
♣ Quispe Ollero, Elías / 08040064

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“Todos hacemos uno, todos hacemos
bioquímica, pero somos pocos los que la
practicamos….”

La cooperación es la convicción plena de que nadie puede llegar a la meta si


no llegan todos.

Obviamente, nadie reconoce ser o haber sido un


bioquímico. Sin embargo, estamos seguros gracias a
los documentos supervivientes de los grandes pioneros
Jesucristo (Cuando convirtió agua en vino)

Da Vinci (Mezcló agua y azúcar cuando hacía te)


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RESUMEN

Este trabajo tiene como objetivo fundamental, la aplicación de la


Cromatografía Líquida de Alta Presión (HPLC) en compuestos orgánicos, una
metodología que permite la separación, identificación y cuantificación de los
compuestos orgánicos más complejos. Para lograr el objetivo planteado, la
metodología utiliza la información aportada por un conjunto de revistas y
libros científicos. En cuanto al análisis de la información, se fundamenta en
principio que la cromatografía es un método físico de separación basado en la
distribución de los componentes de una mezcla entre dos fases inmiscibles,
una fija o estacionaria y otra móvil; mientras que por otro lado la
cromatografía líquida consta de una fase móvil que es un líquido que fluye a
través de una columna que contiene a la fase fija. Con el objeto de aumentar
la eficiencia en las separaciones, el tamaño de las partículas de fase fija se fue
disminuyendo hasta el tamaño de los micrones, lo cual generó la necesidad de
utilizar altas presiones para lograr que fluya la fase móvil. De esta manera,
nació la técnica de cromatografía líquida de alta resolución o alta presión
(HPLC).

Dependiendo del tipo de fase fija y del tipo de fenómeno físico que
provoca la separación, la cromatografía líquida de alta resolución puede ser:
Cromatografía de adsorción, Cromatografía de reparto, Cromatografía iónica,
Cromatografía de exclusión por tamaño. Finalmente, se hace mención a la
instrumentación que constituye la Cromatografía Liquida de Alta Presión y se
hacen sugerencias para su correcto empleo en otras investigaciones
similares que se realicen en el futuro.

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Palabras clave: Cromatografía Líquida de Alta Presión,
orgánicos, fases inmiscibles, fase fija, fase móvil, cromatografía
líquida, micrones, Cromatografía de adsorción, Cromatografía de
reparto, Cromatografía iónica, Cromatografía de exclusión.

SUMMARY

This work has as fundamental aim(lens), the application of Alta Presión's


Liquid Chromatography (HPLC) in organic compounds, a methodology that
allows the separation, identification and quantification of them composed
organic more complexes. To achieve the raised aim(lens), the methodology
uses the information contributed by a set of magazines and scientific books.
As for the analysis of the information, there is based at first(in principle) that
the chromatography is a physical method of separation based on the
distribution of the components of a mixture(mixing) between(among) two
immiscible phases, a hinge or stationary and mobile other one; whereas on
the other hand the liquid chromatography is clear of a mobile phase that it is a
liquid that flows across a column that it(he,she) contains to the fixed phase. In
order to increase the efficiency in the separations, the size of the particles of
fixed phase was diminished up to the size of the microns, which generated the
need to use discharges press to achieve that the mobile phase flows. Hereby,
there was born the technology(skill) of liquid chromatography of high
resolution or high pressure (HPLC).

Depending on the type of fixed phase and of the type of physical


phenomenon that provokes the separation, the liquid chromatography of high
resolution can be: Chromatography of adsorption, Chromatography of
distribution, ionic Chromatography, Chromatography of exclusion for size.
Finally, there is mentioned the instrumentaria that constitutes the
Chromatography Liquidates of Alta Presión and suggestions are done for

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his(her,your) correct employment in other similar investigations(researches)
that are realized in the future.

Keywords: Alta Presión's Liquid Chromatography, organic,


immiscible phases, phase fixes, mobile phase, liquid chromatography,
microns, Chromatography of adsorption, Chromatography of
distribution, ionic Chromatography, Chromatography of exclusion.

ÍNDICE

♣ Leyenda…………………………………………………………….Pág. 2
♣ Resumen…………………………………………………………Pág 3
♣ Palabras Claves …………………………………………………. Pág 3
♣ Summary………………………………………………………. Pág. 4
♣ Keywords ……………………………………………………. Pág. 4
♣ Introducción ……………………………………………………Págs.6 - 7
♣ Objetivos……………………………………………………..Pág. 8
♣ Marco teórico ……………………………….……………….Págs. 9- 45
♣ Conclusiones …………………………………..………………Pág. 46
♣ Bibliografía………………………………………………… Págs. 47-48

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INTRODUCCIÓN
La cromatografía es una técnica que permite separar, aislar e identificar
los componentes de una mezcla de compuestos químicos. La muestra es
distribuida entre dos fases inmiscibles (sólida, líquida o gas), una estacionaria
y otra móvil, que se mueven una con respecto de la otra manteniendo un
contacto íntimo, de tal forma que cada uno de los componentes de la mezcla
es selectivamente retenido por la fase estacionaria. Los componentes de la
mezcla a separar invierten un tiempo diferente en recorrer cada una de las
fases, con lo que se produce la separación. Si un componente está la mayor
parte del tiempo en la fase móvil el producto se mueve rápidamente, mientras
que si se encuentra la mayor parte en la fase estacionaria, el producto queda
retenido y su salida es mucho más lenta.

La separación se lleva a efecto en una columna tubular rellena de un sólido


poroso finamente dividido, el cual puede actuar como fase estacionaria
propiamente dicha como soporte de una fase estacionaria líquida. También se
puede efectuar utilizando como fases estacionaria papel de filtro o un sólido
finamente dividido colocado en forma de capa fina sobre una placa de vidrio.
Estos tres tipos de cromatografía se basan en los mismos principios
fundamentales, y se conocen respectivamente como cromatografía en
columna, en papel y de capa fina. En esta cromatografía solo se considerará la
cromatografía en columna.

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La cromatografía es un proceso de separación muy común en ingeniería
química y bioquímica. Es un procedimiento altamente selectivo, capaz de
distinguir y separar componentes con características físicas y químicas muy
similares. Esta técnica se considera importante tanto a nivel de producción
como de análisis.

Desde el siglo pasado las separaciones analíticas se llevaban a cabo por


métodos clásicos como son la precipitación, destilación y extracción. Los
crecientes esfuerzos por conocer más sobre la composición y la función de las
proteínas han obligado a los científicos a buscar técnicas, cada vez, más
precisas.

Para elegir una técnica de separación, además de tener en cuenta los


criterios económicos y de accesibilidad, hay que atender a dos tipos de
consideraciones: unas tienen que ver con las propiedades físicas y
estructurales de las moléculas que se pretende separar, o de las
características de la matriz en que se encuentran; otras se derivan de los
objetivos del análisis (sensibilidad, resolución, tiempo de análisis, necesidad
de una detección específica).

El método de selección incluye los pasos necesarios para la obtención,


preparación y posible fraccionamiento de la muestra, la aplicación de la
técnica analítica adecuada y el tratamiento de los datos obtenidos.

Las técnicas analíticas más empleadas en la actualidad pueden englobarse


en dos grandes grupos: técnicas de separación y técnicas espectroscópicas.
Las técnicas espectroscópicas proporcionan, para cada compuesto analizado,
una información compleja, relacionada con sus características estructurales
específicas, por otro lado las técnicas de separación se utilizan para resolver
los componentes de una mezcla y la señal obtenida puede utilizarse con fines
analíticos cuantitativos o cualitativos.

Actualmente las separaciones analíticas se realizan fundamentalmente por


cromatografía y electroforesis.

La cromatografía no solo permite la separación de los componentes de una


mezcla, sino también su identificación y cuantificación. Se pueden separar
moléculas en función de sus cargas, tamaños y masas moleculares. También a
través de la polaridad de sus enlaces, sus potenciales redox, etc. El análisis
cualitativo está basado en la medida de parámetros cromatográficos (tiempos
y volúmenes de retención) mientras que el análisis cuantitativo está basado

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en la medida de alturas o áreas de picos cromatográficos que se relacionan
con la concentración.

Los métodos cromatográficos se pueden clasificar según la forma en que la


fase móvil y la fase estacionaria se pongan en contacto. Así en la
cromatografía de columna, un tubo estrecho contiene la fase estacionaria a
través de la cual se hace pasar la fase móvil por presión. En la cromatografía
en plano, la fase estacionaria se fija sobre una placa plana o a los intersticios
de un papel; en este caso la fase móvil se desplaza a través de la fase
estacionaria por capilaridad o por gravedad.
Las tres clases de cromatografía desde un ángulo más general son
cromatografía de líquidos, cromatografía de gases y cromatografía de fluidos
supercríticos. Como su nombre lo indica, la fase móvil en las tres técnicas son
líquido, gas y fluido supercrítico respectivamente. En la cromatografía líquida,
la fase móvil es un líquido que fluye a través de una columna que contiene a
la fase fija. Solo la cromatografía de líquidos es la que puede llevarse acabo en
columna o sobre superficies planas, por otra parte tanto la de gas como la de
fluidos supercríticos están restringidas a los procedimientos en columna de tal
manera que las paredes de la columna contienen la fase móvil.
La técnica más usada es la cromatografía líquida de alta resolución
(HPLC), por su sensibilidad, fácil adaptación a las determinaciones
cuantitativas exactas, su idoneidad para la separación de especies no volátiles
y su aplicación a sustancias de primordial interés en la industria, como son los
aminoácidos, proteínas, ácidos nucleicos, hidrocarburos, carbohidratos, entre
otros.

