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HPLC. Aplicaciones en compuestos orgánicos

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Trabajo realizado por mi grupo de laboratorio.
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06/25/2015

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UNIVERSIDAD NACIONAL MAYOR DE SAN MARCOS

(Universidad del Perú, DECANA DE AMÉRICA) FACULTAD DE FARMACIA Y BIOQUÍMICA
E.A.P. DE FARMACIA Y BIOQUÍMICA

♣ Departamento Académico de Química Básica y Aplicada ♣ Docente : MG Américo Jorge Castro Luna ♣ Curso: Química Orgánica II

Monografía: Cromatografía líquida de alta (HPLC). Aplicación en compuestos orgánicos

presión

♣ Grupo de laboratorio : Viernes ♣ Mesa: 5 ♣ Integrantes : ♣ Gonzalo Aire, Gabriel ♣ Murga Sulca, Jhonatan Antonio ♣ Pérez Guerreo, Fiorella Yahaira

/ 08040051 / / / 08040101 08040106 08040064

Quispe Ollero, Elías

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“Todos hacemos uno, todos hacemos bioquímica, pero somos pocos los que la practicamos….”

La cooperación es la convicción plena de que nadie puede llegar a la meta si no llegan todos.

Obviamente, nadie reconoce ser o haber sido un bioquímico. Sin embargo, estamos seguros gracias a los documentos supervivientes de los grandes pioneros Jesucristo (Cuando convirtió agua en vino) Da Vinci (Mezcló agua y azúcar cuando hacía te) 2

RESUMEN
Este trabajo tiene como objetivo fundamental, la aplicación de la Cromatografía Líquida de Alta Presión (HPLC) en compuestos orgánicos, una metodología que permite la separación, identificación y cuantificación de los compuestos orgánicos más complejos. Para lograr el objetivo planteado, la metodología utiliza la información aportada por un conjunto de revistas y libros científicos. En cuanto al análisis de la información, se fundamenta en principio que la cromatografía es un método físico de separación basado en la distribución de los componentes de una mezcla entre dos fases inmiscibles, una fija o estacionaria y otra móvil; mientras que por otro lado la cromatografía líquida consta de una fase móvil que es un líquido que fluye a través de una columna que contiene a la fase fija. Con el objeto de aumentar la eficiencia en las separaciones, el tamaño de las partículas de fase fija se fue disminuyendo hasta el tamaño de los micrones, lo cual generó la necesidad de utilizar altas presiones para lograr que fluya la fase móvil. De esta manera, nació la técnica de cromatografía líquida de alta resolución o alta presión (HPLC). Dependiendo del tipo de fase fija y del tipo de fenómeno físico que provoca la separación, la cromatografía líquida de alta resolución puede ser: Cromatografía de adsorción, Cromatografía de reparto, Cromatografía iónica, Cromatografía de exclusión por tamaño. Finalmente, se hace mención a la instrumentación que constituye la Cromatografía Liquida de Alta Presión y se hacen sugerencias para su correcto empleo en otras investigaciones similares que se realicen en el futuro.

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Palabras

Cromatografía Líquida de Alta Presión, orgánicos, fases inmiscibles, fase fija, fase móvil, cromatografía líquida, micrones, Cromatografía de adsorción, Cromatografía de reparto, Cromatografía iónica, Cromatografía de exclusión.

clave:

SUMMARY
This work has as fundamental aim(lens), the application of Alta Presión's Liquid Chromatography (HPLC) in organic compounds, a methodology that allows the separation, identification and quantification of them composed organic more complexes. To achieve the raised aim(lens), the methodology uses the information contributed by a set of magazines and scientific books. As for the analysis of the information, there is based at first(in principle) that the chromatography is a physical method of separation based on the distribution of the components of a mixture(mixing) between(among) two immiscible phases, a hinge or stationary and mobile other one; whereas on the other hand the liquid chromatography is clear of a mobile phase that it is a liquid that flows across a column that it(he,she) contains to the fixed phase. In order to increase the efficiency in the separations, the size of the particles of fixed phase was diminished up to the size of the microns, which generated the need to use discharges press to achieve that the mobile phase flows. Hereby, there was born the technology(skill) of liquid chromatography of high resolution or high pressure (HPLC). Depending on the type of fixed phase and of the type of physical phenomenon that provokes the separation, the liquid chromatography of high resolution can be: Chromatography of adsorption, Chromatography of distribution, ionic Chromatography, Chromatography of exclusion for size. Finally, there is mentioned the instrumentaria that constitutes the Chromatography Liquidates of Alta Presión and suggestions are done for

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his(her,your) correct employment in other similar investigations(researches) that are realized in the future.

Keywords:

Alta Presión's Liquid Chromatography, organic, immiscible phases, phase fixes, mobile phase, liquid chromatography, microns, Chromatography of adsorption, Chromatography of distribution, ionic Chromatography, Chromatography of exclusion.

ÍNDICE

♣ ♣ ♣ ♣ ♣ ♣ ♣ ♣ ♣

Leyenda…………………………………………………………….Pág. 2 Resumen…………………………………………………………Pág 3 Palabras Claves …………………………………………………. Pág 3 Summary………………………………………………………. Pág. 4 Keywords ……………………………………………………. Pág. 4 Introducción ……………………………………………………Págs.6 - 7 Objetivos……………………………………………………..Pág. 8 Marco teórico ……………………………….……………….Págs. 9- 45 Conclusiones …………………………………..………………Pág. 46 Bibliografía………………………………………………… Págs. 47-48

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INTRODUCCIÓN
La cromatografía es una técnica que permite separar, aislar e identificar los componentes de una mezcla de compuestos químicos. La muestra es distribuida entre dos fases inmiscibles (sólida, líquida o gas), una estacionaria y otra móvil, que se mueven una con respecto de la otra manteniendo un contacto íntimo, de tal forma que cada uno de los componentes de la mezcla es selectivamente retenido por la fase estacionaria. Los componentes de la mezcla a separar invierten un tiempo diferente en recorrer cada una de las fases, con lo que se produce la separación. Si un componente está la mayor parte del tiempo en la fase móvil el producto se mueve rápidamente, mientras que si se encuentra la mayor parte en la fase estacionaria, el producto queda retenido y su salida es mucho más lenta. La separación se lleva a efecto en una columna tubular rellena de un sólido poroso finamente dividido, el cual puede actuar como fase estacionaria propiamente dicha como soporte de una fase estacionaria líquida. También se puede efectuar utilizando como fases estacionaria papel de filtro o un sólido finamente dividido colocado en forma de capa fina sobre una placa de vidrio. Estos tres tipos de cromatografía se basan en los mismos principios fundamentales, y se conocen respectivamente como cromatografía en columna, en papel y de capa fina. En esta cromatografía solo se considerará la cromatografía en columna.

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La cromatografía es un proceso de separación muy común en ingeniería química y bioquímica. Es un procedimiento altamente selectivo, capaz de distinguir y separar componentes con características físicas y químicas muy similares. Esta técnica se considera importante tanto a nivel de producción como de análisis. Desde el siglo pasado las separaciones analíticas se llevaban a cabo por métodos clásicos como son la precipitación, destilación y extracción. Los crecientes esfuerzos por conocer más sobre la composición y la función de las proteínas han obligado a los científicos a buscar técnicas, cada vez, más precisas. Para elegir una técnica de separación, además de tener en cuenta los criterios económicos y de accesibilidad, hay que atender a dos tipos de consideraciones: unas tienen que ver con las propiedades físicas y estructurales de las moléculas que se pretende separar, o de las características de la matriz en que se encuentran; otras se derivan de los objetivos del análisis (sensibilidad, resolución, tiempo de análisis, necesidad de una detección específica). El método de selección incluye los pasos necesarios para la obtención, preparación y posible fraccionamiento de la muestra, la aplicación de la técnica analítica adecuada y el tratamiento de los datos obtenidos. Las técnicas analíticas más empleadas en la actualidad pueden englobarse en dos grandes grupos: técnicas de separación y técnicas espectroscópicas. Las técnicas espectroscópicas proporcionan, para cada compuesto analizado, una información compleja, relacionada con sus características estructurales específicas, por otro lado las técnicas de separación se utilizan para resolver los componentes de una mezcla y la señal obtenida puede utilizarse con fines analíticos cuantitativos o cualitativos. Actualmente las separaciones analíticas se realizan fundamentalmente por cromatografía y electroforesis. La cromatografía no solo permite la separación de los componentes de una mezcla, sino también su identificación y cuantificación. Se pueden separar moléculas en función de sus cargas, tamaños y masas moleculares. También a través de la polaridad de sus enlaces, sus potenciales redox, etc. El análisis cualitativo está basado en la medida de parámetros cromatográficos (tiempos y volúmenes de retención) mientras que el análisis cuantitativo está basado