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OBJETIVOS

• Conocer los fundamentos teóricos básicos del HPLC.


• Conocer los componentes del sistema HPLC.
• Advertir los cuidados para el manejo del HPLC.
• Conocer al detalle sus diversas aplicaciones en
compuestos orgánicos.

MARCO TEÓRICO

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Cromatografía Liquida de Alta Performance

ASPECTOS HISTORICOS DEL HPLC

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Aunque procesos parecidos ocurren en la naturaleza cuando disoluciones
pasan a través de arcilla, rocas, etc. La cromatografía como tal adquiere
importancia cuando en 1850 el químico F.F.Runge, que trabajaba con tintas,
descubrió que los cationes orgánicos se separaban por migración cuando se
depositaba una disolución que los contenía sobre un material poroso, como el
papel.

En 1906 el botánico ruso Tswett utilizó la cromatografía en columna para


separar extractos vegetales coloreados, y a este proceso le dio el nombre de
cromatografía. Pero el mayor desarrollo se produce en 1930 con Lederer
cuando consigue separar los colorantes de la yema de huevo. Posteriormente
los químicos Khun, Kamer y Ruzucca desarrollan la cromatografía en el campo
de la Química Orgánica e Inorgánica, y obtienen el premio Nobel por sus
trabajos en 1937, 1938, 1939 respectivamente.

A partir de 1940 los métodos cromatográficos adquieren extensión mundial


de forma que en 1940 Tiselius divide los métodos cromatográficos en
cromatografía por análisis frontal, desarrollo por elución y desarrollo por
desplazamiento, obtuvo el premio Nobel por sus trabajos en 1948.

Al mismo tiempo la cromatografía se aplicaba en el campo de la


bioquímica, y así Martín consigue separar algunos aminoácidos acetilados.

TIPOS DE CROMATOGRAFÍA ….. [9]

En la cromatografía en columna, la fase móvil puede ser un líquido o


un gas, y según el caso se denominan respectivamente “cromatografía
líquida” y “cromatografía de gases “. Esta fase móvil fluye a través del relleno
de la columna, arrastrando los componentes de la mezcla, que son
selectivamente retenidos por al fase estacionaria. EL flujo de la fase móvil se
mantiene constante a través de todo el proceso y de esta manera se logra que
cada componente de la mezcla sea eluído de la columna como un compuesto
puro, disuelto en la fase móvil. A esta técnica se le llama “cromatografía de
elusión”. De acuerdo con la naturaleza de las fases involucradas y con los
mecanismos de separación, es posible distinguir FIG. diferentes
1 - Métodos
tipos de
cromatográficos.
cromatografía, CGS: en
como se indica
cromatografía
la figura 1. gas-
sólido; CGL:
cromatografía gas-
líquido; CLS:
cromatografía líquido-
sólido; CLL:
cromatografía líquido-
líquido; CFQU:
cromatografía de fase
químicamente unida;
CII: cromatografía de
intercambio iónico;
CCF: cromatografía de 11
capa fina; CP:
cromatografía de papel;
Cromatografía de gases y cromatografía líquida de alta presión.

Cromatografía liquida “clásica” y cromatografía liquida de alta


performance

La cromatografía liquida “clásica” se lleva acabo en una columna


generalmente de vidrio, la cual esta rellena con la fase líquida. Luego de
colocar la muestra en la parte superior, se hace fluir la fase móvil a través de
la columna por efecto de la gravedad. Con el objeto de aumentar la eficiencia

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en las separaciones, el tamaño de las partículas de fase fija se fue
disminuyendo hasta el tamaño de los micrones, lo cual genero la necesidad
de utilizar altas presión es para lograr que fluya la fase móvil. De esta manera,
nació la técnica de cromatografía líquida de alta resolución (HPLC), que
requiere de instrumental especial que permita trabajar con las altas presiones
requeridas. Ver figura 2.

VENTAJAS Y DESVENTAJAS DE LA CROMATOGRAFÍA LÍQUIDA DE


ALTA PRESIÓN

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Ventajas Desventajas

-Velocidad de análisis -Instrumentación costosa


-Alta resolución -Difícil análisis cualitativo
-Resultados cuantitativos -No existe detector universal y
-Buena sensibilidad sensible
-Automatización -Elevado costo de operación
-Amplio espectro de -Experiencia indispensable
aplicaciones

Con esta técnica es usual obtener separaciones en minutos e inclusive en


algunos casos en segundos. Por lo tanto se requieren columnas de alta
eficacia y sistemas de bombeo de alta presión, ya que separaciones rápidas
requieren flujos rápidos de fase móvil y esto a su vez requiere presiones
elevadas. Su alta resolución permite obtener y separar mezclas muy
complejas; como algunos fluidos biológicos como la orina humana. Las
muestras naturales son difíciles de manejar, pero con CII y programación de
fase inmóvil la resolución es notable.

Los métodos de HPLC proporcionan muy buena información de tipo


cualitativo, efectuando análisis con precisión del 1%. Los detectores
proporcionan buena sensibilidad y según el tipo de muestra suelen medir
−9
hasta los 10 ng (nanogramos), otros más especializados pueden detectar
cantidades muy pequeñas.

Entre las ventajas de esta técnica, la más importante es la diversidad


de sus aplicaciones tantos a compuestos orgánicos como inorgánicos.
Las únicas muestras no susceptibles de poderse analizar con facilidad son
las gaseosas.
Mediante los instrumentos cromatográficos, la identificación de cada señal de
la muestra a análisis se realiza comparando los tiempos de retención con
valores previamente determinados y la cuantificación se obtiene mediante las
áreas integradas de las señales de acuerdo con el método analítico
seleccionado.

Teniendo en cuenta sus limitaciones, el instrumental es costoso y representa


inversión para los laboratorios. Otra limitación es la necesidad de que el

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personal que utiliza estos métodos tenga experiencia para poder obtener
provecho, lo cual requiere de 6 a 12 meses de experiencias para llegar a ser
operador eficiente.

CLASIFICACIÓN DE LA CROMATOGRAFÍA LÍQUIDA DE ALTA


RESOLUCIÓN (HPLC)

Dependiendo del tipo de fase fija y del tipo de fenómeno físico que provoca
la separación, la cromatografía líquida de alta resolución puede ser:

1) Cromatografía de reparto o CLL

Separa los solutos basándose en la solubilidad.

Formada por CLL y CFQU. Estas técnicas se diferencian en la forma en


que se retiene la fase estacionaria sobre las partículas del soporte
relleno. En el segundo caso, la fase estacionaria se une químicamente a la
superficie del soporte. Esta técnica actualmente es más usada debido a que la
cromatografía CLL necesita de un recubrimiento periódico de las partículas del
soporte debido a la pérdida de la fase estacionaria por disolución en la fase
móvil.

En general, los soportes para casi todos los rellenos de fases unidas
químicamente se preparan con sílice rígida o composiciones donde la sílice es
el elemento básico. Estos sólidos están formados por partículas
mecánicamente resistentes, porosas y uniformes.

Los rellenos de columna en la CFQU se clasifican como de fase inversa


cuando el recubrimiento enlazado tiene carácter no polar, y de fase normal
cuando el recubrimiento contiene grupos funcionales polares.
Este mecanismo de separación se basa en la distinta solubilidad que presenta
una molécula de la muestra en la fase móvil y en la fase estacionaria. De ahí
que los compuestos más solubles en la fase estacionaria sean selectivamente
retenidos por ella en tanto que los menos solubles son transportados más
rápidamente por la fase móvil. Puede utilizarse en la separación de mezclas
edulcorantes artificiales, antioxidantes, bebidas refrescantes entre otras.
El inconveniente de esta técnica es la solubilidad de la fase estacionaria en la
fase móvil y el deterioro de la columna. Esto se puede corregir saturando la
fase móvil con la fase estacionaria por medio de una precolumna que
contenga un alto porcentaje de fase estacionaria. O bien, utilizando materiales
que contengan la fase estacionaria químicamente unida a la superficie de un
soporte (a modo de material de relleno de la columna no suele ser
empleada); esto evita la perdida de fase estacionara y hace innecesario el uso
de precolumnas para saturar la fase móvil.

Esta requiere un control cuidadoso de flujo y de la temperatura para poder


identificar un compuesto determinado en función del tiempo de retención que
es característico del compuesto determinado en las condiciones de flujo y
temperaturas utilizadas.

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2) Cromatografía de fase químicamente unida (CFQU)

Esta técnica surgió como consecuencia de problemas asociados con la CLL.