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en la medida de alturas o áreas de picos cromatográficos que se relacionan con la concentración. Los métodos cromatográficos se pueden clasificar según la forma en que la fase móvil y la fase estacionaria se pongan en contacto. Así en la cromatografía de columna, un tubo estrecho contiene la fase estacionaria a través de la cual se hace pasar la fase móvil por presión. En la cromatografía en plano, la fase estacionaria se fija sobre una placa plana o a los intersticios de un papel; en este caso la fase móvil se desplaza a través de la fase estacionaria por capilaridad o por gravedad. Las tres clases de cromatografía desde un ángulo más general son cromatografía de líquidos, cromatografía de gases y cromatografía de fluidos supercríticos. Como su nombre lo indica, la fase móvil en las tres técnicas son líquido, gas y fluido supercrítico respectivamente. En la cromatografía líquida, la fase móvil es un líquido que fluye a través de una columna que contiene a la fase fija. Solo la cromatografía de líquidos es la que puede llevarse acabo en columna o sobre superficies planas, por otra parte tanto la de gas como la de fluidos supercríticos están restringidas a los procedimientos en columna de tal manera que las paredes de la columna contienen la fase móvil. La técnica más usada es la cromatografía líquida de alta resolución (HPLC), por su sensibilidad, fácil adaptación a las determinaciones cuantitativas exactas, su idoneidad para la separación de especies no volátiles y su aplicación a sustancias de primordial interés en la industria, como son los aminoácidos, proteínas, ácidos nucleicos, hidrocarburos, carbohidratos, entre otros.

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OBJETIVOS

• • • •

Conocer los fundamentos teóricos básicos del HPLC. Conocer los componentes del sistema HPLC. Advertir los cuidados para el manejo del HPLC. Conocer al detalle sus diversas aplicaciones en compuestos orgánicos.

MARCO TEÓRICO
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Cromatografía Liquida de Alta Performance

ASPECTOS HISTORICOS DEL HPLC 10

Aunque procesos parecidos ocurren en la naturaleza cuando disoluciones pasan a través de arcilla, rocas, etc. La cromatografía como tal adquiere importancia cuando en 1850 el químico F.F.Runge, que trabajaba con tintas, descubrió que los cationes orgánicos se separaban por migración cuando se depositaba una disolución que los contenía sobre un material poroso, como el papel. En 1906 el botánico ruso Tswett utilizó la cromatografía en columna para separar extractos vegetales coloreados, y a este proceso le dio el nombre de cromatografía. Pero el mayor desarrollo se produce en 1930 con Lederer cuando consigue separar los colorantes de la yema de huevo. Posteriormente los químicos Khun, Kamer y Ruzucca desarrollan la cromatografía en el campo de la Química Orgánica e Inorgánica, y obtienen el premio Nobel por sus trabajos en 1937, 1938, 1939 respectivamente. A partir de 1940 los métodos cromatográficos adquieren extensión mundial de forma que en 1940 Tiselius divide los métodos cromatográficos en cromatografía por análisis frontal, desarrollo por elución y desarrollo por desplazamiento, obtuvo el premio Nobel por sus trabajos en 1948. Al mismo tiempo la cromatografía se aplicaba en el campo de la bioquímica, y así Martín consigue separar algunos aminoácidos acetilados. TIPOS DE CROMATOGRAFÍA ….. [9]

En la cromatografía en columna, la fase móvil puede ser un líquido o un gas, y según el caso se denominan respectivamente “cromatografía líquida” y “cromatografía de gases “. Esta fase móvil fluye a través del relleno de la columna, arrastrando los componentes de la mezcla, que son selectivamente retenidos por al fase estacionaria. EL flujo de la fase móvil se mantiene constante a través de todo el proceso y de esta manera se logra que cada componente de la mezcla sea eluído de la columna como un compuesto puro, disuelto en la fase móvil. A esta técnica se le llama “cromatografía de elusión”. De acuerdo con la naturaleza de las fases involucradas y con los FIG. 1 Métodos mecanismos de separación, es posible distinguir diferentes tipos de cromatográficos. CGS: cromatografía, como se indica en cromatografía gasla figura 1. sólido; CGL: cromatografía gaslíquido; CLS: cromatografía líquidosólido; CLL: cromatografía líquidolíquido; CFQU: cromatografía de fase químicamente unida; CII: cromatografía de intercambio iónico; CCF: cromatografía de 11 capa fina; CP: cromatografía de papel;

Cromatografía de gases y cromatografía líquida de alta presión.

Cromatografía liquida “clásica” y cromatografía liquida de alta performance La cromatografía liquida “clásica” se lleva acabo en una columna generalmente de vidrio, la cual esta rellena con la fase líquida. Luego de colocar la muestra en la parte superior, se hace fluir la fase móvil a través de la columna por efecto de la gravedad. Con el objeto de aumentar la eficiencia 12

en las separaciones, el tamaño de las partículas de fase fija se fue disminuyendo hasta el tamaño de los micrones, lo cual genero la necesidad de utilizar altas presión es para lograr que fluya la fase móvil. De esta manera, nació la técnica de cromatografía líquida de alta resolución (HPLC), que requiere de instrumental especial que permita trabajar con las altas presiones requeridas. Ver figura 2.

VENTAJAS Y DESVENTAJAS DE LA CROMATOGRAFÍA LÍQUIDA DE ALTA PRESIÓN

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Ventajas
-Velocidad de análisis -Alta resolución -Resultados cuantitativos -Buena sensibilidad -Automatización -Amplio espectro de aplicaciones

Desventajas
-Instrumentación costosa -Difícil análisis cualitativo -No existe detector universal y sensible -Elevado costo de operación -Experiencia indispensable

Con esta técnica es usual obtener separaciones en minutos e inclusive en algunos casos en segundos. Por lo tanto se requieren columnas de alta eficacia y sistemas de bombeo de alta presión, ya que separaciones rápidas requieren flujos rápidos de fase móvil y esto a su vez requiere presiones elevadas. Su alta resolución permite obtener y separar mezclas muy complejas; como algunos fluidos biológicos como la orina humana. Las muestras naturales son difíciles de manejar, pero con CII y programación de fase inmóvil la resolución es notable. Los métodos de HPLC proporcionan muy buena información de tipo cualitativo, efectuando análisis con precisión del 1%. Los detectores proporcionan buena sensibilidad y según el tipo de muestra suelen medir −9 hasta los 10 ng (nanogramos), otros más especializados pueden detectar cantidades muy pequeñas. Entre las ventajas de esta técnica, la más importante es la diversidad de sus aplicaciones tantos a compuestos orgánicos como inorgánicos. Las únicas muestras no susceptibles de poderse analizar con facilidad son las gaseosas. Mediante los instrumentos cromatográficos, la identificación de cada señal de la muestra a análisis se realiza comparando los tiempos de retención con valores previamente determinados y la cuantificación se obtiene mediante las áreas integradas de las señales de acuerdo con el método analítico seleccionado. Teniendo en cuenta sus limitaciones, el instrumental es costoso y representa inversión para los laboratorios. Otra limitación es la necesidad de que el 14

personal que utiliza estos métodos tenga experiencia para poder obtener provecho, lo cual requiere de 6 a 12 meses de experiencias para llegar a ser operador eficiente. CLASIFICACIÓN DE LA CROMATOGRAFÍA LÍQUIDA DE ALTA RESOLUCIÓN (HPLC) Dependiendo del tipo de fase fija y del tipo de fenómeno físico que provoca la separación, la cromatografía líquida de alta resolución puede ser: 1) Cromatografía de reparto o CLL Separa los solutos basándose en la solubilidad. Formada por CLL y CFQU. Estas técnicas se diferencian en la forma en que se retiene la fase estacionaria sobre las partículas del soporte relleno. En el segundo caso, la fase estacionaria se une químicamente a la superficie del soporte. Esta técnica actualmente es más usada debido a que la cromatografía CLL necesita de un recubrimiento periódico de las partículas del soporte debido a la pérdida de la fase estacionaria por disolución en la fase móvil. En general, los soportes para casi todos los rellenos de fases unidas químicamente se preparan con sílice rígida o composiciones donde la sílice es el elemento básico. Estos sólidos están formados por partículas mecánicamente resistentes, porosas y uniformes. Los rellenos de columna en la CFQU se clasifican como de fase inversa cuando el recubrimiento enlazado tiene carácter no polar, y de fase normal cuando el recubrimiento contiene grupos funcionales polares. Este mecanismo de separación se basa en la distinta solubilidad que presenta una molécula de la muestra en la fase móvil y en la fase estacionaria. De ahí que los compuestos más solubles en la fase estacionaria sean selectivamente retenidos por ella en tanto que los menos solubles son transportados más rápidamente por la fase móvil. Puede utilizarse en la separación de mezclas edulcorantes artificiales, antioxidantes, bebidas refrescantes entre otras. El inconveniente de esta técnica es la solubilidad de la fase estacionaria en la fase móvil y el deterioro de la columna. Esto se puede corregir saturando la fase móvil con la fase estacionaria por medio de una precolumna que contenga un alto porcentaje de fase estacionaria. O bien, utilizando materiales que contengan la fase estacionaria químicamente unida a la superficie de un soporte (a modo de material de relleno de la columna no suele ser empleada); esto evita la perdida de fase estacionara y hace innecesario el uso de precolumnas para saturar la fase móvil. Esta requiere un control cuidadoso de flujo y de la temperatura para poder identificar un compuesto determinado en función del tiempo de retención que es característico del compuesto determinado en las condiciones de flujo y temperaturas utilizadas. 15

2) Cromatografía de fase químicamente unida (CFQU) Esta técnica surgió como consecuencia de problemas asociados con la CLL. Dado que su fase estacionaria esta químicamente unida a la superficie de un soporte, la fase móvil difícilmente produce deterioro alguno en la columna. Si se varía la naturaleza de los grupos funcionales de la fase estacionaria es posible obtener diferentes tipos de selectividad. Dichos grupos pueden ser de naturaleza polar, como el grupo amino y el grupo nitrilo en el caso de la cromatografía de fase normal, o bien no polar como el grupo octilo, octadecilo, fenilo, etc.; en el caso de la cromatografía de fase inversa, ésta tiene innumerables aplicaciones. Su inconveniente es que en la cantidad de fase estacionaria que es posible unir a la superficie de un soporte (partículas de sílice), es limitada y como consecuencia los tamaños de muestra separados en esta columna son reducidos, por lo común menor de 1 mg. Este mecanismo de separación es complejo, cuyas características son similares a la de la CLL y es el más utilizado. 3) Cromatografía de adsorción o CLS Se basa en la afinidad de adsorción Es la forma clásica de la cromatografía de líquidos. Ha sufrido algunas transformaciones que la han convertido en un método importante de la HPLC. Las únicas fases que se utilizan en este tipo de cromatografía son la sílice y la alúmina, siendo la primera la preferida. Es adecuada para compuestos no polares probablemente con masas moleculares inferiores a 5000. Los métodos de la cromatografía de adsorción y reparto tienden a ser complementarios, aunque en algunos casos se superponen. En general la CLS es más adecuada para muestras que son solubles en disolventes no polares y por ello tienen solubilidad limitada en disoluciones acuosas que son las que se utilizan en cromatografía de reparto en fase inversa. En éste tipo de cromatografía también se pueden separar compuestos con diferentes grupos funcionales. Una característica particular de este método es su capacidad para diferenciar compuestos isómeros en mezclas. El mecanismo de separación de ésta, se basa en la competencia que existe entre las moléculas de la muestra y de la fase móvil o disolvente por ocupar los sitios activos en la superficie de un sólido (alúmina y gel de sílice). En conclusión, este tipo de cromatografía es muy útil y se aplica a moléculas de baja o media polaridad. 4) Cromatografía líquida por exclusión o CE

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Separa solutos según el peso molecular La cromatografía de exclusión, también llamada de filtración en gel o cromatografía de permeación en gel, se basa en la diferencia de penetración de las moléculas en los poros de la fase estacionaria debido a que la separación obtenida depende del tamaño de la molécula. El tiempo de retención es proporcional al peso molecular de los mismos, por lo que no es muy usada con los compuestos de alto peso molecular. Este tipo de separación por tamaño difiere de las demás técnicas de cromatografía en que no existen interacciones físicas o químicas entre el analito y la fase estacionaria. Es una técnica reproducible, escalable y rápida. La fase fija está formada por partículas de sílice que contienen una red uniforme de poros por los que pueden penetrar las moléculas de pequeño tamaño. Las moléculas de tamaño grande se excluyen totalmente y son eluidas en primer lugar, mientras que las de pequeño tamaño tienen acceso a todo el volumen poroso y son las últimas que se eluyen; de esto se deduce que el volumen disponible para las moléculas pequeñas es mayor que para las grandes. Por lo tanto las moléculas se eluyen por su tamaño decreciente. Los diferentes tipos de partículas usadas deben ser estables: mecánica y químicamente; tener bajo contenido en grupos iónicos, uniformidad de poro y tamaño. Hay diferentes tamaños de partícula para un gel: a menor tamaño mayor resolución y menor gasto en la columna. Esta técnica se emplea en la separación de proteínas de alimentos, determinación de glucosa y fructosa en zumos de fruta, etc. La columna se rellena de un gel, cuyos poros son de tamaño similar al tamaño de las moléculas de la muestra. Las moléculas pequeñas pueden penetrar dichos poros y quedan retenidas en tanto que las grandes no. Las columnas empleadas pueden ser muy largas (varios metros) y esto es especialmente cierto cuando se desea separar muestras cuyos pesos moleculares están distribuidos en intervalos muy amplios. Estas dos variantes en CE: la cromatografía de filtración, emplea materiales blandos; incapaces de resistir presiones mayores de 4 atm. y es muy aplicada en el estudio de los biopolímeros y en contraste; la cromatografía de permeación, emplea materiales de relleno semirígidos o rígidos, y que pueden resistir presiones muy elevadas. Ambas no implican mecanismos de separación diferentes y su división se debe a motivos puramente históricos. Aunque existen excepciones, la eficacia de las columnas de la CE es por lo general relativamente baja, por lo cual no es frecuente en esta técnica obtener la separación de compuestos individuales, sino más bien fracciones de un cierto intervalo de pesos moleculares. El mecanismo de separación es tal que el tiempo de retención es inversamente proporcional al volumen de las moléculas en la fase móvil y por lo tanto proporcional al peso molecular; las moléculas más pequeñas son las que son objeto de una mayor retención en la columna. 17

5) Cromatografía por intercambio iónico o CII Separa solutos según la carga iónica. Está basada en la atracción entre iones del soluto y puntos cargados que existen en la fase estacionaria. En el caso de intercambiadores aniónicos, grupos cargados positivamente en la fase estacionaria atraen aniones del soluto. Los intercambiadores catiónicos contienen puntos cargados negativamente que atraen cationes del soluto. Los intercambiadores iónicos se clasifican en ácidos o básicos, fuertes o débiles. Las resinas ácidas fuertes siguen ionizadas incluso en disoluciones muy ácidas, en cambio las resinas ácidas débiles se protonan a un pH próximo a 4 y pierden su capacidad de intercambio catiónico. Los grupos muy básicos de amonio cuaternario siguen siendo catiónicos a cualquier valor de pH. Los básicos débiles de amonio terciario se desprotonan en disoluciones moderadamente básicas y pierden entonces su capacidad. Las resinas de intercambio iónico tienen aplicación de estudios donde intervienen moléculas pequeñas (PM = 500) que pueden penetrar en los poros pequeños de la resina. Los intercambiadores iónicos de poliestireno son tan grandes que en las macromoléculas muy cargadas, como las proteínas, se pueden lanzar irreversiblemente a ellos. Los de celulosa y dextranos sirven para intercambio iónico de macromoléculas. Los geles de intercambio iónico se usan en el caso de moléculas grandes (proteínas y ácidos nucleicos). Cuando las separaciones exigen condiciones químicas fuertes se emplean intercambiadores iónicos inorgánicos. La separación por intercambio iónico se basa en la competencia entre la fase móvil y la muestra iónica por los sitios o grupos activos de una resina intercambiadora de iones. Este tipo de separación se aplica a compuestos de un intervalo de pesos moleculares muy amplio, y ejemplos característicos de éstos son los péptidos y los aminoácidos. Las columnas son más largas que las empleadas en otro tipo de cromatografía, esto se basa en la baja eficiencia de los materiales intercambiadores de iones. La gran variabilidad de los métodos cromatográficos se debe a las diferentes condiciones que pueden utilizarse para separar los componentes de una sustancia. Todas estas técnicas tienen en común la existencia de una fase estacionaria a través de la cual fluye una fase móvil, así como la presencia de un mecanismo de inyección de la muestra y un mecanismo de detección de los diferentes componentes separados.