Dado que su fase estacionaria esta químicamente unida a la superficie de un
soporte, la fase móvil difícilmente produce deterioro alguno en la columna. Si
se varía la naturaleza de los grupos funcionales de la fase
estacionaria es posible obtener diferentes tipos de selectividad.
Dichos grupos pueden ser de naturaleza polar, como el grupo amino y el
grupo nitrilo en el caso de la cromatografía de fase normal, o bien no polar
como el grupo octilo, octadecilo, fenilo, etc.; en el caso de la cromatografía de
fase inversa, ésta tiene innumerables aplicaciones.

Su inconveniente es que en la cantidad de fase estacionaria que es posible


unir a la superficie de un soporte (partículas de sílice), es limitada y como
consecuencia los tamaños de muestra separados en esta columna son
reducidos, por lo común menor de 1 mg.

Este mecanismo de separación es complejo, cuyas características son


similares a la de la CLL y es el más utilizado.

3) Cromatografía de adsorción o CLS

Se basa en la afinidad de adsorción


Es la forma clásica de la cromatografía de líquidos. Ha sufrido algunas
transformaciones que la han convertido en un método importante de la HPLC.

Las únicas fases que se utilizan en este tipo de cromatografía son la sílice y
la alúmina, siendo la primera la preferida.

Es adecuada para compuestos no polares probablemente con masas


moleculares inferiores a 5000. Los métodos de la cromatografía de adsorción y
reparto tienden a ser complementarios, aunque en algunos casos se
superponen.

En general la CLS es más adecuada para muestras que son solubles en


disolventes no polares y por ello tienen solubilidad limitada en disoluciones
acuosas que son las que se utilizan en cromatografía de reparto en fase
inversa. En éste tipo de cromatografía también se pueden separar compuestos
con diferentes grupos funcionales. Una característica particular de este
método es su capacidad para diferenciar compuestos isómeros en mezclas.
El mecanismo de separación de ésta, se basa en la competencia que existe
entre las moléculas de la muestra y de la fase móvil o disolvente por
ocupar los sitios activos en la superficie de un sólido (alúmina y gel
de sílice).

En conclusión, este tipo de cromatografía es muy útil y se aplica a


moléculas de baja o media polaridad.

4) Cromatografía líquida por exclusión o CE

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Separa solutos según el peso molecular

La cromatografía de exclusión, también llamada de filtración en gel o


cromatografía de permeación en gel, se basa en la diferencia de
penetración de las moléculas en los poros de la fase estacionaria
debido a que la separación obtenida depende del tamaño de la
molécula. El tiempo de retención es proporcional al peso molecular de los
mismos, por lo que no es muy usada con los compuestos de alto peso
molecular. Este tipo de separación por tamaño difiere de las demás técnicas
de cromatografía en que no existen interacciones físicas o químicas entre el
analito y la fase estacionaria. Es una técnica reproducible, escalable y rápida.

La fase fija está formada por partículas de sílice que contienen una red
uniforme de poros por los que pueden penetrar las moléculas de pequeño
tamaño. Las moléculas de tamaño grande se excluyen totalmente y son
eluidas en primer lugar, mientras que las de pequeño tamaño tienen acceso a
todo el volumen poroso y son las últimas que se eluyen; de esto se deduce
que el volumen disponible para las moléculas pequeñas es mayor que para las
grandes. Por lo tanto las moléculas se eluyen por su tamaño decreciente.

Los diferentes tipos de partículas usadas deben ser estables: mecánica y


químicamente; tener bajo contenido en grupos iónicos, uniformidad de poro y
tamaño. Hay diferentes tamaños de partícula para un gel: a menor tamaño
mayor resolución y menor gasto en la columna.

Esta técnica se emplea en la separación de proteínas de alimentos,


determinación de glucosa y fructosa en zumos de fruta, etc.

La columna se rellena de un gel, cuyos poros son de tamaño similar al


tamaño de las moléculas de la muestra. Las moléculas pequeñas pueden
penetrar dichos poros y quedan retenidas en tanto que las grandes no. Las
columnas empleadas pueden ser muy largas (varios metros) y esto es
especialmente cierto cuando se desea separar muestras cuyos pesos
moleculares están distribuidos en intervalos muy amplios.

Estas dos variantes en CE: la cromatografía de filtración, emplea materiales


blandos; incapaces de resistir presiones mayores de 4 atm. y es muy aplicada
en el estudio de los biopolímeros y en contraste; la cromatografía de
permeación, emplea materiales de relleno semirígidos o rígidos, y que
pueden resistir presiones muy elevadas. Ambas no implican mecanismos de
separación diferentes y su división se debe a motivos puramente históricos.

Aunque existen excepciones, la eficacia de las columnas de la CE es por lo


general relativamente baja, por lo cual no es frecuente en esta técnica
obtener la separación de compuestos individuales, sino más bien fracciones
de un cierto intervalo de pesos moleculares. El mecanismo de separación es
tal que el tiempo de retención es inversamente proporcional al volumen de las
moléculas en la fase móvil y por lo tanto proporcional al peso molecular; las
moléculas más pequeñas son las que son objeto de una mayor retención en la
columna.

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5) Cromatografía por intercambio iónico o CII

Separa solutos según la carga iónica.

Está basada en la atracción entre iones del soluto y puntos cargados que
existen en la fase estacionaria. En el caso de intercambiadores aniónicos,
grupos cargados positivamente en la fase estacionaria atraen aniones del
soluto. Los intercambiadores catiónicos contienen puntos cargados
negativamente que atraen cationes del soluto.

Los intercambiadores iónicos se clasifican en ácidos o básicos, fuertes o


débiles. Las resinas ácidas fuertes siguen ionizadas incluso en disoluciones
muy ácidas, en cambio las resinas ácidas débiles se protonan a un pH próximo
a 4 y pierden su capacidad de intercambio catiónico. Los grupos muy básicos
de amonio cuaternario siguen siendo catiónicos a cualquier valor de pH. Los
básicos débiles de amonio terciario se desprotonan en disoluciones
moderadamente básicas y pierden entonces su capacidad. Las resinas de
intercambio iónico tienen aplicación de estudios donde intervienen moléculas
pequeñas (PM = 500) que pueden penetrar en los poros pequeños de la
resina. Los intercambiadores iónicos de poliestireno son tan grandes que en
las macromoléculas muy cargadas, como las proteínas, se pueden lanzar
irreversiblemente a ellos. Los de celulosa y dextranos sirven para intercambio
iónico de macromoléculas. Los geles de intercambio iónico se usan en el caso
de moléculas grandes (proteínas y ácidos nucleicos). Cuando las separaciones
exigen condiciones químicas fuertes se emplean intercambiadores iónicos
inorgánicos.

La separación por intercambio iónico se basa en la competencia


entre la fase móvil y la muestra iónica por los sitios o grupos activos
de una resina intercambiadora de iones.

Este tipo de separación se aplica a compuestos de un intervalo de pesos moleculares muy


amplio, y ejemplos característicos de éstos son los péptidos y los aminoácidos. Las columnas son
más largas que las empleadas en otro tipo de cromatografía, esto se basa en la baja eficiencia de los
materiales intercambiadores de iones. La gran variabilidad de los métodos
cromatográficos se debe a las diferentes condiciones que pueden utilizarse
para separar los componentes de una sustancia. Todas estas técnicas tienen
en común la existencia de una fase estacionaria a través de la cual fluye una
fase móvil, así como la presencia de un mecanismo de inyección de la
muestra y un mecanismo de detección de los diferentes componentes
separados.

INSTRUMENTACIÓN

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• Depósito de disolvente
• Bomba
• Puerto de inyección
• Columna
• Detector
• Sistema de Adquisición de Datos

1. Depósito de disolvente … [1]

Los Pantanos de disolvente se utilizan para almacenar a la fase móvil. Las


botellas Scott Duran son comúnmente utilizados como depósitos de
disolvente. El depósito de disolvente debe ser de material inerte como el
vidrio y debe ser lisa, a fin de evitar el crecimiento de microorganismos en sus
paredes. Puede ser transparente o de color ámbar puede ser. Un graduado
botella da una estimación aproximada de la fase móvil por volumen de la
botella. Disolvente embalses se encuentran situados por encima del sistema
de HPLC (a un nivel más alto) en una bandeja. Ellos nunca deben ser
directamente sobre el sistema como cualquier vertido de disolvente en el
sistema puede dañar las piezas electrónicas.

El depósito que mantiene la fase móvil a menudo no es más que una botella
de vidrio. A menudo, el frasco de reactivos que posee nuestro disolvente HPLC
puede ser utilizado como un depósito. Disolvente se entrega del depósito a la
bomba por medio de tubos de teflón - denominada "línea de entrada" a la
bomba. Algunos sistemas como el HPLC tienen compartimentos especiales
para calibrar uno o más reservorios de fase móvil. Los depósitos en estos
sistemas pueden tener funciones adicionales que permiten la fase móvil a
desgasificar y aislados de contacto con el aire.

Los requisitos para un depósito de disolvente son simples:

• El embalse y su anexo a la bomba debe ser de materiales que no


contaminan la fase móvil: teflón, vidrio o acero inoxidable.

• El buque debe tener algún tipo de tapa para evitar la contaminación de


partículas de la fase móvil. Algunos sistemas de LC para esto como
parte del diseño del embalse. Si está usando una botella de disolvente
en un embalse, la parte superior de la botella puede ser envuelto en
papel de aluminio para mantener el polvo o la tapa de la botella puede
ser perforado para permitir la inserción de la línea de entrada a través
de la tapa.

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• No cierre la botella demasiado o eliminación de la fase móvil por la
bomba va a crear un vacío. Esto evita que fluya la fase móvil de la
bomba, la creación de un "bloqueo de vapor" en la bomba

Este "genérico" fase móvil embalse


muestra el principio de los componentes
de la reserva del módulo.

Ejemplos de depósitos de la fase móvil de gama estándar de laboratorio,


tales como vasos o frascos cubiertos con papel de aluminio a través de los
buques más grandes, tales como los medios de comunicación botellas, jarras
disolvente, o Bombonas, a fin de fabricación de vidrio que incluye-en
disposición de agitación y de desgasificación.

2. Bomba HPLC … [2]

Clásica en la cromatografía de columna abierta, la fase móvil fluye a través


de la cama de la columna de embalaje a causa de la gravedad. Esto funciona
(apenas) con partículas de gran tamaño envases (de partículas más grande
que el diámetro 50-100 micras o menos), pero la separación veces puede ser
muy largo. Con el fin de reducir la separación del tiempo y permitiendo la
utilización de envases de menor tamaño de partícula (10 micras y más
adelante), hay que forzar el líquido fase móvil a través de la columna bajo
presión. Esta es la función de la bomba (también llamado el "sistema de
distribución del disolvente"): para mantener un flujo constante de fase móvil,
independientemente de la presión (presión) causada por la resistencia al flujo
de la columna empaquetada.

La mayoría de las bombas de HPLC comerciales se basan en un diseño de


pistones alternativos, como se muestra aquí. Un motor de levas empuja el
pistón hacia atrás y hacia adelante en el cabezal. Un sello flexible alrededor
de la periferia del pistón previene la fuga de la fase móvil en la parte posterior
de la bomba. Comprobar válvulas montado en la cabeza se abren y se cierran
en respuesta a pequeños cambios en la presión para mantener un flujo de
disolvente.
Cilindro de la bomba con sus válvulas de retención a menudo es accesible
desde el exterior para facilitar la prestación de servicios a la comprobación y

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sustitución de válvulas de la bomba focas. Esta parte de la bomba, la bomba
se llama cabeza.

Sección transversal de un
simple diagrama de una sola
bomba de pistones
alternativos

Una sola operación de


la bomba de pistón
reciprocando.

El siguiente diagrama muestra cómo la bomba de flujo varía con el tiempo:

Durante la entrega de un accidente cerebrovascular, aumenta el flujo de cero


hasta un máximo y luego disminuye de nuevo a cero. Durante la admisión, el
flujo es cero. La presión en el interior de la bomba de los cambios de la misma
manera que el flujo - al pasar de cero a un valor máximo, y luego quedarse en
cero durante la ingesta de un accidente cerebrovascular.

El tipo de flujo se muestra arriba, donde los cambios de la tasa de flujo


durante el ciclo de bombeo, provoca pulsos de presión. Impulsos son
indeseables por varias razones:

• que causan problemas de detección

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• que impiden una buena análisis cuantitativo
• dan lugar a principios de la columna fracaso.

La mayoría de las diferencias en las bombas de diferentes fabricantes son


modificaciones para dar mayor flujo uniforme. Un enfoque consiste en
mantener el diseño de un solo pistón, pero para variar la forma de la leva y / o
la velocidad del motor. Esto conduce a un cambio en el flujo como se muestra
a la derecha. La forma de la leva lleva a una más plana la curva de flujo en el
medio de la entrega de un accidente cerebrovascular. Además, el motor se
acelera durante la admisión y se ralentiza durante la entrega de un accidente
cerebrovascular. Algunos pulsación sigue siendo, sin embargo, estas bombas
y con frecuencia usan alguna forma de "pulso de mojado" para reducir aún
más el flujo de las fluctuaciones.

En forma de (no circulares) leva para reducir


al mínimo los pulsos de presión.

Flujo de salida de una cámara con forma de bomba.

Otro enfoque común combina el flujo de salida de dos cabezas que operan
180 grados fuera de fase, de modo que la admisión de una cabeza de entrega
coincide con el trazo de la segunda cabeza. Esto significa que, si bien es un
cilindro de la bomba de llenado del cilindro, el segundo cilindro está
cumpliendo la fase móvil. Entonces, cuando la segunda recarga, proporciona
el primer cilindro. Podemos combinar estas dos corrientes de alimentación de
salida de cada bomba en un té que se conecta con el sistema de CLAR. Ahora,
el flujo combinado de ambos jefes ofrece una apariencia mucho más suave,
menos el flujo pulsante de la LC sistema. La línea de entrada del depósito
también se alimenta a un té que ambas ramas para alimentar a los cilindros
de la bomba. Bomba de pulsaciones se puede reducir aún más especial por
leva formas, variando la velocidad de la bomba de motor, y por el uso de
amortiguadores de pulso.

22
Otro enfoque para la reducción de la bomba de pulsaciones de
mantenimiento de la bomba, mientras que el diseño es bastante simple pistón
bomba Tándem. Un gran y un pequeño pistón / cilindro unidad se combinan
para proporcionar el flujo continuo de fase móvil de la bomba. Si bien el gran
pistón llena, el pequeño pistón ofrece. Cuando se llena el pequeño pistón, el
gran pistón ofrece suficiente fase móvil a la vez llenar el pequeño pistón y
proporcionar un flujo neto de la fase móvil a la LC sistema. Observe que

sólo tres válvulas de retención son necesarias para esta bomba y


cuatro válvulas de retención para una convencional de dos bombas
de pistones.

Un tándem-bomba a pistón proporciona un flujo continuo de


salida.

La mayoría de las bombas de LC (incluso aquellos con múltiples cabezas)


tienen algunas pulsaciones en el flujo de la bomba de salida. Esto es a
menudo suavizadas por el uso de un amortiguador de impulsos. Estos
dispositivos suelen consistir en una bobina de flexibles de acero inoxidable
tubo. Cuando la presión sube (como resultado del flujo de pulsación), el tubo
se extiende y aumenta su volumen de manera que el flujo adicional de la
bomba en este momento está alojado por el extra volumen del pulso
amortiguador. Cuando la presión disminuye, el volumen disminuye la tubería,
con el extra de disolvente va a compensar el flujo de déficit. En efecto, el
pulso actúa como un amortiguador hidráulico "amortiguador" para suavizar el
flujo pulsante

3. Puerto de inyección .. [3]

La muestra la introducción de dispositivos tales como inyector para


introducir la muestra en un flujo de fase móvil a alta presión. No es posible
utilizar la jeringa de inyección directa en la columna como la GC como la
presión de entrada en LC es demasiado alta. La válvula de inyección fija o
variable a través de bucle es una forma común de introducir la muestra. La
válvula Rheodyne es el más utilizado concebir. El bucle puede ser parcial o

23
completamente lleno. Hay dos tipos de inyectores de la disposición. La
ventaja de llenado parcial es la posibilidad de utilizar pequeñas cantidades de
muestra, cuando hay escasez de la muestra. La precisión de la inyección es
de 1% de RSD y de compensación de remanentes <1%.

Inyectores para la CLAR

Las muestras se inyectan en el HPLC a través de un puerto de inyección. La


inyección de un puerto CLAR comúnmente se compone de una válvula de
inyección y la muestra de bucle. La muestra suele ser disuelto en la fase
móvil antes de la inyección en bucle de la muestra. La muestra se estableció,
en una jeringa y se inyecta en el bucle a través de la válvula de inyección.
Una rotación del rotor de la válvula se cierra la válvula y se abre el bucle con
el fin de inyectar la muestra en el flujo de la fase móvil. Volúmenes de circuito
puede variar entre 10 μl a más de 500 μl. En los modernos sistemas de HPLC,
la inyección de la muestra es típicamente automatizada.

Parar el flujo de inyección es un método que la bomba está apagada


inyección permitiendo que el puerto para alcanzar la presión atmosférica. La
jeringa que contiene la muestra se inyecta en la válvula de la manera
habitual, y la bomba está encendida. Para jeringa tipo y bombas de
reciprocidad, el flujo en la columna pueden ser llevados a cero y se reanuda
con rapidez por el desvío de la fase móvil por medio de una válvula de tres
vías situada delante de la inyección. Este método puede ser usado hasta muy
altas presiones

4. Columna HPLC … [4]

Es el corazón del sistema cromatográfico, en ella se produce la retención de


los diferentes compuestos que permite su separación.

24
5. Tubos y Accesorios

Hasta ahora no hemos hablado de la manguera y los accesorios que se


conectan nuestros diversos módulos LC juntos. Para tubos de las conexiones
entre el depósito y la bomba y del inyector, el único requisito es que los
accesorios no de fugas, y que la tubería entre el depósito y la bomba de ser lo
suficientemente grande en el diámetro para que el flujo de la fase móvil a la
bomba no se limita. El tubo de conexión entre el inyector y la columna, y de
la columna al detector, sin embargo, requieren más atención.