INSTRUMENTACIÓN

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• • • • • •

Depósito de disolvente Bomba Puerto de inyección Columna Detector Sistema de Adquisición de Datos

1. Depósito de disolvente … [1] Los Pantanos de disolvente se utilizan para almacenar a la fase móvil. Las botellas Scott Duran son comúnmente utilizados como depósitos de disolvente. El depósito de disolvente debe ser de material inerte como el vidrio y debe ser lisa, a fin de evitar el crecimiento de microorganismos en sus paredes. Puede ser transparente o de color ámbar puede ser. Un graduado botella da una estimación aproximada de la fase móvil por volumen de la botella. Disolvente embalses se encuentran situados por encima del sistema de HPLC (a un nivel más alto) en una bandeja. Ellos nunca deben ser directamente sobre el sistema como cualquier vertido de disolvente en el sistema puede dañar las piezas electrónicas. El depósito que mantiene la fase móvil a menudo no es más que una botella de vidrio. A menudo, el frasco de reactivos que posee nuestro disolvente HPLC puede ser utilizado como un depósito. Disolvente se entrega del depósito a la bomba por medio de tubos de teflón - denominada "línea de entrada" a la bomba. Algunos sistemas como el HPLC tienen compartimentos especiales para calibrar uno o más reservorios de fase móvil. Los depósitos en estos sistemas pueden tener funciones adicionales que permiten la fase móvil a desgasificar y aislados de contacto con el aire. Los requisitos para un depósito de disolvente son simples:

El embalse y su anexo a la bomba debe ser de materiales que no contaminan la fase móvil: teflón, vidrio o acero inoxidable. El buque debe tener algún tipo de tapa para evitar la contaminación de partículas de la fase móvil. Algunos sistemas de LC para esto como parte del diseño del embalse. Si está usando una botella de disolvente en un embalse, la parte superior de la botella puede ser envuelto en papel de aluminio para mantener el polvo o la tapa de la botella puede ser perforado para permitir la inserción de la línea de entrada a través de la tapa.

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No cierre la botella demasiado o eliminación de la fase móvil por la bomba va a crear un vacío. Esto evita que fluya la fase móvil de la bomba, la creación de un "bloqueo de vapor" en la bomba

Este "genérico" fase móvil embalse muestra el principio de los componentes de la reserva del módulo.

Ejemplos de depósitos de la fase móvil de gama estándar de laboratorio, tales como vasos o frascos cubiertos con papel de aluminio a través de los buques más grandes, tales como los medios de comunicación botellas, jarras disolvente, o Bombonas, a fin de fabricación de vidrio que incluye-en disposición de agitación y de desgasificación. 2. Bomba HPLC … [2] Clásica en la cromatografía de columna abierta, la fase móvil fluye a través de la cama de la columna de embalaje a causa de la gravedad. Esto funciona (apenas) con partículas de gran tamaño envases (de partículas más grande que el diámetro 50-100 micras o menos), pero la separación veces puede ser muy largo. Con el fin de reducir la separación del tiempo y permitiendo la utilización de envases de menor tamaño de partícula (10 micras y más adelante), hay que forzar el líquido fase móvil a través de la columna bajo presión. Esta es la función de la bomba (también llamado el "sistema de distribución del disolvente"): para mantener un flujo constante de fase móvil, independientemente de la presión (presión) causada por la resistencia al flujo de la columna empaquetada. La mayoría de las bombas de HPLC comerciales se basan en un diseño de pistones alternativos, como se muestra aquí. Un motor de levas empuja el pistón hacia atrás y hacia adelante en el cabezal. Un sello flexible alrededor de la periferia del pistón previene la fuga de la fase móvil en la parte posterior de la bomba. Comprobar válvulas montado en la cabeza se abren y se cierran en respuesta a pequeños cambios en la presión para mantener un flujo de disolvente. Cilindro de la bomba con sus válvulas de retención a menudo es accesible desde el exterior para facilitar la prestación de servicios a la comprobación y

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sustitución de válvulas de la bomba focas. Esta parte de la bomba, la bomba se llama cabeza.

Sección transversal de un simple diagrama de una sola bomba de pistones alternativos

Una sola operación de la bomba de pistón reciprocando.

El siguiente diagrama muestra cómo la bomba de flujo varía con el tiempo:

Durante la entrega de un accidente cerebrovascular, aumenta el flujo de cero hasta un máximo y luego disminuye de nuevo a cero. Durante la admisión, el flujo es cero. La presión en el interior de la bomba de los cambios de la misma manera que el flujo - al pasar de cero a un valor máximo, y luego quedarse en cero durante la ingesta de un accidente cerebrovascular. El tipo de flujo se muestra arriba, donde los cambios de la tasa de flujo durante el ciclo de bombeo, provoca pulsos de presión. Impulsos son indeseables por varias razones:

que causan problemas de detección

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• •

que impiden una buena análisis cuantitativo dan lugar a principios de la columna fracaso.

La mayoría de las diferencias en las bombas de diferentes fabricantes son modificaciones para dar mayor flujo uniforme. Un enfoque consiste en mantener el diseño de un solo pistón, pero para variar la forma de la leva y / o la velocidad del motor. Esto conduce a un cambio en el flujo como se muestra a la derecha. La forma de la leva lleva a una más plana la curva de flujo en el medio de la entrega de un accidente cerebrovascular. Además, el motor se acelera durante la admisión y se ralentiza durante la entrega de un accidente cerebrovascular. Algunos pulsación sigue siendo, sin embargo, estas bombas y con frecuencia usan alguna forma de "pulso de mojado" para reducir aún más el flujo de las fluctuaciones.

En forma de (no circulares) leva para reducir al mínimo los pulsos de presión.

Flujo de salida de una cámara con forma de bomba.
Otro enfoque común combina el flujo de salida de dos cabezas que operan 180 grados fuera de fase, de modo que la admisión de una cabeza de entrega coincide con el trazo de la segunda cabeza. Esto significa que, si bien es un cilindro de la bomba de llenado del cilindro, el segundo cilindro está cumpliendo la fase móvil. Entonces, cuando la segunda recarga, proporciona el primer cilindro. Podemos combinar estas dos corrientes de alimentación de salida de cada bomba en un té que se conecta con el sistema de CLAR. Ahora, el flujo combinado de ambos jefes ofrece una apariencia mucho más suave, menos el flujo pulsante de la LC sistema. La línea de entrada del depósito también se alimenta a un té que ambas ramas para alimentar a los cilindros de la bomba. Bomba de pulsaciones se puede reducir aún más especial por leva formas, variando la velocidad de la bomba de motor, y por el uso de amortiguadores de pulso.

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Otro enfoque para la reducción de la bomba de pulsaciones de mantenimiento de la bomba, mientras que el diseño es bastante simple pistón bomba Tándem. Un gran y un pequeño pistón / cilindro unidad se combinan para proporcionar el flujo continuo de fase móvil de la bomba. Si bien el gran pistón llena, el pequeño pistón ofrece. Cuando se llena el pequeño pistón, el gran pistón ofrece suficiente fase móvil a la vez llenar el pequeño pistón y proporcionar un flujo neto de la fase móvil a la LC sistema. Observe que

sólo tres válvulas de retención son necesarias para esta bomba y cuatro válvulas de retención para una convencional de dos bombas de pistones.

Un tándem-bomba a pistón proporciona un flujo continuo de salida.
La mayoría de las bombas de LC (incluso aquellos con múltiples cabezas) tienen algunas pulsaciones en el flujo de la bomba de salida. Esto es a menudo suavizadas por el uso de un amortiguador de impulsos. Estos dispositivos suelen consistir en una bobina de flexibles de acero inoxidable tubo. Cuando la presión sube (como resultado del flujo de pulsación), el tubo se extiende y aumenta su volumen de manera que el flujo adicional de la bomba en este momento está alojado por el extra volumen del pulso amortiguador. Cuando la presión disminuye, el volumen disminuye la tubería, con el extra de disolvente va a compensar el flujo de déficit. En efecto, el pulso actúa como un amortiguador hidráulico "amortiguador" para suavizar el flujo pulsante 3. Puerto de inyección .. [3] La muestra la introducción de dispositivos tales como inyector para introducir la muestra en un flujo de fase móvil a alta presión. No es posible utilizar la jeringa de inyección directa en la columna como la GC como la presión de entrada en LC es demasiado alta. La válvula de inyección fija o variable a través de bucle es una forma común de introducir la muestra. La válvula Rheodyne es el más utilizado concebir. El bucle puede ser parcial o 23

completamente lleno. Hay dos tipos de inyectores de la disposición. La ventaja de llenado parcial es la posibilidad de utilizar pequeñas cantidades de muestra, cuando hay escasez de la muestra. La precisión de la inyección es de 1% de RSD y de compensación de remanentes <1%.

Inyectores para la CLAR Las muestras se inyectan en el HPLC a través de un puerto de inyección. La inyección de un puerto CLAR comúnmente se compone de una válvula de inyección y la muestra de bucle. La muestra suele ser disuelto en la fase móvil antes de la inyección en bucle de la muestra. La muestra se estableció, en una jeringa y se inyecta en el bucle a través de la válvula de inyección. Una rotación del rotor de la válvula se cierra la válvula y se abre el bucle con el fin de inyectar la muestra en el flujo de la fase móvil. Volúmenes de circuito puede variar entre 10 μl a más de 500 μl. En los modernos sistemas de HPLC, la inyección de la muestra es típicamente automatizada. Parar el flujo de inyección es un método que la bomba está apagada inyección permitiendo que el puerto para alcanzar la presión atmosférica. La jeringa que contiene la muestra se inyecta en la válvula de la manera habitual, y la bomba está encendida. Para jeringa tipo y bombas de reciprocidad, el flujo en la columna pueden ser llevados a cero y se reanuda con rapidez por el desvío de la fase móvil por medio de una válvula de tres vías situada delante de la inyección. Este método puede ser usado hasta muy altas presiones 4. Columna HPLC … [4] Es el corazón del sistema cromatográfico, en ella se produce la retención de los diferentes compuestos que permite su separación.

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5. Tubos y Accesorios Hasta ahora no hemos hablado de la manguera y los accesorios que se conectan nuestros diversos módulos LC juntos. Para tubos de las conexiones entre el depósito y la bomba y del inyector, el único requisito es que los accesorios no de fugas, y que la tubería entre el depósito y la bomba de ser lo suficientemente grande en el diámetro para que el flujo de la fase móvil a la bomba no se limita. El tubo de conexión entre el inyector y la columna, y de la columna al detector, sin embargo, requieren más atención.

Las conexiones entre el depósito y la bomba se suele hacer con tubo de teflón, a menudo bastante amplio de la cavidad. Conexiones de abajo de la bomba son generalmente realizadas con acero inoxidable o PEEK (poli éter éter cetona) tubo. Conexiones entre el inyector y la columna-columnadetector debe hacerse de tubo de diámetro estrecho (0,010 "id o menos) con el fin de minimizar el volumen muerto. Esta parte del sistema de LC debe ser cuidadosamente diseñado y construidos para reducir al mínimo el volumen de la tubería y accesorios. Nosotros decimos que tenemos que eliminar el volumen muerto en la mayor medida posible. Así que tenemos que mantener el tubo de corta duración, y que por lo general el uso de tubos de diámetro muy estrecho: 0.010 pulgadas de diámetro interno (o "diez milésimas") es el tubo de tamaño normal para esta parte del sistema (tubos pequeños puedan ser necesarios para su uso

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con "microbore" columnas; tubos más grandes sólo deben utilizarse con preparativa columnas Hablemos acerca de los próximos accesorios utilizados en LC. Estos se denominan accesorios de compresión y su diseño se ilustra a continuación. Un pedazo de tubo es la primera equipada con un ferrul avellanas y como se muestra en la derecha. Para este fin de conectar el tubo con otro montaje (la columna final, una T, conector, etc) por primera vez, sólo tornillo en la tuerca de la instalación. Tenga cuidado de no a la instalación en exceso. Generalmente la tuerca debe apretarse dedo de la mano firme y, a continuación, un 3 / 4 de una vuelta (270 grados en sentido horario) con una llave. Al volver a una instalación existente (al cambiar las columnas, por ejemplo), la tuerca debe apretarse el dedo apretado y, a continuación, snugged ligeramente con una llave para evitar fugas.

Instalación estándar de compresión utilizada en HPLC.
Lamentablemente, no todas las piezas son intercambiables. Este es un gran dolor de cabeza para la mayoría de los trabajadores LC, pero tenemos que vivir con ella por el momento. Normalmente coincide piezas parecen funcionar, y esto hace la situación aún peor. Esto es, las piezas se parecen ir de la mano de la forma habitual. No obstante coincide accesorios no funciona correctamente. La razón es que la principal diferencia en estas instalaciones es la distancia entre el tubo y la virola final, como se muestra en la derecha.

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Nota la diferencia en la distancia desde la parte inferior de la virola hasta el final del tubo en estos tres extremos del tubo montado con los accesorios de diferentes fabricantes.

Los accesorios para los extremos de la columna son similares a tubos de accesorios. Una virola y tuerca en la columna celebrar la columna en el montaje final - al igual que la tubería se conecta juntos. Debido a que la columna está llena de pequeñas partículas de la columna de embalaje, es necesario tener una forma de mantener estas partículas en la columna. Esto se suele lograr con un fritas - un pequeño, moneda en forma de pieza de metal sinterizado tener estrechos poros. La mayor parte de las columnas fritas son nominalmente de 2 micras de porosidad, aunque más pequeñas fritas (0,5 micrones) se usan para las columnas de partículas muy pequeñas (3-micrones de diámetro).

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Si se desconecta la columna final del montaje, podemos ver las fritas en la parte superior de la columna. Este fritas pueden ser removidos y reemplazados con un nuevo fritas si se convierte en la antigua fritas conectado. Sin embargo, si hacemos esto, tenemos que ser muy cuidadoso. Si la columna de embalaje en la entrada se ve perturbado, podría arruinar la columna permanente.

6. Detectores de HPLC … [5]

El detector mide la concentración de la muestra, ya que bandas de la columna y dejar pasar por el detector de flujo de células. Cuando no es la banda que pasa por el detector, una constante de la señal se registra llamada la línea de base del cromatograma o detector. Cuando una muestra llega a la banda del detector, el detector responde a la diferencia en la fase móvil propiedades causados por la presencia de la muestra compuesta, dando lugar a un cambio en la señal del detector, considerado como un pico.

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¿Cómo funciona el Detector de trabajo? En la mayoría de los casos que vamos a utilizar un detector fotométrico, comúnmente llamado detector de UV. En su forma más simple, se trata de una fuente de luz, una celda de flujo (o "muestra de células"), y un sensor de luz, como se muestra en la derecha

Diagrama esquemático simplificado de un detector de UV. Cuando no se muestra fluye a través del detector, la luz pasa a través de la célula de flujo máximo y genera una señal en el sensor de luz. Si una muestra de la banda entra en el detector, la muestra se reduce la cantidad de luz alcance el sensor y provoca un cambio en la señal del detector. Esta señal está invertida electrónicamente por el sistema de datos resultante de la aparición de un pico en el cromatograma. La señal muestra aumenta en proporción a la concentración de la muestra en la celda de flujo. El detector también responder a otros cambios en el contenido de la celda de flujo. Por ejemplo, si las partículas o "polvo" se encuentran atrapados dentro de la celda de flujo, estos se interrumpa el paso de la luz a través de la célula de flujo y causa un cambio en la línea de base. O una burbuja de aire puede ser atrapado en la celda de flujo, causando un gran cambio en la cantidad de luz de paso. En este caso, la señal puede pasar completamente fuera de escala y, a continuación, volver a la base de referencia si la burbuja pasa a través de la célula.

Dos tipos de detectores de radiación UV se utilizan hoy en día:
• •

De longitud de onda variable (a veces llamado "espectrofotométrico" detectores de Fotodiodo Array (a veces simplemente llamada "red de diodos" detectores.

Los De longitud de onda variable detectores son menos costosos, son el tipo de detector de nivel de análisis cuantitativos y ensayos de rutina. Los de Fotodiodo gama son más versátiles, porque permiten la adquisición simultánea de ambos y de cromatografía de información espectral, que se utilizan habitualmente en el método de desarrollo. El detector de longitud de onda es una característica importante de una separación por HPLC. Como regla general, la longitud de onda se ajusta a la máxima absorbancia del analito. Uso de la longitud de onda equivocado

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puede resultar en disminución de tamaño de pico, o incluso no en todos los picos Debido a los diferentes compuestos pueden tener diferentes espectros de absorción, una comparación cuantitativa de los diferentes picos en el cromatograma mismo puede ser engañosa. Una pequeña cantidad de un compuesto que absorbe fuertemente en el detector de longitud de onda puede dar un pico más grande que una gran cantidad de una absorción deficiente. Cuantificación fiable, una calibración debe llevarse a cabo con un conocimiento exacto de la cantidad de compuestos que se van a analizar.

El Detector de rayos UV de longitud de onda variable utiliza un monocromador (aberturas y una rejilla) para seleccionar una longitud de onda de la luz para pasar a través de la muestra de células.