Las conexiones entre el depósito y la bomba se suele hacer con tubo de


teflón, a menudo bastante amplio de la cavidad. Conexiones de abajo de la
bomba son generalmente realizadas con acero inoxidable o PEEK (poli éter
éter cetona) tubo. Conexiones entre el inyector y la columna-columna-
detector debe hacerse de tubo de diámetro estrecho (0,010 "id o menos) con
el fin de minimizar el volumen muerto.

Esta parte del sistema de LC debe ser cuidadosamente diseñado y


construidos para reducir al mínimo el volumen de la tubería y accesorios.
Nosotros decimos que tenemos que eliminar el volumen muerto en la mayor
medida posible. Así que tenemos que mantener el tubo de corta duración, y
que por lo general el uso de tubos de diámetro muy estrecho: 0.010 pulgadas
de diámetro interno (o "diez milésimas") es el tubo de tamaño normal para
esta parte del sistema (tubos pequeños puedan ser necesarios para su uso

25
con "microbore" columnas; tubos más grandes sólo deben utilizarse con
preparativa columnas

Hablemos acerca de los próximos accesorios utilizados en LC. Estos se


denominan accesorios de compresión y su diseño se ilustra a continuación.

Un pedazo de tubo es la primera equipada con un ferrul avellanas y como se


muestra en la derecha. Para este fin de conectar el tubo con otro montaje (la
columna final, una T, conector, etc) por primera vez, sólo tornillo en la tuerca
de la instalación. Tenga cuidado de no a la instalación en exceso.

Generalmente la tuerca debe apretarse dedo de la mano firme y, a


continuación, un 3 / 4 de una vuelta (270 grados en sentido horario) con una
llave.

Al volver a una instalación existente (al cambiar las columnas, por ejemplo),
la tuerca debe apretarse el dedo apretado y, a continuación, snugged
ligeramente con una llave para evitar fugas.

Instalación estándar de compresión utilizada en HPLC.

Lamentablemente, no todas las piezas son intercambiables. Este es un gran


dolor de cabeza para la mayoría de los trabajadores LC, pero tenemos que
vivir con ella por el momento. Normalmente coincide piezas parecen
funcionar, y esto hace la situación aún peor. Esto es, las piezas se parecen ir
de la mano de la forma habitual. No obstante coincide accesorios no funciona
correctamente. La razón es que la principal diferencia en estas instalaciones
es la distancia entre el tubo y la virola final, como se muestra en la derecha.

26
Nota la diferencia en la distancia desde la parte inferior de la virola hasta el
final del tubo en estos tres extremos del tubo montado con los accesorios de
diferentes fabricantes.

Los accesorios para los extremos de la columna son similares a tubos de


accesorios. Una virola y tuerca en la columna celebrar la columna en el
montaje final - al igual que la tubería se conecta juntos. Debido a que la
columna está llena de pequeñas partículas de la columna de embalaje, es
necesario tener una forma de mantener estas partículas en la columna. Esto
se suele lograr con un fritas - un pequeño, moneda en forma de pieza de
metal sinterizado tener estrechos poros. La mayor parte de las columnas
fritas son nominalmente de 2 micras de porosidad, aunque más pequeñas
fritas (0,5 micrones) se usan para las columnas de partículas muy pequeñas
(3-micrones de diámetro).

27
Si se desconecta la columna final del montaje, podemos ver las fritas en la
parte superior de la columna. Este fritas pueden ser removidos y
reemplazados con un nuevo fritas si se convierte en la antigua fritas
conectado. Sin embargo, si hacemos esto, tenemos que ser muy cuidadoso.
Si la columna de embalaje en la entrada se ve perturbado, podría arruinar la
columna permanente.

6. Detectores de HPLC … [5]

El detector mide la concentración de la muestra, ya que bandas de la


columna y dejar pasar por el detector de flujo de células. Cuando no es la
banda que pasa por el detector, una constante de la señal se registra -
llamada la línea de base del cromatograma o detector. Cuando una muestra
llega a la banda del detector, el detector responde a la diferencia en la fase
móvil propiedades causados por la presencia de la muestra compuesta, dando
lugar a un cambio en la señal del detector, considerado como un pico.

28
¿Cómo funciona el Detector de trabajo? En la mayoría de los casos
que vamos a utilizar un detector fotométrico, comúnmente llamado detector
de UV. En su forma más simple, se trata de una fuente de luz, una celda de
flujo (o "muestra de células"), y un sensor de luz, como se muestra en la
derecha

Diagrama esquemático simplificado de un detector de UV.

Cuando no se muestra fluye a través del detector, la luz pasa a través de la


célula de flujo máximo y genera una señal en el sensor de luz. Si una muestra
de la banda entra en el detector, la muestra se reduce la cantidad de luz
alcance el sensor y provoca un cambio en la señal del detector. Esta señal
está invertida electrónicamente por el sistema de datos resultante de la
aparición de un pico en el cromatograma. La señal muestra aumenta en
proporción a la concentración de la muestra en la celda de flujo. El detector
también responder a otros cambios en el contenido de la celda de flujo. Por
ejemplo, si las partículas o "polvo" se encuentran atrapados dentro de la celda
de flujo, estos se interrumpa el paso de la luz a través de la célula de flujo y
causa un cambio en la línea de base. O una burbuja de aire puede ser
atrapado en la celda de flujo, causando un gran cambio en la cantidad de luz
de paso. En este caso, la señal puede pasar completamente fuera de escala
y, a continuación, volver a la base de referencia si la burbuja pasa a través de
la célula.

Dos tipos de detectores de radiación UV se utilizan hoy en día:

• De longitud de onda variable (a veces llamado "espectrofotométrico"


detectores de
• Fotodiodo Array (a veces simplemente llamada "red de diodos"
detectores.

Los De longitud de onda variable detectores son menos costosos, son el tipo
de detector de nivel de análisis cuantitativos y ensayos de rutina. Los de
Fotodiodo gama son más versátiles, porque permiten la adquisición
simultánea de ambos y de cromatografía de información espectral, que se
utilizan habitualmente en el método de desarrollo.

El detector de longitud de onda es una característica importante de una


separación por HPLC. Como regla general, la longitud de onda se ajusta a la
máxima absorbancia del analito. Uso de la longitud de onda equivocado

29
puede resultar en disminución de tamaño de pico, o incluso no en todos los
picos

Debido a los diferentes compuestos pueden tener diferentes espectros de


absorción, una comparación cuantitativa de los diferentes picos en el
cromatograma mismo puede ser engañosa. Una pequeña cantidad de un
compuesto que absorbe fuertemente en el detector de longitud de onda
puede dar un pico más grande que una gran cantidad de una absorción
deficiente. Cuantificación fiable, una calibración debe llevarse a cabo con un
conocimiento exacto de la cantidad de compuestos que se van a analizar.

El Detector de rayos UV de longitud de onda variable utiliza un


monocromador (aberturas y una rejilla) para seleccionar una
longitud de onda de la luz para pasar a través de la muestra de
células.

La matriz de detectores de fotodiodo pasa


todas las longitudes de onda de la luz a través
de la muestra de células y, a continuación, se
centra cada longitud de onda en un único
sensor de elemento.

Hay una serie de otros controles o ajustes para el


detector, que pueden ser incorporadas en el propio
detector, o pueden ser parte del sistema de datos:
El tamaño de todos los picos en el cromatograma puede
cambiarse usando el atenuador o ajustes de gama. La
atenuación de la escala por lo general se refiere al
tamaño de un pico que aparecerá como un pico de
escala completa en la pantalla. Esta escala se mide en
unidades de absorbancia (que es proporcional a la
concentración de la muestra), que se expresa a menudo

30
como "Unidades de Absorbancia escala completa" (AUFS). La figura de la
derecha ilustra el efecto de un cambio en la atenuación. Como el ajuste es el
aumento de la atenuación (AUFS se reduce), se convierte en el detector más
sensible, y todos los picos de aumento de tamaño
En muchos sistemas, el rango o la atenuación se puede establecer ya sea en
el detector o en el propio sistema de datos. Si la atenuación o la gama se
encuentra en el sistema de datos, por lo general afecta sólo a la pantalla. No
cambia la forma de cuantificación se lleva a cabo porque no cambia la
información presentada en el sistema de datos. Si la atenuación o la gama se
sitúa en el propio detector sin embargo, es posible que el gran tamaño de los
picos puede superar las capacidades de los datos del sistema
Otro ajuste es el detector de Base Cero (a veces llamado el "Cero offset").
Mover este ajuste (que se muestra a la derecha) se limita a desplazar la
totalidad del cromatograma arriba o hacia abajo en la pantalla. Al igual que
con la atenuación de configuración, si se ajusta el cero en el sistema de datos,
que sólo afecta a la pantalla; cuantificación se mantiene sin cambios. Si la
línea de base cero se cambia en el detector en sí, la integración puede verse
comprometido si la base de referencia se compensa suficientemente bajo para
enviar una señal de voltaje negativo a los datos del sistema (la mayoría de los
sistemas de datos sólo puede tratar con señales de voltaje positivo).