La matriz de detectores de fotodiodo pasa todas las longitudes de onda de la luz a través de la muestra de células y, a continuación, se centra cada longitud de onda en un único sensor de elemento.
Hay una serie de otros controles o ajustes para el detector, que pueden ser incorporadas en el propio detector, o pueden ser parte del sistema de datos: El tamaño de todos los picos en el cromatograma puede cambiarse usando el atenuador o ajustes de gama. La atenuación de la escala por lo general se refiere al tamaño de un pico que aparecerá como un pico de escala completa en la pantalla. Esta escala se mide en unidades de absorbancia (que es proporcional a la concentración de la muestra), que se expresa a menudo

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como "Unidades de Absorbancia escala completa" (AUFS). La figura de la derecha ilustra el efecto de un cambio en la atenuación. Como el ajuste es el aumento de la atenuación (AUFS se reduce), se convierte en el detector más sensible, y todos los picos de aumento de tamaño En muchos sistemas, el rango o la atenuación se puede establecer ya sea en el detector o en el propio sistema de datos. Si la atenuación o la gama se encuentra en el sistema de datos, por lo general afecta sólo a la pantalla. No cambia la forma de cuantificación se lleva a cabo porque no cambia la información presentada en el sistema de datos. Si la atenuación o la gama se sitúa en el propio detector sin embargo, es posible que el gran tamaño de los picos puede superar las capacidades de los datos del sistema Otro ajuste es el detector de Base Cero (a veces llamado el "Cero offset"). Mover este ajuste (que se muestra a la derecha) se limita a desplazar la totalidad del cromatograma arriba o hacia abajo en la pantalla. Al igual que con la atenuación de configuración, si se ajusta el cero en el sistema de datos, que sólo afecta a la pantalla; cuantificación se mantiene sin cambios. Si la línea de base cero se cambia en el detector en sí, la integración puede verse comprometido si la base de referencia se compensa suficientemente bajo para enviar una señal de voltaje negativo a los datos del sistema (la mayoría de los sistemas de datos sólo puede tratar con señales de voltaje positivo).

Diversos tipos de detectores de HPLC Existen varios detectores disponibles en el mercado. Sin embargo detector UV-VIS, Foto-detector por red de diodos, detectores de fluorescencia, y Conducta métricas coulometric detector son más comúnmente utilizados. El nuevo detector de ELSD está demostrando ser importante detector, mientras que la MS como detector es sobresaliente.

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HPLC, de

Detector RI Universal

UV / VIS Selectiva

Fluor Selectiva

MS Selectiva 1 picogramo 10 Sí No

Respuesta Sensibilidad Rango lineal Flujo sensibles Temp. Sensible

4 microgramos 5 nanogramos 3 picogramo 10 Sí Sí 10 No No 10 No No

7. HPLC Data Systems .. [6] Un sistema de cromatografía de datos es básicamente un equipo que ejecuta software especializado diseñado para integrar y picos cromatográficos corresponden altura o área del pico a la cantidad de analito presente en la base de datos de calibración. En muchos casos, el software incluirá la base de datos y estadística adicional para mejorar la capacidad de análisis, el almacenamiento y la presentación de la información. En su forma más fundamental, un cromatograma es simplemente un registro de la parcela o una señal de tensión en función del tiempo. En un buen funcionamiento del detector de UV (por ejemplo), este voltaje es directamente proporcional a la absorbancia de los efluentes en el detector de celda. Detectores diferentes y su comparación Suponiendo que la cerveza tiene el derecho-Lambert, esta absorbancia será directamente proporcional a la concentración de la absorción de las especies (el analito), lo que significa que el cromatograma es (indirectamente) una parcela de muestra de la concentración frente al tiempo. Suponiendo que la fase móvil a través del detector de flujo es constante, el volumen de la fase móvil se bombea directamente proporcional al tiempo transcurrido. Por lo tanto, es el cromatograma (más indirectamente) una representación de la concentración frente al volumen. Medir el área bajo el pico asciende a medir el producto de la concentración veces el volumen, que es proporcional a la masa (o moles) del analito. El término "integración" se refiere al proceso de medición de la zona comprendida en virtud de un pico cromatográfico. Esto se logra mediante la adición de la tensión de las mediciones efectuadas en la igualdad de los intervalos de tiempo entre el inicio y el final de la cumbre, y luego restando una "corrección trapezoidal" para corregir el desplazamiento de la cromatografía de referencia a partir del verdadero cero de referencia, así como la deriva.

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APLICACIONES
La cromatografía líquida de alta presión a pesar de ser una técnica relativamente nueva, se cuenta que describe numerosas aplicaciones en la literatura química. En la mayoría de los casos, éstas consisten en determinaciones de sustancias cuyo análisis por otra técnica cromatográfica resulta muy difícil. Estos resultados comprenden:

 Compuestos iónicos: como aminoácidos, sales inorgánicas,

ácidos orgánicos, etc.  Compuestos de alto peso molecular: como polímeros, hidrocarburos polinucleares, productos naturales, etc.  Compuestos termolábiles y no volátiles: como vitaminas, pesticidas, esteroides, plastificantes, drogas y un producto muy grande de otros productos farmacéuticos.

En los problemas relacionados con la contaminación ambiental, la HPLC se utiliza para la contaminación de algunos pesticidas (insecticidas, larvicidas, hervicidas, etc.). También es posible la determinación de hidrocarburos aromáticos polinucleares que son contaminantes atmosféricos muy importantes

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En cromatografía líquida el análisis de compuestos vitamínicos es posible en corto tiempo. El análisis de medicamentos es también una aplicación muy interesante, la determinación de los componentes activos de una tableta analgésica. También el análisis de barbitúricos, anticonceptivos, etc. [9]
1. DETERMINACIÓN DE VITAMINA A EN ALIMENTOS

INFANTILES INSTANTÁNEOS POR CROMATOGRAFÍA LÍQUIDA DE ALTO RENDIMIENTO (HPLC)

INTRODUCCIÓN Con la finalidad de controlar la calidad de alimentos infantiles instantáneos se efectuó la validación de la metodología para la determinación de la vitamina A por cromatografía líquida de alto rendimiento (HPLC). Con los resultados obtenidos se demostró que el método en estudio es preciso, exacto, lineal y altamente sensible para ser utilizado en el control de calidad de dichos alimentos. Como sabemos la Vitamina A es el nombre genérico utilizado para describir al retinol, sus ésteres y los correspondientes isómeros. La vitamina A no es más que un alcohol poliénico isoprenoide que se conoce también con otros nombres como axeroftol, biosterol, vitamina antixeroftálmica y vitamina antiinfecciosa.

Vitamina A

 Del retinol derivan por oxidación el retinal y el ácido retinoico.  El 11-cis-retinal juega un papel decisivo en el proceso visual.
 En los vegetales y en algunos organismos marinos, encontramos a

la vitamina A como provitamina A en la forma de ß caroteno, pigmento amarillo constituido por dos moléculas de retinal unidas en el extremo aldehído de sus cadenas carbonadas.[7]

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Ácido B Caroteno Dentro de las principales funciones de la vitamina A encontramos la Retinoioo su intervención en el proceso de visión de la protección de la piel y retina. También participa en la elaboración de enzimas en el hígado y de hormonas sexuales y suprarrenales. El déficit de vitamina A produce ceguera nocturna, sequedad en los ojos y en la piel, y afecciones diversas de las mucosas. Mientras que por otro lado el exceso de este puede provocar alteraciones óseas y hemorragias en diversos tejidos.

La vitamina A se encuentra principalmente en productos lácteos, mantequilla, queso, huevos, carne, hígado y aceite de hígado de bacalao. Se destruye fácilmente por la acción de la luz, con temperaturas elevadas.

DETERMINACIÓN DE LA VITAMINA A Los método espectrofotométrico y fotométrico empleados en la determinación de la vitamina A están expuestos a interferencias de algunas sustancias como la presencia de los carotenos, derivados y productos de descomposición de la vitamina A que de alguna forma podrían absorber luz en la región ultravioleta o dar colores similares con los reactivos utilizados en la determinación fotométrica. Por ello estos métodos no son lo suficientemente específicos para determinar esta vitamina, agregado que la confiabilidad de sus resultados dependenderán del éxito en los pasos de purificación y los procedimientos de trabajo. En ese sentido, y buscando una óptima metodología de análisis, en el presente estudio se realizó la validación de la metodología por HPLC para la determinación de vitamina A contenida en alimentos infantiles instantáneos.

MATERIALES Y METODOS

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A. EQUIPO  Equipo de cromatografía líquida de alto rendimiento (HPLC),      

de marca Shimadzu, modelo LC10A. Inyector automático. Bomba con sistema de degasificación. Integrador o sistema de registro Software para el procesado de datos cromatográficos. Detector de arreglo de diodos (longitud de onda variable). Columna cromatográfica de acero inoxidable LC-18 para fase reversa (25 cm. x 4,6 mm de diámetro interno, 5mm de diámetro de partícula, con columna de cartucho C18 de marca Supelco)

B. CONDICIONES DE OPERACIÓN  Sistema isocrático  Flujo 1,2 mL/min  Volumen de inyección     

20ml Detección UV 242 nm Temperatura de horno Ambiente Tiempo de corrida 7 min Fase móvil: metanol al 100% grado HPLC.

C. REACTIVOS        

Metanol grado HPLC ( Merk) Estándar all-trans Retinol: Vitamina A (Sigma) Hexano p.a. (Merck) Etanol absoluto p.a. (Merk) Solución de hidróxido de potasio al 50% BHT ó Acido Ascórbico (antioxidantes) Agua tridestilada o grado HPLC Solución stock estándar de vitamina A: Se disolvieron 100 mg del estándar en 100 mL de etanol absoluto, con aproximadamente 0,002 g de BHT, y se guardó la solución en congelación (-20° C)

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D. PROCEDIMIENTO  Se pesaron 20 g de la muestra de alimento infantil un

 

recipiente de base plana y se adicionó 70 mL de etanol absoluto. Ambas mezclas se colocaron en los tubos de reflujo y se agitó hasta su ebullición con corriente de nitrógeno. Luego, se adicionó 20 mL de solución de KOH al 50% saponificando la mezcla por 30 minutos con agitación moderada. Antes de finalizar esta etapa se enjuagó el contenido con 50 mL de agua en 3 porciones. La solución se enfrió a temperatura ambiente y luego se filtró al vacío, colocándose rápidamente el contenido en un embudo de decantación de 250 mL al cual se le adicionó 50 mL de hexano p.a. para proceder a la extracción. Se agitó la mezcla por 20 segundos y al separarse se evidenció la formación de la fase orgánica (en la parte superior), el cual se transvasó a un balón de 250 mL de base redonda que contenía aproximadamente 0,5 g de BHT ó ácido ascórbico. Se efectuó dos veces más la extracción y se juntaron los extractos en el balón de 250 mL. Se evaporó a sequedad el solvente, haciendo uso de un rotavapor con baño de agua a 40°C. Se diluyó inmediatamente con metanol grado HPLC el residuo, y se llevó a volumen en un matraz volumétrico de 10 mL. Finalmente, se pasó la solución final por un filtro de 0,2mm, llenándolos en viales ámbar de 2 mL para colocarlos en el inyector del cromatógrafo.

E. CÁLCULOS

Concentración de Vitamina A ( mg/g ó ppm ) = Am x Cs x D As Wm

Donde: Am (Area del pico de vitamina A en la muestra) As (Area del pico de vitamina A en el estándar) Cs (Concentración de vitamina A en el estándar, mg/ml) D (Factor de dilución) Wm (Peso de la muestra, g)

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F. RESULTADOS

En la Figura 1 podemos observar los cromatogramas representativos de dos concentraciones (una mayor y otra menor) de vitamina A para la curva de calibración. El tiempo de retención de la vitamina A fue 3,91 ± 0,5 min., siendo el tiempo total de análisis para una muestra de 7 min. La respuesta de detección fue lineal en el rango de concentraciones de 5 – 15 mg/g (Figura 2), obteniéndose un coeficiente de correlación r=0,99. El límite de detección del método en base a la señal / ruido (S/N) fue de 0,06 mg/g y el límite de cuantificación de 0,58 mg/g. El perfil de la precisión que se obtuvo en 16 determinaciones por analista en dos días diferentes, fue: CV de repetibilidad de 3,09% para el analista A, y 2,25% para el analista B vs. en tanto, el método oficial de la AOAC (CV de 3,62%); el CV de reproducibilidad fue 2,70 % vs. el obtenido por el método oficial (de 9,72%). Los resultados de la precisión del sistema, basados en la variación del tiempo de retención, área y altura; se muestran en la Tabla 1. La recuperación obtenida fue de 97,98% Vs. la obtenida por el método oficial de la AOAC (de 98,8%).

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La especificidad del método se muestra en la Figura3, donde se observa la ausencia de interferencias debido a la adecuada extracción del analito, y además se muestra la comparación del espectro del estándar puro vs. el espectro del analito en la muestra.

G. DISCUSIÓN

Esta metodología propuesta para la determinación de la vitamina A por HPLC tiene la ventaja de que el tratamiento de la muestra se realiza en menos tiempo, en relación al método oficial de la AOAC 992.06 VitaminaA (Retinol) in Milk-Based Infant Formula. Además, la columna que se utiliza en el método propuesto (C18) es más comercial que la columna del método de la AOAC (ciano), ya que esta última trabaja en fase normal siendo, por tanto, más difícil de controlar y por la naturaleza no polar del extracto, se debe usar cromatografía en fase reversa. El tiempo de corrida en esta metodología es más corto (7 minutos), comparado con el método oficial que es de 10 minutos. Estas características contribuyen al menor costo del análisis. Es necesario tener presente que tanto la saponificación, la isomerización y la ruptura de la vitamina A son retardadas por la adición del antioxidante (ácido ascórbico) y el uso de nitrógeno, el cual interfiere con los agentes de oxidación presentes. Asimismo, el retinol y sus ésteres son rápidamente destruidos por la luz, el oxígeno y los ácidos,

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por lo que deben almacenarse en frascos ámbar o cubiertos con papel platino o su equivalente. La muestra y el extracto de la muestra deben protegerse de la luz y la oxidación, evitándose la luz solar directa y la luz brillante. La iluminación artificial es mejor proporcionada por tubos fluorescentes dorados ó equivalentes. En ciertos casos, las diferentes etapas en el procedimiento deberían realizarse en material de vidrio ámbar para prevenir la degradación. Dado que el calor también contribuye a la isomerización o a una posterior alteración de las vitaminas, debería evitarse el calor innecesario. Por lo tanto, debe tenerse cuidado que, por ejemplo, la evaporación de los solventes se realice lo más suave posible utilizando un evaporador rotatorio, con un buen control de la temperatura, un enfriamiento adecuado de los condensadores y un vacío óptimo. [8]

H. CONCLUSIÓN  De acuerdo a los resultados obtenidos, podemos concluir que

el Método de ensayo CENAN-DQ.ME.16: Método para la Determinación de Vitamina A (retinol) en alimentos infantiles instantáneos por HPLC es preciso, exacto, específico y sensible para los parámetros evaluados en este estudio, ya que se encuentran dentro de los rangos establecidos.

ALCALOIDES PRESENTES EN PRODUCTOS COMERCIALES A BASE DE “UÑA DE GATO”

2. ANALISIS COMPARATIVO POR CCD Y HPLC DE

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INTRODUCCIÓN En el presente trabajo se realizó el análisis comparativo de 10 muestras comerciales de “uña de gato”, por Cromatografía de Capa delgada (CCD) y por Cromatografía Líquida de Alta Resolución (HPLC), observándose la presencia de los alcaloides oxindólicos con el mismo perfil cromatográfico que la muestra patrón. Se determinó el contenido de alcaloides totales por HPLC comparando la concentración de alcaloides ingeridos por el usuario de acuerdo a las dosis recomendadas por los fabricantes. La Uncaria tomentosa (Willd) DC (Rubiaceae) conocida comúnmente como “uña de gato” al igual que la Uncaria guianenis contienen una diversidad de compuestos, incluyendo alcaloides tetracíclicos y pentacíclicos, glicósidos triterpénicos, esteroles, flavonoides y procianidinas. MATERIALES Y MÉTODOS Análisis por CCD     Diclorometano Cloroformo Acetato de etilo Cromatofolio de Silicagel 60 F254 (Merck) (20 x10)     Análisis por HPLC Agua Acetonitrilo Metanol Fosfato básico de potasio  Fosfato dibásico de sodio anhídrido

 Las muestras analizadas fueron adquiridas en el mercado local, y las contra muestras se depositaron en el laboratorio (M1 a M10, todas cápsulas excepto M7 que es comprimido).
 Los

estándares Mitrafilina, Peropodina e Isopteropodina fueron aislados en el laboratorio, su identidad y pureza fueron confirmadas por métodos cromatográficos (CCD, HPLC), comparadas con

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muestra de referencia, publicados.[10]

y

por

los

datos

PREPARACIÓN DE LA MUESTRA Análisis por CCD  Los productos comerciales deben estar previamente molido.  1g de cada producto comercial se humedece con NH4OH al 10%.  Extraer con 5ml de diclorometano.  Secar con Sulfato de sodio anhídrido.  Aplicar 25 ml de la muestra.  Los productos comerciales deben estar finamente molidos.  250mg del producto comercial fueron extraído por 5 veces con 5 ml del sistema extractante Metanol:Agua:Ácido clorhídrico 1.2 M (50:50:1) por sonificación durante 15 min.  Filtrar los extractos.  Combinar con 25 ml de la solución extractante.  Tomar una parte de la solución muestra y agregar con cuatro parte del buffer fosfato.