Diversos tipos de detectores de HPLC

Existen varios detectores disponibles en el mercado. Sin embargo detector


UV-VIS, Foto-detector por red de diodos, detectores de fluorescencia, y
Conducta métricas coulometric detector son más comúnmente utilizados. El
nuevo detector de ELSD está demostrando ser importante detector, mientras
que la MS como detector es sobresaliente.

31
HPLC, Detector RI UV / VIS Fluor MS
de
Respuesta Universal Selectiva Selectiva Selectiva

Sensibilidad 4 microgramos 5 nanogramos 3 picogramo 1


picogramo
Rango lineal 10 10 10 10
Flujo sensibles Sí No No Sí
Temp. Sensible Sí No No No

7. HPLC Data Systems .. [6]

Un sistema de cromatografía de datos es básicamente un equipo que ejecuta


software especializado diseñado para integrar y picos cromatográficos
corresponden altura o área del pico a la cantidad de analito presente en la
base de datos de calibración. En muchos casos, el software incluirá la base de
datos y estadística adicional para mejorar la capacidad de análisis, el
almacenamiento y la presentación de la información.

En su forma más fundamental, un cromatograma es simplemente un registro


de la parcela o una señal de tensión en función del tiempo. En un buen
funcionamiento del detector de UV (por ejemplo), este voltaje es directamente
proporcional a la absorbancia de los efluentes en el detector de celda.

Detectores diferentes y su comparación

Suponiendo que la cerveza tiene el derecho-Lambert, esta absorbancia será


directamente proporcional a la concentración de la absorción de las especies
(el analito), lo que significa que el cromatograma es (indirectamente) una
parcela de muestra de la concentración frente al tiempo. Suponiendo que la
fase móvil a través del detector de flujo es constante, el volumen de la fase
móvil se bombea directamente proporcional al tiempo transcurrido. Por lo
tanto, es el cromatograma (más indirectamente) una representación de la
concentración frente al volumen. Medir el área bajo el pico asciende a medir
el producto de la concentración veces el volumen, que es proporcional a la
masa (o moles) del analito.

El término "integración" se refiere al proceso de medición de la zona


comprendida en virtud de un pico cromatográfico. Esto se logra mediante la
adición de la tensión de las mediciones efectuadas en la igualdad de los
intervalos de tiempo entre el inicio y el final de la cumbre, y luego restando
una "corrección trapezoidal" para corregir el desplazamiento de la
cromatografía de referencia a partir del verdadero cero de referencia, así
como la deriva.

32
APLICACIONES

La cromatografía líquida de alta presión a pesar de ser una técnica


relativamente nueva, se cuenta que describe numerosas aplicaciones en
la literatura química. En la mayoría de los casos, éstas consisten en
determinaciones de sustancias cuyo análisis por otra técnica
cromatográfica resulta muy difícil. Estos resultados comprenden:

 Compuestos iónicos: como aminoácidos, sales inorgánicas,


ácidos orgánicos, etc.
 Compuestos de alto peso molecular: como polímeros,
hidrocarburos polinucleares, productos naturales, etc.
 Compuestos termolábiles y no volátiles: como vitaminas,
pesticidas, esteroides, plastificantes, drogas y un producto muy
grande de otros productos farmacéuticos.

En los problemas relacionados con la contaminación ambiental, la HPLC


se utiliza para la contaminación de algunos pesticidas (insecticidas,
larvicidas, hervicidas, etc.). También es posible la determinación de
hidrocarburos aromáticos polinucleares que son contaminantes
atmosféricos muy importantes

33
En cromatografía líquida el análisis de compuestos vitamínicos es
posible en corto tiempo.

El análisis de medicamentos es también una aplicación muy interesante,


la determinación de los componentes activos de una tableta analgésica.
También el análisis de barbitúricos, anticonceptivos, etc. [9]

1. DETERMINACIÓN DE VITAMINA A EN ALIMENTOS


INFANTILES INSTANTÁNEOS POR CROMATOGRAFÍA
LÍQUIDA DE ALTO RENDIMIENTO (HPLC)

INTRODUCCIÓN

Con la finalidad de controlar la calidad de alimentos infantiles


instantáneos se efectuó la validación de la metodología para la
determinación de la vitamina A por cromatografía líquida de alto
rendimiento (HPLC). Con los resultados obtenidos se demostró que el
método en estudio es preciso, exacto, lineal y altamente sensible para
ser utilizado en el control de calidad de dichos alimentos.

Como sabemos la Vitamina A es el nombre genérico utilizado para


describir al retinol, sus ésteres y los
correspondientes isómeros.

La vitamina A no es más que un


alcohol poliénico isoprenoide que se
conoce también con otros nombres
como axeroftol, biosterol, vitamina
antixeroftálmica y vitamina antiinfecciosa.
Vitamina A

 Del retinol derivan por oxidación el retinal y el ácido retinoico.

 El 11-cis-retinal juega un papel decisivo en el proceso visual.

 En los vegetales y en algunos organismos marinos, encontramos a


la vitamina A como provitamina A en la forma de ß caroteno,
pigmento amarillo constituido por dos moléculas de retinal unidas
en el extremo aldehído de sus cadenas carbonadas.[7]

34
Ácido
Dentro de las principales B Caroteno
funciones de la vitamina A encontramos la
Retinoioo
protección de la piel y su intervención en el proceso de visión de la
retina. También participa en la elaboración de enzimas en el hígado y de
hormonas sexuales y suprarrenales. El déficit de vitamina A produce
ceguera nocturna, sequedad en los ojos y en la piel, y afecciones
diversas de las mucosas.
Mientras que por otro lado el exceso de este puede provocar
alteraciones óseas y hemorragias en diversos tejidos.

La vitamina A se encuentra principalmente en productos lácteos,


mantequilla, queso, huevos, carne, hígado y aceite de hígado de
bacalao.

Se destruye fácilmente por la acción de la luz, con temperaturas


elevadas.

DETERMINACIÓN DE LA VITAMINA A

Los método espectrofotométrico y fotométrico empleados en la


determinación de la vitamina A están expuestos a interferencias de
algunas sustancias como la presencia de los carotenos, derivados y
productos de descomposición de la vitamina A que de alguna forma
podrían absorber luz en la región ultravioleta o dar colores similares con
los reactivos utilizados en la determinación fotométrica. Por ello estos
métodos no son lo suficientemente específicos para determinar esta
vitamina, agregado que la confiabilidad de sus resultados
dependenderán del éxito en los pasos de purificación y los
procedimientos de trabajo.

En ese sentido, y buscando una óptima metodología de análisis, en el


presente estudio se realizó la validación de la metodología por HPLC
para la determinación de vitamina A contenida en alimentos infantiles
instantáneos.

MATERIALES Y METODOS

35
A. EQUIPO

 Equipo de cromatografía líquida de alto rendimiento (HPLC),


de marca Shimadzu, modelo LC10A.
 Inyector automático.
 Bomba con sistema de degasificación.
 Integrador o sistema de registro
 Software para el procesado de datos cromatográficos.
 Detector de arreglo de diodos (longitud de onda variable).
 Columna cromatográfica de acero inoxidable LC-18 para fase
reversa (25 cm. x 4,6 mm de diámetro interno, 5mm de
diámetro de partícula, con columna de cartucho C18 de
marca Supelco)

B. CONDICIONES DE OPERACIÓN

 Sistema isocrático
 Flujo 1,2 mL/min
 Volumen de inyección
20ml
 Detección UV 242 nm
 Temperatura de horno
 Ambiente
 Tiempo de corrida 7
min
 Fase móvil: metanol al
100% grado HPLC.

C. REACTIVOS

 Metanol grado HPLC ( Merk)


 Estándar all-trans Retinol: Vitamina A (Sigma)
 Hexano p.a. (Merck)
 Etanol absoluto p.a. (Merk)
 Solución de hidróxido de potasio al 50%
 BHT ó Acido Ascórbico (antioxidantes)
 Agua tridestilada o grado HPLC
 Solución stock estándar de vitamina A: Se disolvieron 100
mg del estándar en 100 mL de etanol absoluto, con
aproximadamente 0,002 g de BHT, y se guardó la solución
en congelación (-20° C)

36
D. PROCEDIMIENTO

 Se pesaron 20 g de la muestra de alimento infantil un


recipiente de base plana y se adicionó 70 mL de etanol
absoluto. Ambas mezclas se colocaron en los tubos de reflujo
y se agitó hasta su ebullición con corriente de nitrógeno.
 Luego, se adicionó 20 mL de solución de KOH al 50%
saponificando la mezcla por 30 minutos con agitación
moderada. Antes de finalizar esta etapa se enjuagó el
contenido con 50 mL de agua en 3 porciones.
 La solución se enfrió a temperatura ambiente y luego se
filtró al vacío, colocándose rápidamente el contenido en un
embudo de decantación de 250 mL al cual se le adicionó 50
mL de hexano p.a. para proceder a la extracción.
 Se agitó la mezcla por 20 segundos y al separarse se
evidenció la formación de la fase orgánica (en la parte
superior), el cual se transvasó a un balón de 250 mL de base
redonda que contenía aproximadamente 0,5 g de BHT ó
ácido ascórbico. Se efectuó dos veces más la extracción y se
juntaron los extractos en el balón de 250 mL.
 Se evaporó a sequedad el solvente, haciendo uso de un
rotavapor con baño de agua a 40°C.
 Se diluyó inmediatamente con metanol grado HPLC el
residuo, y se llevó a volumen en un matraz volumétrico de
10 mL.
 Finalmente, se pasó la solución final por un filtro de 0,2mm,
llenándolos en viales ámbar de 2 mL para colocarlos en el
inyector del cromatógrafo.