Análisis por HPLC CALIBRACIÓN 2.00 mg de isopteropodina estándar fue disuelto en 50 ml de Metanol, a partir de l cual se prepararon las soluciones diluidas en un rango de concentración de 0.5 a 20.00mg/ml. La curva de calibración se realizó por triplicado. Se observó linealidad de respuesta del detector en el rango mencionado, con un factor de correlación (R2) de 0.99827.
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MÉTODO ANALÍTICO

Análisis por CCD  Se llevó a cabo por comparación con los estándares Mitrafilina (MI), Isopteropodina (IP) y Pteropodina (P). El sistema de elusión fue CHCl3:EtOAc en las proporciones 8:2, 7:3, y 6:4; desarrollados en forma consecutiva. Se revelaron con la luz UV a 254 nm y reactivo de Dragendorff.

Análisis por HPLC  Fueron realizados e un equipo Merck – Hitachi, sistema HPLC LaChrom-700, equipado con un detector de arreglo de fotodiodos (Merck – Hitachi L – 7450 a). Para todas las
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separaciones se trabajó con una columna Ultrasphere ODS (Beckman, 150X4.6 mm, 4mm) y guarda – columna (ODS). La fase móvil consistió de Acetonitrilo(A) y de un buffer fosfato 10nM (B) ajustado a p H 7.0, en la longitud de detección a 245 nm

y fueron aplicado 20ml de cada muestra. Todas las separaciones se llevaron a 30ºC. Los picos fueron asignados por superposición con las muestras estándares y por comparación con los tiempos de retención y espectros UV.

RESULTADOS Análisis por CCD  Para el análisis por CCD, los cromatofolios fueron revelados por luz UV 254 nm y reactivo de Dragendorff. Con los sistemas de elusión se ha obtenidos muy buena resolución de los alcaloides Mitrafilina (Rf=0.35), Pteropodina (Rf=0.65) e Isopteropodina (Rf=0.74), permitiendo la identificación

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inequívoca de éstos por CCD. Análisis por HPLC
 Los

cromatogramas de una muestra de Uncaria tomentosa estándar y de una de las muestra analizadas (M6). Los alcaloides pudieron ser separados con una resolución no menor del 90% para la isopteropodina y el alcaloide 4, a una temperatura de 30ºC en un tiempo de 30min.

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 El límite de detección encontrado fue de 0.07 mg/ml para el compuesto estándar Isopteropodina.  Para la extracción de los alcaloides se ha evitado el uso de ácido-base, pues está comprobado que produce su isomerización. La extracción con solución extractante por 5 veces por sonificación cada vez, asegura una extracción total de los alcaloides

3. DETERMINACION DE TOCOFEROLES POR HPLC EN

ACEITE DE QUINUA (Chenopodiun quinoa) Y KAÑIWA (Chenopodium pallidicaule)

INTRODUCCIÓN

El siguiente trabajo tiene como investigación la caracterización de la fracción lipídica de la quinua y kañiwa. La quinua y la kañiwa, son cultivos andinos muy poco estudiados pero que sin embargo nos muestran que son alimentos ricos en proteínas con un buen balance aminoacídico. Con el objetivo de determinar el contenido de tocoferol en estos aceites se analizaron especialmente a y g tocoferoles. Los aceites vegetales son ricos en Vitamina E La forma mas abundante y potente de la Vitamina E es el alfa-tocoferol. El beta-tocoferol, ganma-tocoferol y delta-tocoferol tienen también poder vitamínico y se encuentran, junto con el alfatocoferol en los aceites vegetales. Los aceites más ricos en tocoferoles son los aceites de germen seguido del aceite de soya. Sus efectos en el hombre es el de disminuir la tasa de colesterol en la sangre [11] Entre los tocoferoles, el alfa-tocoferol tiene la actividad vitamínica E más elevada y la menor actividad antioxidante. Las actividades antioxidantes de otros tocoferoles en orden decreciente son: delta, beta o ganma, y alfa. La mezcla de isómeros del tocoferol como el alfa-tocoferol son aditivos para mejorar el efecto antioxidante en alimentos. [12] La cromatografía líquida de alta resolución (HPLC) ha sido empleada para determinar tocoferoles en los aceites vegetales. En los últimos años, la introducción de la cromatografía líquida de alta presión, juntamente con la detección por fluorescencia, permiten una determinación más precisa. MATERIALES Y METODOS
A. ESTANDARES 47

 Tocoferol

pureza 99.9% preparada a concentración de 40ppm en hexano.  Tocoferol pureza de 99.9 % preparada a concentración de 40ppm en hexano.

una una

B. MUESTRA  Aceite crudo de quinua  Aceite de kañiwa

C. CONDICIONES  Columna: C18 de fase reversa  El método consiste en una

gradiente isocrático siendo:

gradiente

lineal

y

   

Solvente A: Metanol Solvente B: Acetato de etilo Velocidad de flujo de la fase móvil: 1,5 mL/min Detector: Espectrómetro de Fluorescencia.

D. TECNICA ANALÍTICA  Los 5 ml de las muestras de aceite en 100 mL de hexano. E. RESULTADO

Los cromatogramas obtenidos durante la corrida por HPLC para el los aceites de quinua, kañiwa y el estándar se muestran en las figuras 1,2 y 3 respectivamente. De acuerdo a la concentración del estándar y a el área de los picos, las concentraciones de a y g tocoferol en cada uno de los aceites fueron los siguientes: Para quinua :

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de 797.2 ppm de g tocoferol y 721.4 ppm de a tocoferol

Para kañiwa: 788.4 ppm de g y 726 ppm de a tocoferol. Los tocoferoles existen en la naturaleza como cuatro diferentes isómeros cuyo poder antioxidante en orden en el aceite es de : d > g > b > a , siendo ligeramente superior la concentración de g tocoferol en los aceites obtenidos, si lo comparamos con el maíz que tiene 251 ppm de a tocoferol y 558 ppm, de g tocoferol , el contenido en aceite de quinua y kañiwa es mayor, garantizándonos mayor tiempo de conservación por el poder antioxidante del g tocoferol. Por otro lado tenemos el contenido de a tocoferol que tiene mayor poder como vitamina E siendo esta vitamina el mejor antioxidante a nivel de membranas en las células y protege los ácidos grasos de las membranas de los daños causados por los radicales libres. Los radicales libres son moléculas inestables que tienen un electrón no apareado, el cual lo hace altamente energizado y reactivo, estos buscan a otros electrones, provocando reacciones en cadena que dañan las células y al DNA, hasta que ellos regresan a su estado estable.[13]

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Cromatograma obtenido en la determinación de a y g tocoferoles por HPLC en el aceite de kañiwa

Cromatograma obtenido en la determinación de a y g tocoferoles por HPLC en el aceite de quinua

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Cromatograma estándar en la determinación de a y g tocoferoles por HPLC

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CONCLUSIONES

 Una de las principales ventaja de esta técnica frente a

otras metodologías analíticas clásicas es su especificidad, permitiendo la separación, identificación y cuantificación de los componentes orgánicos más complejos.
 La HPLC analítica ha adquirido una especial importancia en

el campo de la investigación y desarrollo científico, encargándose del control de calidad farmacéutico y el análisis medioambiental.

 Concluimos

que unas de las características más resaltantes del HPLC es su alta resolución, su reproducibilidad, alta velocidad, y la capacidad de automatización que presentan; lo cual la hace ser una de las técnicas más empleadas en el análisis de diversas formulaciones cosméticas y alimentarias.

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REFERENCIAS BIBLIOGRÁFICAS
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[11] PRIMO, E. 1997 Química de los Alimentos. Madrid: Edit.
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[12] DECKER, E. and ZHIMIN X. 1998 Minimizing Rancidity in
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[13] Clara Raquel Espinoza Silva, Ritva Repo Carrasco Valencia, &.SE. Jacobsen. “Determinación de Tocoferoles por HPLC En Aceite De Quinua (Chenopodiun Quinoa) Y Kañiwa (Chenopodium Pallidicaule)”. Organización de Las Naciones Unidas para La Agricultura y La Alimentación. Disponible en: <http://www.rlc.fao.org/es/agricultura/produ/cdrom/contenido/libro14/ cap5.9.htm.>[27/06/2009]

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