E. CÁLCULOS

Concentración de Vitamina A ( mg/g ó ppm ) = Am x Cs x D


As Wm

Donde:
Am (Area del pico de vitamina A en la muestra)
As (Area del pico de vitamina A en el estándar)
Cs (Concentración de vitamina A en el estándar, mg/ml)
D (Factor de dilución)
Wm (Peso de la muestra, g)

37
F. RESULTADOS

En la Figura 1 podemos observar los cromatogramas representativos


de dos concentraciones (una
mayor y otra menor) de
vitamina A para la curva de
calibración. El tiempo de
retención de la vitamina A fue
3,91 ± 0,5 min., siendo el
tiempo total de análisis para
una muestra de 7 min.

La respuesta de detección fue


lineal en el rango de
concentraciones de 5 – 15
mg/g (Figura 2), obteniéndose
un coeficiente de correlación
r=0,99. El límite de detección
del método en base a la señal /
ruido (S/N) fue de 0,06 mg/g y
el límite de cuantificación de 0,58 mg/g. El perfil de la precisión que
se obtuvo en 16 determinaciones por analista en dos días diferentes,
fue: CV de repetibilidad de 3,09% para el analista A, y 2,25% para el
analista B vs. en tanto, el método oficial de la AOAC

(CV de 3,62%); el CV de
reproducibilidad fue
2,70 % vs. el obtenido
por el método oficial (de
9,72%).
Los resultados de la
precisión del sistema,
basados en la variación
del tiempo de retención,
área y altura; se
muestran en la Tabla 1.
La recuperación
obtenida fue de 97,98%
Vs. la obtenida por el método oficial de la AOAC (de 98,8%).

38
La especificidad del método se muestra en la Figura3, donde se
observa la ausencia de interferencias debido a la adecuada
extracción del analito, y además se muestra la comparación del
espectro del estándar puro vs. el espectro del analito en la muestra.

G. DISCUSIÓN

Esta metodología propuesta para la determinación de la vitamina A


por HPLC tiene la ventaja de que el tratamiento de la muestra se
realiza en menos tiempo, en relación al método oficial de la AOAC
992.06 VitaminaA (Retinol) in Milk-Based Infant Formula. Además, la
columna que se utiliza en el método propuesto (C18) es más
comercial que la columna del método de la AOAC (ciano), ya que esta
última trabaja en fase normal siendo, por tanto, más difícil de
controlar y por la naturaleza no polar del extracto, se debe usar
cromatografía en fase reversa.

El tiempo de corrida en esta metodología es más corto (7 minutos),


comparado con el método oficial que es de 10 minutos. Estas
características contribuyen al menor costo del análisis. Es necesario
tener presente que tanto la saponificación, la isomerización y la
ruptura de la vitamina A son retardadas por la adición del
antioxidante (ácido ascórbico) y el uso de nitrógeno, el cual interfiere
con los agentes de oxidación presentes. Asimismo, el retinol y sus
ésteres son rápidamente destruidos por la luz, el oxígeno y los ácidos,

39
por lo que deben almacenarse en frascos ámbar o cubiertos con
papel platino o su equivalente.
La muestra y el extracto de la muestra deben protegerse de la luz y
la oxidación, evitándose la luz solar directa y la luz brillante. La
iluminación artificial es mejor proporcionada por tubos fluorescentes
dorados ó equivalentes. En ciertos casos, las diferentes etapas en el
procedimiento deberían realizarse en material de vidrio ámbar para
prevenir la degradación.
Dado que el calor también contribuye a la isomerización o a una
posterior alteración de las vitaminas, debería evitarse el calor
innecesario. Por lo tanto, debe tenerse cuidado que, por ejemplo, la
evaporación de los solventes se realice lo más suave posible
utilizando un evaporador
rotatorio, con un buen control de la temperatura, un enfriamiento
adecuado de los condensadores y un vacío óptimo. [8]

H. CONCLUSIÓN

 De acuerdo a los resultados obtenidos, podemos concluir que


el Método de ensayo CENAN-DQ.ME.16: Método para la
Determinación de Vitamina A (retinol) en alimentos infantiles
instantáneos por HPLC es preciso, exacto, específico y
sensible para los parámetros evaluados en este estudio, ya
que se encuentran dentro de los rangos establecidos.

2. ANALISIS COMPARATIVO POR CCD Y HPLC DE


ALCALOIDES PRESENTES EN PRODUCTOS COMERCIALES A
BASE DE “UÑA DE GATO”

40
INTRODUCCIÓN

En el presente trabajo se realizó el análisis comparativo de 10 muestras


comerciales de “uña de gato”, por Cromatografía de Capa delgada
(CCD) y por Cromatografía Líquida de Alta Resolución (HPLC),
observándose la presencia de los alcaloides oxindólicos con el mismo
perfil cromatográfico que la muestra patrón. Se determinó el contenido
de alcaloides totales por HPLC comparando la concentración de
alcaloides ingeridos por el usuario de acuerdo a las dosis recomendadas
por los fabricantes.

La Uncaria tomentosa (Willd) DC (Rubiaceae) conocida comúnmente


como “uña de gato” al igual que la Uncaria guianenis contienen una
diversidad de compuestos, incluyendo alcaloides tetracíclicos y
pentacíclicos, glicósidos triterpénicos, esteroles, flavonoides y
procianidinas.

MATERIALES Y MÉTODOS

Análisis por CCD Análisis por HPLC

 Diclorometano  Agua
 Cloroformo  Acetonitrilo
 Acetato de etilo  Metanol
 Cromatofolio de  Fosfato básico de
Silicagel 60 F254 potasio
(Merck) (20 x10)  Fosfato dibásico de
sodio anhídrido

 Las muestras analizadas fueron adquiridas en el


mercado local, y las contra muestras se depositaron
en el laboratorio (M1 a M10, todas cápsulas excepto
M7 que es comprimido).

 Los estándares Mitrafilina, Peropodina e


Isopteropodina fueron aislados en el laboratorio, su
identidad y pureza fueron confirmadas por métodos
cromatográficos (CCD, HPLC), comparadas con

41
muestra de referencia, y por los datos
publicados.[10]

PREPARACIÓN DE LA MUESTRA

Análisis por CCD


 Los productos
 Los productos comerciales deben
comerciales deben estar finamente
estar previamente molidos.
molido.  250mg del producto
 1g de cada producto comercial fueron
comercial se extraído por 5 veces
humedece con con 5 ml del sistema
NH4OH al 10%. extractante
 Extraer con 5ml de Metanol:Agua:Ácido
diclorometano. clorhídrico 1.2 M
 Secar con Sulfato de (50:50:1) por
sodio anhídrido. sonificación durante
 Aplicar 25 ml de la 15 min.
muestra.  Filtrar los extractos.
 Combinar con 25 ml
de la solución
extractante.
 Tomar una parte de
la solución muestra y
agregar con cuatro
parte del buffer
fosfato.
Análisis por HPLC

CALIBRACIÓN

2.00 mg de isopteropodina estándar fue disuelto en 50 ml


de Metanol, a partir de l cual se prepararon las soluciones
diluidas en un rango de concentración de 0.5 a
20.00mg/ml. La curva de calibración se realizó por
triplicado. Se observó linealidad de respuesta del detector
en el rango mencionado, con un factor de correlación (R2)
de 0.99827.

42
MÉTODO ANALÍTICO

Análisis por CCD

 Se llevó a cabo por


comparación con los
estándares
Mitrafilina (MI),
Isopteropodina (IP) y
Pteropodina (P). El
sistema de elusión
fue CHCl3:EtOAc en Análisis por HPLC
las proporciones 8:2,
7:3, y 6:4;  Fueron realizados e
desarrollados en un equipo Merck –
forma consecutiva. Hitachi, sistema
Se revelaron con la HPLC LaChrom-700,
luz UV a 254 nm y equipado con un
reactivo de detector de arreglo
Dragendorff. de fotodiodos (Merck
– Hitachi L – 7450
a). Para todas las

43
separaciones se y fueron aplicado
trabajó con una 20ml de cada
columna Ultrasphere muestra. Todas las
ODS (Beckman, separaciones se
150X4.6 mm, 4mm) llevaron a 30ºC. Los
y guarda – columna picos fueron
(ODS). La fase móvil asignados por
consistió de superposición con las
Acetonitrilo(A) y de muestras estándares
un buffer fosfato y por comparación
10nM (B) ajustado a con los tiempos de
p H 7.0, en la retención y espectros
longitud de UV.
detección a 245 nm

RESULTADOS

Análisis por CCD buena resolución de


los alcaloides
 Para el análisis por Mitrafilina (Rf=0.35),
CCD, los Pteropodina
cromatofolios fueron (Rf=0.65) e
revelados por luz UV Isopteropodina
254 nm y reactivo de (Rf=0.74),
Dragendorff. Con los permitiendo la
sistemas de elusión identificación
se ha obtenidos muy

44
inequívoca de éstos
por CCD.

Análisis por HPLC

 Los cromatogramas
de una muestra de
Uncaria tomentosa
estándar y de una de
las muestra
analizadas (M6). Los
alcaloides pudieron
ser separados con
una resolución no
menor del 90% para
la isopteropodina y
el alcaloide 4, a una
temperatura de 30ºC
en un tiempo de
30min.

45
 El límite de detección encontrado fue de 0.07 mg/ml para
el compuesto estándar Isopteropodina.
 Para la extracción de los alcaloides se ha evitado el uso de
ácido-base, pues está comprobado que produce su
isomerización. La extracción con solución extractante por 5
veces por sonificación cada vez, asegura una extracción
total de los alcaloides
3. DETERMINACION DE TOCOFEROLES POR HPLC EN
ACEITE DE QUINUA (Chenopodiun quinoa) Y KAÑIWA
(Chenopodium pallidicaule)

INTRODUCCIÓN

El siguiente trabajo tiene como investigación la caracterización


de la fracción lipídica de la quinua y kañiwa.
La quinua y la kañiwa, son cultivos andinos muy poco
estudiados pero que sin embargo nos muestran que son
alimentos ricos en proteínas con un buen balance aminoacídico.
Con el objetivo de determinar el contenido de tocoferol en estos
aceites se analizaron especialmente a y g tocoferoles. Los
aceites vegetales son ricos en Vitamina E La forma mas
abundante y potente de la Vitamina E es el alfa-tocoferol.
El beta-tocoferol, ganma-tocoferol y delta-tocoferol tienen
también poder vitamínico y se encuentran, junto con el alfa-
tocoferol en los aceites vegetales. Los aceites más ricos en
tocoferoles son los aceites de germen seguido del aceite de
soya.
Sus efectos en el hombre es el de disminuir la tasa de colesterol
en la sangre [11]
Entre los tocoferoles, el alfa-tocoferol tiene la actividad
vitamínica E más elevada y la menor actividad antioxidante. Las
actividades antioxidantes de otros tocoferoles en orden
decreciente son: delta, beta o ganma, y alfa.

La mezcla de isómeros del tocoferol como el alfa-tocoferol son


aditivos para mejorar el efecto antioxidante en alimentos. [12]

La cromatografía líquida de alta resolución (HPLC) ha sido


empleada para determinar tocoferoles en los aceites vegetales.
En los últimos años, la introducción de la cromatografía líquida
de alta presión, juntamente con la detección por fluorescencia,
permiten una determinación más precisa.

MATERIALES Y METODOS

A. ESTANDARES

47
 Tocoferol pureza 99.9% preparada a una
concentración de 40ppm en hexano.
 Tocoferol pureza de 99.9 % preparada a una
concentración de 40ppm en hexano.

B. MUESTRA

 Aceite crudo de quinua


 Aceite de kañiwa

C. CONDICIONES

 Columna: C18 de fase reversa


 El método consiste en una gradiente lineal y
gradiente isocrático siendo:

 Solvente A: Metanol
 Solvente B: Acetato de etilo
 Velocidad de flujo de la fase móvil: 1,5 mL/min
 Detector: Espectrómetro de Fluorescencia.

D. TECNICA ANALÍTICA

 Los 5 ml de las muestras de aceite en 100 mL de


hexano.

E. RESULTADO

Los cromatogramas obtenidos durante la corrida por HPLC para


el los aceites de quinua, kañiwa y el estándar se muestran en
las figuras 1,2 y 3 respectivamente.

De acuerdo a la concentración del estándar y a el área de los


picos, las concentraciones de a y g tocoferol en cada uno de los
aceites fueron los siguientes:

Para quinua :

48
de 797.2 ppm de g tocoferol y 721.4 ppm de a tocoferol

Para kañiwa:

788.4 ppm de g y 726 ppm de a tocoferol.

Los tocoferoles existen en la naturaleza como cuatro diferentes


isómeros cuyo poder antioxidante en orden en el aceite es de : d
> g > b > a , siendo ligeramente superior la concentración de g
tocoferol en los aceites obtenidos, si lo comparamos con el maíz
que tiene 251 ppm de a tocoferol y 558 ppm, de g tocoferol , el
contenido en aceite de quinua y kañiwa es mayor,
garantizándonos mayor tiempo de conservación por el poder
antioxidante del g tocoferol.

Por otro lado tenemos el contenido de a tocoferol que tiene


mayor poder como vitamina E siendo esta vitamina el mejor
antioxidante a nivel de membranas en las células y protege los
ácidos grasos de las membranas de los daños causados por los
radicales libres. Los radicales libres son moléculas inestables
que tienen un electrón no apareado, el cual lo hace altamente
energizado y reactivo, estos buscan a otros electrones,
provocando reacciones en cadena que dañan las células y al
DNA, hasta que ellos regresan a su estado estable.[13]

49
Cromatograma obtenido en la determinación de a y g
tocoferoles por HPLC en el aceite de kañiwa

Cromatograma obtenido en la determinación de a y g


tocoferoles por HPLC en el aceite de quinua

50
Cromatograma estándar en la determinación de a y g
tocoferoles por HPLC

51
CONCLUSIONES

 Una de las principales ventaja de esta técnica frente a


otras metodologías analíticas clásicas es su especificidad,
permitiendo la separación, identificación y cuantificación
de los componentes orgánicos más complejos.

 La HPLC analítica ha adquirido una especial importancia en


el campo de la investigación y desarrollo científico,
encargándose del control de calidad farmacéutico y el
análisis medioambiental.

 Concluimos que unas de las características más


resaltantes del HPLC es su alta resolución, su
reproducibilidad, alta velocidad, y la capacidad de
automatización que presentan; lo cual la hace ser una de
las técnicas más empleadas en el análisis de diversas
formulaciones cosméticas y alimentarias.

52
REFERENCIAS BIBLIOGRÁFICAS

[1] “Depósito de disolvente”.


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//www.lcresources.com/resources/getstart/2a01.htm&prev=/translate_
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instrumentation%26sl%3Des%26tl%3Den&rurl=translate.google.com.
pe&usg=ALkJrhj0rVVKI5Fs6qwr0H92LzoeGMZvFA> [Consulta: 28 de junio
del 2009]

[2] “Bomba HPLC”. 22 de Febrero del 2009.


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2009]

[3] “Puerto de inyección”. 21 de Marzo 2006.


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//kerouac.pharm.uky.edu/asrg/hplc/injectors.html&prev=/translate_s%
3Fhl%3Des%26q%3Dhplc%2Binstrumentacion%26tq%3DHPLC%2Bins
trumentation%26sl%3Des%26tl%3Den&rurl=translate.google.com.pe
&usg=ALkJrhgTu7wUGOcbJuMDjrFhjB-RNWsj-A >.[Consulta: 27 de junio del
2009]

[4] “Columna HPLC”. 30 de Diciembre 2005.


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es&u=http://guide2make.com/Basics-HPLC-
Instrumentation.htm&prev=/translate_s%3Fhl%3Des%26q%3Dhplc%
2Binstrumentacion%26tq%3DHPLC%2Binstrumentation%26sl%3Des
%26tl%3Den>.[Consulta: 27 junio del 2009]

[5] “Detectores de HPLC”. 18 de julio 2008.


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2009]

53
[6] “HPLC Data Systems”. 16 de Abril 2008.
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2009]

[7] Nutiinfo.com “Vitamina A en pigmentos vegetales”a fuente


de información confiable. [En línia]
[http://www.nutrinfo.com/pagina/info/vita0.html]. 20-05-2000

[8] Pérez Calderón, Ruth. “Estudio de Validación de la


Metodología para la Determinación de Vitamina A en
Alimentos Infantiles Instantáneos por Cromatografía Líquida
De Alto Rendimiento (HPLC)”. Revista Peruana de Medicina
Experimental y Salud Pública. Instituto Nacional de Salud (Perú)
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[http://redalyc.uaemex.mx/redalyc/html/363/36317406/36317406.htm
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[9] Beck, Cristina Soledad; Ibarra, Ariana. “Cromatografía líquida


de alta performance”. Soledad Ibarra, Ariana, 2006.
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[10] Villegas V., L. F.; Sing de Ugaz, O. L.(eds.). “Análisis comparativo


por CCD y HPLC de alcaloides presentes en productos comerciales a
base de "Uña de gato" ”. Primera reunión internacional del
género Uncaria "Uña de gato". Iquitos (Perú). 2001. p. 114 - 121.

[11] PRIMO, E. 1997 Química de los Alimentos. Madrid: Edit.


Síntesis S.A España, 1994. p. 154-156.

[12] DECKER, E. and ZHIMIN X. 1998 Minimizing Rancidity in


Muscle Foods. Food Technology. Vol. 52 No. 10. USA.. p 210-214

[13] Clara Raquel Espinoza Silva, Ritva Repo Carrasco Valencia, &.S-
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De Quinua (Chenopodiun Quinoa) Y Kañiwa (Chenopodium
Pallidicaule)”. Organización de Las Naciones Unidas para La
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